1、 本科畢業論文（設計）TP63基因多態性與肺癌易感性的研究學 院 廣東藥學院 專 業 預防醫學 年 級 2009級 學生姓名 黃科明 學 號 0902501261 指導教師 劉麗 2013年 1 月 誠 信 聲 明我聲明，所呈交的畢業論文（設計）是本人在老師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據我查證，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文（設計）中不包含其他人已經發表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。我承諾，論文（設計）中的所有內容均真實、可信。 畢業論文（設計）作者（簽名）： 年 月 日TP63基因多態性與肺癌易感性關系的研究【摘要】目的 探討T

2、P63基因rs4488809位點單核苷酸多態性與肺癌易感性的關系。方法：對525例肺癌患者與1699例健康正常者采用病例對照研究。結果：(1) 2檢驗顯示各種基因型在肺癌組和對照組中分布差異無統計學意義(2 =0.455，P=0.797)，兩組人群等位基因頻率差別無統計學意義（2 =0.271，P=0.60) (2)以TT基因型為參照，在調整性別、年齡和吸煙情況后，經logistic回歸分析，發現CC基因型與肺癌發病無統計學關聯(校正OR=0.90，95%CI 0.681.19，P=0.44)；攜帶CT基因型與攜帶CC基因型者聯合分析，發現（CT+CC）基因型與肺癌發病也無統計學關聯（校正OR

3、=0.98，95%CI 0.761.21，P=0.72）。(3)以突變基因型（CT+CC）而又不吸煙者為參照，在調整性別、年齡后，經logistic回歸分析,(CC+CT)基因型并吸煙者OR=1.16(95%CI 0.891.50)，野生純合基因型TT而不吸煙者OR=1.08(95%CI 0.781.51)，野生純合基因型TT并吸煙者OR=1.13(95%CI 0.801.58)，均沒有顯著增加患肺癌的風險。結論：TP63 rs4488809基因位點多態性與肺癌易感性無相關性，且基因位點多態性與吸煙不存在交互作用。【關鍵詞】TP63；基因多態性；肺癌易感性The study on the Po

4、lymorphism of TP63 Gene RS4488809and susceptibility to lung cancerAbstract Objective: To investigate the polymorphism of the TP63 gene rs4488809 and susceptibility to lung cancer. Methods: A case-control study was conducted included 525 lung cancer patients and 1699 control subjects. Results: (1) Th

5、e Chi-square tests showed there was no significant difference between the two groups(P>0.05).(2) For the TP63-rs4488809C/T polymorphism，individuals with CT and CC genotype were not correlated with lung cancer compared with T/T genotype after stratification analysis according to smoking.(3) After

6、stratification analysis according to smoking, it revealed that it was not associated significantly increased risk in smokers. Conclusion: TP63 gene rs4488809 polymorphism has no association with lung cancer.Keywords TP63；single nucleotide polymorphism；lung cancer susceptibility1 前言肺癌是中國最常見的惡性腫瘤，是病死率

7、最高的惡性腫瘤之一，患病率和發病率隨著環境污染及吸煙率的上升在世界上大多數國家逐年上升1。根據全國腫瘤防治辦公室的統計,肺癌已居我國男性惡性腫瘤發生率和死亡率的第一位,女性惡性腫瘤發生率的第二位和死亡率的第一位2。雖然科技的飛速發展極大地改變了醫學的面貌,但肺癌的診斷和治療依然不盡如人意,肺癌的發病率和死亡率較50年前增加了數十倍,且肺癌總的治愈率水平仍然低于15%。目前因為缺乏行之有效的肺癌篩查和早期診斷技術和方法,絕大多數患者就診時已屬晚期,失去了外科治療的指征。因此提高肺癌治療效果的關鍵在于注重肺癌的一級預防和早期診斷,篩查監測肺癌易感人群。肺癌的發生是一個多因素參與、多基因調控、多階段

8、發生的復雜過程。研究表明影響肺癌的危險因素有吸煙、環境污染、職業、病毒感染、遺傳背景、營養、微量元素缺乏等。其中吸煙、環境污染已被公認為是肺癌的最重要的危險因素。然而,肺癌患者80%90%與吸煙有關,但只有不到20%的吸煙者患肺癌3,因此,個體患肺癌并非單純取決于吸煙或環境污染,主要取決于外在因素和基因,即基因與環境之間的相互作用，也就是說，肺癌在很大程度上還取決于個體的遺傳易感性4。TP63是近年發現的TP53家族成員之一5，TP63基因位于染色體3q2q29區，包含15個外顯子和2個啟動子(啟動子分別位于外顯子1和內含子3)。TP63在細胞中存在有多種異構體，包括至少6種主要的TP63蛋白

9、的異構體。由于TP63具有2個不同啟動子和多種內含子剪接方式，導致TP63基因編碼產生不同亞型的TP63蛋白，故這些異構體可分成兩大類：從外顯子1開始轉錄的具有反式激活區的異構體稱為TA異構體；從另一個位于外顯子3和4之問的外顯子3開始轉錄的沒有反式激活區的異構體稱為N異構體。N異構體由于3端剪切方式不同而產生3種不同C末端的異構體，因此再分、和亞型，其中異構體為全長的異構體，異構體為剪切掉外顯子13的異構體，異構體為剪切掉外顯子1114的異構體6。由上游啟動子引發的轉錄，可產生具有轉錄激活區(TA)的全長TP63同源異構體TAp63、TAp63、TAp63,由下游啟動子開始的轉錄則產生缺失轉

10、錄激活區的N端被截短的異構體Np63、Np63和Np63。較長TA異構體具有和TP53相似的功能，起著腫瘤抑制因子的作用，而較短N異構體因其缺少了氨基端的片斷，從而丟失了抑制生長的轉錄激活功能，反而轉變成為促進細胞生長及存活的轉錄因子7，8，9。細胞通過調節產生不同比例的異構體，在細胞生長和分化的過程中進行快速、準確的調節。這些異構群分子在生物的發育、發生學中起著重要的作用,在細胞中TP63的TA異構體能抑制細胞的無限增殖，而N異構體會促進細胞的生長、存活和遷移，并可以拮抗TP53蛋白和TA異構體的功能，解除其抑制細胞生長及促進細胞調亡的作用。通過同樣的機制，N異構體會起到促進腫瘤細胞異常增殖

11、、存活和遷移作用10，11。本研究所探討的SNP位于TP63基因的第l內含子，正是編碼TAp63異構體的區域，所以它可能在TP63基因表達過程中發揮重要的調控作用。2材料與方法2.1研究對象 本研究包括肺癌患者525例和正常對照1669例。525例肺癌患者來自廣藥附屬醫院2009年到2013年1月間入院患者，其中男性360例（68.6%），女性165例（31.4%）。肺癌患者的納入標準：經臨床影像學和病理學檢查確診為肺癌，無性別、年齡、癌癥家族史和臨床分期的限制。排除標準包括曾經患有其他癌癥疾病史以及未知的放、化療病史者。1699例健康者則是與病例同時期募集于廣東藥學院附屬醫院的健康體檢人群，

12、其中男性1380例（82.7%），女性289例（17.3%）。正常健康者的納入標準：無傳染病史、慢性病史、腫瘤病史等。2.2 資料的收集對病例和對照研究對象采用相同的調查表收集以下信息：包括性別、年齡等人口學特征，生活方式（是否吸煙等）、既往疾病史、肺癌家族疾病史等。吸煙情況按以下標準：每日吸煙量超過1支并且持續半年以上或者戒煙少于1年者定義為吸煙者；每天吸煙少于1支、且短于1年者定義為非吸煙者；戒煙超過1年者定義為曾經吸煙者。2.3 血樣的采集在知情同意的情況下采集每位研究對象外周靜脈抗凝血1ml。病例血樣采集在接受腫瘤放化療之前進行。抗凝血采集完畢后放入負20度冰箱保存。2.4 基因組DN

13、A提取2.4.1試劑：天根試劑盒(CL，FG，PK，TB)，異丙醇，70乙醇(現配)2.4.2儀器：Eppendorf Centrifuge 5415 D 常溫離心機國華HH-42快速恒溫數顯水箱Eppendorf移液器(1ml、 100ul、 10 ul)及相應槍頭NANO DROP 1000 Spectrophotmeter微量紫外分光光度計Eppendorf Concentrator 5301 快速反應濃縮儀吸水紙EP管(2.0ml、1.5ml)廢液缸手套記號筆2.4.3實驗步驟血樣采用天根試劑盒(DP319-02)進行抽提，該試劑盒抽提DNA原理為溶液鹽析法，試劑盒內包括細胞裂解液CL

14、 2×250ml；緩沖液FG 120ml；蛋白酶K 1ml；緩沖液TB 60ml，基本操作步驟如下：圖1 鹽析法提取DNA流程圖(1) 將保存于-20。冰箱中的抗凝血取出，37。C水浴融解(2) 細胞裂解：1ml抗凝血加入1ml細胞裂解液，顛倒混勻100次后12000rpm/ref離心2分鐘，棄上清；再加入1.5ml細胞裂解液，快速顛倒混勻至無明顯細胞團塊后12000rpm/ref離心2分鐘，棄上清；(3) 蛋白酶消化：配制緩沖液FG和蛋白酶K混合液(兩者比例為100:1;見表1)；加入500mlFG和蛋白酶K混合液，立即渦旋混勻至溶液無團塊；65°C水浴25分鐘，期間顛倒

15、混勻數次；(4) 異丙醇沉淀(操作輕柔)：加入500ml異丙醇，緩慢顛倒混勻至出現絲狀基因組DNA；12000rpm/ref離心5分鐘，棄上清；(5) 12000rpm/ref離心2分鐘，棄上清。再次加入500ul 70乙醇，顛倒50次，離心 12000×2min。倒棄上清，將離心管倒置在干凈吸水紙上停留至少5分鐘。(6) DNA溶解：空氣干燥DNA沉淀至所有液體揮發干凈；加入200ul緩沖液TB，確保DNA漂浮于TB內。然后55°C水浴溶解DNA4小時后置于4°C冰箱過夜以繼續溶解；表1 不同體積血樣所需各種緩沖液用量(l)緩沖液血液體積(l)100300100

16、0300050001000020000細胞裂解液 CL25075025007500125002500050000緩沖液 FG5015050015002500500010000蛋白酶 K0.51.55152550100100%異丙醇501505001500250050001000070%乙醇5015050015002500500010000緩沖液TB10020020030050010001000FG和蛋白酶K混合液1030100300500100010002.5 SNP分型2.5.1 試劑TaqMan® Universal PCR Master Mix (2X)雙蒸水HEXFAMTaq

17、Man 引物TaqMan 探針TaqMan SNP Genotyping Assays2.5.2儀器NanoDrop 2000Eppendorf冷凍臺式離心機低速離心ABI 7900HTEppendorf移液器(1ml、 100ul、 10 ul)及相應槍頭384孔板2.5.3 TaqMan探針技術基本原理TaqMan探針法，也稱為熒光定量PCR，是一種高度特異的定量PCR技術，其基本原理是利用Taq酶的53外切核酸酶活性，切斷探針，以產生熒光信號。因為探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只

18、能與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5端標記有報告基團(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR反應的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其35外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號（圖2）。所以，每經過一個PCR循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。圖2 TaqMan基因分型原理圖。2.5.4 TaqM

19、an基因分型步驟(1)準備樣本：TaqMan基因分型DNA樣本的濃度要求為520ng/l，DNA提取完成 后使用紫外可見分光光度計(NanoDrop 2000)檢測DNA濃度，將DNA濃度稀釋至 520520ng/l。TaqMan基因分型引物和探針由上海基康公司合成(2)配置實驗體系：按照下表要求的實驗體系將引物和探針稀釋。將引物和探針 混合，配成10X Assay Mix，在混合的Assay Mix中加入雙蒸水，然后加入Taq- Man® Universal PCR Master Mix (2X)，混勻。(表2)表2 實驗體系加樣表試劑體積（ul） 雙蒸水 0.8 TaqMan&#

20、174; Universal PCR Master Mix（2X） 2.5 前向引物 TaqMan® 10X Assay Mix 0.225 后向引物 0.225 FAM 0.125 HEX 0.125 DNA模板 1.0 雙蒸水 0.8 總計 5.0(3)加樣：將混勻混合液分別加入到已經標記區域的384孔板中。加入稀釋好的 DNA模板。(4)離心：使用Eppendorf冷凍臺式離心機低速離心，使樣本置于384孔的底部。 貼膜，用壓膜板將膜壓平。(5)上樣：本實驗采用ABI 7900HT進行TaqMan基因分型，開機進行設置和熱循環，如表3所示：表3 PCR循環設置步驟溫度（）時間（

21、分鐘） 1 50 2:00 2 95 10:00 45個循環 3 93 0:30 4 62 1:00 5 4 (6)數據讀取：機器運行完畢后，取樣下機進行分型數據讀取，基因分型數據采用SDS2.3讀取數據。2.6 統計學分析應用SPSS 21.0軟件包對檢測結果進行統計學分析。(1)研究對象的基本人口學特征：采用雙側2檢驗比較性別、年齡、吸煙狀況、基因型及等位基因在肺癌組、對照組的頻率分布等。(2)Hardy-Weinberg平衡檢驗(HWE)：采用2檢驗來分析對照組中SNP基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。 (3)SNP位點分析：采用非條件logistic回歸分析基因多態性

22、與肺癌易感性間的關系，以比值比OR和95%Cl可信區間表示相對危險度，計算OR值及95%CI時，以性別、年齡、吸煙狀態作為協變量進行統計學校正。(4)分層分析：肺癌的發生是由基因和環境因素共同作用的結果，在其發展過程中存在著基因-環境之間的交互作用。特別是吸煙這個環境因素，對于肺癌的發生尤其重要。因此，我們通過分層分析，使用傳統的logistic回歸模型來探索基因-環境的交互作用與肺癌的關聯。3結果3.1 肺癌組與對照組的一般情況比較 本實驗入選對象共2194人，見表4，肺癌組(23.9%)與對照組(76.1%)在年齡、性別方面分布頻率差異具有統計學意義（P<0.05），在吸煙情況方面的

23、分布頻率無統計學差異。經檢驗，正常對照人群位點的基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明該樣本具有一定的代表性。表4 肺癌組與對照組一般情況的比較（n%）項目 肺癌組(n=525) 對照組(n=1669) P*年齡（歲）<6060性別男女吸煙情況有吸煙史無吸煙史241(45.90)284(54.10)360(68.57)165(31.43)240(45.71)285(54.29)602(36.07)1067(63.93)1380(82.68)289(17.32)846(50.69)823(49.31) <0.05 <0.05 0.047 * P值采用雙側卡方檢驗

24、。3.2 SNP位點基因型及等位基因與肺癌的關聯性分析在TP63基因rs4488809位點上，肺癌組中24.38%為TT,49.90%為CT，25.72%為CC；對照組中TT、CT和CC的基因型頻率分別為24.03%、48.77%、27.20%，見表5。2檢驗顯示各種基因型在肺癌組和對照組中分布差異無統計學意義(2=0.455，P=0.797)；而等位基因T在病例組與對照的頻率分別為49.33%和48.41%，等位基因C則分別為50.67%和51.59%，兩組人群等位基因頻率差別無統計學意義（2=0.271，P=0.60)。表5 基因型與等位基因在肺癌組與對照組中的頻率分布基因型及等位基因肺癌

25、組n(%)對照組n(%)2 P*基因型TTCTCC等位基因TC128(24.38)262(49.90)135(25.72)518(49.33)532(50.67)401(24.03)814(48.77)454(27.20)1616(48.41)1722(51.59)0.455 0.797 0.271 0.602* P值采用雙側卡方檢驗。3.3 TP63基因rs4488809多態性與肺癌易感性的關系TP63基因rs4488809多態性與肺癌易感性的關系如表6所示，以TT基因型為參照，在調整性別、年齡和吸煙情況后，經logistic回歸分析，發現CC基因型與肺癌發病無統計學關聯(校正OR=0.90

26、，95%CI 0.681.19，P=0.44)；攜帶CT基因型與攜帶CC基因型者聯合分析，發現（CT+CC）基因型與肺癌發病也無統計學關聯（校正OR=0.98，95%CI 0.761.21，P=0.72）。表6 TP63基因rs4488809多態性與肺癌易感性的關系基因型肺癌組n(%)對照組n(%)校正的OR* P*（95%CI）TTCTCCCT+CC128(24.38)262(49.90)135(25.72)397(75.62)401(24.03)814(48.77)454(27.20)1268(75.97)1.00(參照) 0.99(0.781.27) 0.970.90(0.681.19)

27、 0.440.96(0.761.21) 0.72 *風險度計算采用logistic回歸模型，OR值經過性別、年齡和吸煙情況校正； 代表無此項。3.4 TP63基因多態性和吸煙對肺癌危險的交互作用分析 應用分層的logistic回歸模型，分析TP63 rs4488809位點基因多態性與吸煙的作用，如表7所示。TP63基因rs4488809多態性與肺癌易感性關系分析的結果提示，等位基因C可能是保護效應。故在調整性別、年齡后，以攜帶（CT+CC）基因型而又不吸煙者為參照，（CT+CC）基因型并吸煙者OR=1.16(95%CI 0.891.50)，野生純合基因型TT而又不吸煙者OR=1.08(95%C

28、I 0.781.51)，野生純合基因型TT并吸煙者OR=1.13(95%CI 0.801.58)，均沒有顯著增加患肺癌的風險，故認為TP63基因rs4488809位點與吸煙不存在交互作用。表7 TP63基因多態性與吸煙的交互作用對肺癌患病風險的影響基因型非吸煙者 有吸煙史 病例/對照 OR*（95%CI） P*病例/對照 OR*（95%CI） P*CT+CCTT 221/64764/176 1.00（參照）1.08(0.781.51) 0.63176/62164/2251.16(0.891.50)1.13(0.801.58) 0.27 0.50* 風險度計算采用logistic回歸模型，以突變

29、基因型（CC+CT）且不吸煙者作為參照；OR值經性別、年齡校正； 代表無此項。 4 討論與結論4.1 討論肺癌是目前中國最常見的惡性腫瘤之一，而且其發病率有逐年增加的趨勢，嚴重影響人類的健康，然而其發病機制尚未完全闡明。目前較一致的觀點認為，肺癌的發生是環境危險因素和個體遺傳因素共同作用的結果。基因多態性是決定疾病易感性、表型和治療反應性差異的重要因素，在肺癌的發生、發展中起重要作用。本文通過病例對照研究，對TP63基因單核苷酸多態性與肺癌易感性的關系進行探討。 TP63作為TP53家族成員之一5，具有與TP53同源的DNA結合域。TP53腫瘤抑制基因在調控細胞周期和維持基因組穩定性方面具有至

30、關重要的作用12,13，其與多種腫瘤的發生發展密切相關，主要涉及到細胞周期、阻滯、凋亡、遺傳質完整性的保持、血管生成和細胞衰老的抑制14。同時TP53還可以和一些細胞內控制程序性死亡的蛋白結合,從而使該基因在腫瘤發生中起到抑制作用1520。而TP63是在細胞發生DNA損傷后誘導產生的21，DNA損傷的積聚及機體遺傳毒性應激反應的缺乏會導致腫瘤的發生。TP63在腫瘤發生中的作用目前仍不十分清楚，TP63的功能存在著比TP53更廣泛的多樣性。在某些類型的細胞中，TP63會像TP53那樣發揮抑制腫瘤生長的作用；而在另一些情況下，TP63卻會產生促進腫瘤生長的作用22,23。也有研究證明，TP63基因

31、位點在多種腫瘤中擴增而不是缺失，提示TP63在腫瘤發生中更多的是致癌而不是抑癌作用24。 本研究發現，與攜帶TT基因型相比，TP63基因rs4488809位點中的等位基因C與肺癌發病無統計學關聯（校正OR=0.98，95%CI 0.76-1.21，P=0.72），同時TP63基因rs4488809位點與吸煙之間并不存在交互作用（P>0.05）。但最近的一項在日本和韓國人群中進行的GWAS研究則顯示TP63基因區域中的rs4488809多態性與肺腺癌發生密切相關，提示TP63基因單核苷酸多態性可能是影響東亞人群肺腺癌發生的遺傳易感因素25。兩個實驗結果不一致的原因，可能是選擇不同肺癌細胞病

32、理類型以及研究人群的種族不同造成的。同時，由于本次研究中對照組并沒有按照年齡、性別與病例組頻數匹配，造成實驗結果有一定的局限性。因此關于TP63基因多態性與肺癌易感性的關系，還有待于進一步研究，如擴大樣本量，對不同種族人群、不同肺癌細胞病理類型進行分層研究，并結合功能研究來驗證TP63基因對肺癌的作用等。4.2 結論本實驗中采用病例對照研究方法分析TP63基因的rs4488809多態性與肺癌易感性之間的關系，結果表明TP63 rs4488809多態性與肺癌遺傳易感性無關。參考文獻1 Kurzepa-Hasan E, Hansan K, Adamek R. Tobacco smoking amo

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