1、老年性Bruch膜及視網(wǎng)膜色素上皮的脂類沉積【摘要】目的驗(yàn)證Bruch膜及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)脂類沉積與年齡的關(guān)系，以及老年性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)病眼的脂類沉積特點(diǎn)。方法應(yīng)用組織化學(xué)染色的方法，對(duì)32例尸體正常眼球(20天84歲)及2例尸體患AMD病眼進(jìn)行研究，檢測(cè)其Bruch膜及RPE中的脂類沉積。結(jié)果正常眼中Bruch膜中脂類沉積隨年齡增長(zhǎng)而增加，以中性脂類為主。黃斑區(qū)較周邊部顯著。RPE染色的強(qiáng)度和面積也與年齡有關(guān)。AMD眼脂類染色較正常老年眼更強(qiáng)烈，亦以黃斑部為著。

2、結(jié)論老年性Bruch膜與AMD眼有共同的區(qū)域性分布，可能在老年性改變及AMD的發(fā)展中有著重要作用。隨年齡增強(qiáng)的RPE脂類染色可能反映了細(xì)胞內(nèi)脂褐素的積聚。【關(guān)鍵詞】Bruch膜/病理學(xué)色素上皮，眼/病理學(xué)黃斑變性脂質(zhì)累積病染劑和染色法中國(guó)書資料分類法分類號(hào)R773R774.5R446.8Lipid deposition of senile Bruch?s membrane and retinal pigment epitheliumZHANG Yongjin,Grenham IRELAND,Mike BOULTON.Department of Ophthalmology,Eye and ENT

3、 Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200031，China【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between lipid deposition in the Bruch?s membrane and the retinal pigment epithelium(RPE)cells and age,and characteristics of lipid deposition in the age-related macular degeneration(AMD).Met

4、hodsThirty-two normal eyes from dead people aged 20 days to 84 years and 2 AMD eyes from corpses were examined by using histochemistry stains to identify characteristics of lipid deposition in the Bruch?s membrane and the retinal pigment epithelium(RPE)cells.ResultsIn the normal eyes,lipid depositio

5、n in the Bruch?s membrane increased with aging,especially in the macular region.The main composition of the lipid deposition was neutral lipid.AMD eyes were more intensively stained than normal aged eyes,especially in the macular region.ConclusionLipid deposition distributed in the same regions both

6、 in normal and AMD eyes in the elderly,which may play an important role in the aging process and the development of AMD.Stain ofRPEincreasing with aging may reflect the deposition of lipofuscin in the cells.【Key words】Bruch membranepathologyPigment epithelium of eye/pathologyMacular degenerationLipo

7、idosisStains and stainingBruch膜老年性碎屑(debris)的沉積被認(rèn)為在AMD的發(fā)展過(guò)程中有著重要作用1-6。早期研究表明，隨著年齡增長(zhǎng)，Bruch膜的嗜堿性和PAS染色增強(qiáng)7，推測(cè)可能與脂類成分的增加有關(guān)1，3，但當(dāng)時(shí)難以得到直接證據(jù)。近年來(lái)，隨著組織化學(xué)和生化技術(shù)的提高，這種推測(cè)已得到證實(shí)3。脂類的增加可能改變Bruch膜的擴(kuò)散性能，而導(dǎo)致AMD1-6，8。此研究將進(jìn)一步驗(yàn)證Bruch膜脂類沉積的特點(diǎn)及脂類性質(zhì)，比較脂類沉積的區(qū)域性特點(diǎn)及AMD眼與正常眼老年性改變的脂類沉積特點(diǎn)。1材料與方法32例正常人及2例AMD患者尸體眼球由英國(guó)曼徹斯特皇家眼科醫(yī)院眼庫(kù)或美

8、國(guó)費(fèi)城國(guó)家疾病研究交流中心提供。正常眼無(wú)臨床眼病及明顯的顯微鏡下的病理改變，供眼者的年齡范圍為20天84歲，分為三個(gè)年齡組：年輕組：10例(20天28歲)；中年組：8例(3160歲)；老年組：14例(6184歲)。2例AMD眼的臨床類型不明，年齡為67及80歲。經(jīng)10%中性福爾馬林固定的眼球，去除眼前段及玻璃體及視網(wǎng)膜后，分離出以黃斑區(qū)為中心的6mm7mm矩形組織塊，作為黃斑區(qū)標(biāo)本；周邊標(biāo)本(6mm4mm)取自距中心凹10mm的顳側(cè)周邊部。標(biāo)本組織塊包埋于Tissue-Tek OCT復(fù)合物(Sigma)中，經(jīng)液氮冷凍后，切制成7m厚的組織切片。三種組織化學(xué)染色方法用來(lái)鑒別脂類成分：油紅(oil

9、 red O)用來(lái)識(shí)別中性脂；溴-蘇丹黑B(bromine Sudan black B)使所有類型的脂類著色；而溴-丙酮-蘇丹黑B(bromine-acetone-Sudan black B)，在丙酮將其他脂類溶解去除后，鑒別出不溶于丙酮的磷脂。陰性對(duì)照采用脂溶劑(12氯仿及甲醇混合液含1%HCl)處理后的組織切片9。脂類染色方法同文獻(xiàn)所述1，2，9。染色程度分為4級(jí)：陰性，不超過(guò)背景染色；輕度染色；中度染色；重度染色。由兩名研究者通過(guò)“雙盲檢查”決定，遇有意見(jiàn)分歧時(shí)，協(xié)商解決。2結(jié)果油紅染色陽(yáng)性的組織切片中，Bruch膜呈紅色。經(jīng)脂溶劑處理后，Bruch膜染色呈陰性。年輕組中染色幾乎均表現(xiàn)陰

10、性(1)，僅一例28歲眼Bruch膜呈細(xì)線狀輕度染色(2)；隨年齡增長(zhǎng)，Bruch膜的油紅染色帶加寬，染色增強(qiáng)(3，4)。中年組，大多數(shù)眼呈輕度染色；老年組的染色均為中度及重度，Bruch膜呈均勻一致的帶狀染色，脈絡(luò)膜的毛細(xì)血管間柱(intercapillary pillars)也有著色(3)。RPE染色程度及面積，亦隨著年齡增長(zhǎng)而增加。20天，5個(gè)月及2歲齡眼中，黑色素顆粒遍布整個(gè)RPE細(xì)胞，而無(wú)染色(1)；RPE染色最初見(jiàn)一位8歲患者供眼，呈輕度，局限于細(xì)胞基底部；老年眼染色可占細(xì)胞總面積的2/3，且染色程度不受脂溶劑的影響，黑色素顆粒則逐漸減少至局限于細(xì)胞頂部(3)。同一眼中，黃斑部Br

11、uch膜及RPE細(xì)胞染色較周邊部強(qiáng)。AMD眼中，Bruch膜重度染色，玻璃疣及基底層狀沉著(basal laminar deposits)均強(qiáng)烈染色；RPE細(xì)胞染色遍布細(xì)胞漿(5)。12歲眼油紅染色冰凍組織切片顯微照片。Bruch膜(小箭)及RPE細(xì)胞(大箭)均無(wú)染色400Fig.1Photomicrograph of the macular region section from a 2-year-old donor.No staining of Bruch?s membrane (small arrow)and RPE cells(large arrow)is demonstrated.C

12、ryosections stained with oil red Oand counter stained with Mayer?s haematoxylin400228歲眼油紅染色冰凍組織切片顯微照片。Bruch膜(小箭)呈線形染色，RPE細(xì)胞(大箭)輕度染色400Fig.2Photomicrograph of the macular region of section from a 28-year-old donor.Light staining of Bruch?s membrane (small arrow)in a thin line pattern and RPE cells(la

13、rge arrow)is demonstrated.Cryosections stained with oil red O and counter stained with Mayer?s haematoxylin400372歲眼油紅染色冰凍組織切片顯微照片。Bruch膜(小箭)呈帶狀染色，毛細(xì)血管間柱亦有染色(中箭)，RPE細(xì)胞(大箭)染色明顯400Fig.3Photomicrograph of the macular region of section from a 72-year-old donor.Deep staining of Bruch?s membrane(small arro

14、w)in a broad line pattern and RPE cells(large arrow)is demonstrated.The choroid intercapillary pillar(middle arrow)is also stained.Cryosections stained with oil red O and counter stained with Mayer?s haematoxylin400顯示染色程度隨年齡而增強(qiáng)，條形代表各種染色程度在不同年齡組中所占的百分比(n=眼數(shù))4不同年齡組中Bruch膜油紅染色程度示意Fig.4The histogram dem

15、onstrates the different staining intensity of oil red O in Bruch?s membrane of three age groups.The vertical bars represent the percentage of eyes with a particular staining intensity within each age group.The graph highlights an increasing staining intensity with age(n=number of donor eyes）溴-蘇丹黑 B陽(yáng)

16、性染色組織切片中，Bruch膜呈藍(lán)黑色。經(jīng)脂溶劑處理的組織切片，染色呈陰性。Bruch膜陽(yáng)性染色表現(xiàn)及特點(diǎn)同油紅。年輕組中只有1例(28歲)為輕度染色；中年組則多數(shù)為輕度染色；老年組中，64%表現(xiàn)為中度及重度染色(6)。RPE細(xì)胞染色也可觀察到，但因黑色素顆粒與此染色相近，不易區(qū)分。黃斑區(qū)與周邊部Bruch膜及RPE細(xì)胞染色也有區(qū)別，但不如油紅染色表現(xiàn)的清晰。AMD眼表現(xiàn)為溴-蘇丹B的強(qiáng)烈染色，其染色特點(diǎn)與油紅染色相似。溴-丙酮-蘇丹黑B陽(yáng)性染色為灰色，其染色程度同上述兩種脂類染色一樣，隨年齡的增長(zhǎng)而增加。年輕組則均為陰性；中年組12.5%輕度染色；老年組50%呈輕度或中度染色(7)。染色陽(yáng)性

17、占溴-蘇丹黑B染色眼的40%。兩例AMD眼中，只有1例中度染色。5AMD眼油紅染色冰凍組織切片顯微照片。Bruch膜(小箭)及RPE細(xì)胞(大箭)染色較正常老年眼更為強(qiáng)烈，玻璃疣drusen亦有染色(中箭)400Fig.5Photomicrograph of the macular region sections of anage-related macular degeneration eye from a 67-year-old donor.The staining in Bruch?s membrane (small arrow)and RPE cells (large arrow)is

18、intensively in bright red.The drusen(middle arrows)is also stained with high intensity.Cryosections stained with oil red O and counter stained with Mayer?s haematoxylin400顯示染色程度隨年齡而增強(qiáng)，條形代表各種染色程度在不同年齡組中所占的百分比(n=眼數(shù))6不同年齡組中Bruch膜溴-蘇丹黑B的染色程度示意Fig.6The histogram demonstrates the different staining intens

19、ity of bromine Sudan black B in Bruch?s membrane of three age groups.The vertical bars represent the percentage of eyes with a particular staining intensity within each age group.The graph highlights an increasing staining intensity with age(nnumber of donor eyes)顯示染色程度隨年齡而增強(qiáng)，條形代表各種染色程度在不同年齡組中所占的百分比

20、(n=眼數(shù))7不同年齡組中Bruch膜溴-丙酮-蘇丹黑B的染色程度示意Fig.7The histogram demonstrates the different staining intensity of bromine acetone Sudan black B in Bruch?s membrane of three age groups.The vertical bars represent the percentage of eyes with a particular staining intensity within each age group.The graph highlig

21、hts an increasing staining intensity with age(n=number of donor eyes）3討論此研究結(jié)果顯示Bruch膜內(nèi)脂類隨年齡增長(zhǎng)而不斷積累，中性脂類為主要成分。此結(jié)果與以往的有關(guān)報(bào)道基本一致1，2，4，5，7。類似的結(jié)果在AMD眼中也觀察到，磷脂僅出現(xiàn)于1例中。這可能反應(yīng)了AMD與正常老年性Bruch膜病生理性改變的共同性。Sheraidah等4用薄層和氣體色譜法(thin layer and gas chromatography)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)年輕人眼中，磷脂類成份多于中性脂，而60歲以上年長(zhǎng)者，則相反。Holz及同事6用類似研究方法測(cè)出

22、多數(shù)人眼中性脂類的總和超過(guò)磷脂類，雖然他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)源于RPE和脈絡(luò)膜的組織復(fù)合體，不能消除脈絡(luò)膜甚至RPE的影響，但仍可反應(yīng)出個(gè)體之間脂類沉積的不同成份。通常認(rèn)為，組織化學(xué)方法在定位上較有優(yōu)勢(shì)，但其敏感性低，這也可能部分解釋此實(shí)驗(yàn)中磷脂染色陽(yáng)性率低的現(xiàn)象。本研究及以往報(bào)道6都發(fā)現(xiàn)黃斑區(qū)Bruch膜和RPE形態(tài)及脂類染色與周邊部不同，生化方法也證實(shí)黃斑區(qū)脂類沉積較周邊部多6，此特點(diǎn)不能單純解釋為黃斑區(qū)Bruch膜與RPE的特殊結(jié)構(gòu)及形態(tài)，可能反映了區(qū)域衰老速度的不同，建議正常老化過(guò)程與AMD具有共同的區(qū)域分布6。Bruch膜沉積的脂類可能來(lái)自RPE細(xì)胞1-5，它的沉積量反映了RPE的代謝負(fù)荷

23、狀況。由于黃斑區(qū)視細(xì)胞密度較高，黃斑區(qū)代謝負(fù)荷高于周邊部。RPE和視細(xì)胞雖都可因年齡而減少，但RPE喪失的速度較快，可能造成這種負(fù)荷隨年齡而增加10，雖然有研究者對(duì)此持不同的意見(jiàn)11。視細(xì)胞外節(jié)富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid)，易受自由基(free radical)攻擊引起過(guò)氧化反應(yīng)12，形成不被RPE溶酶體降解的高分子量多聚體13在RPE細(xì)胞中的聚集，與蛋白質(zhì)類融合產(chǎn)生黃棕色脂褐素顆粒14，15。RPE細(xì)胞將這些殘余物于細(xì)胞基底部以胞吐(apoptosis)形式清除至Bruch膜，透過(guò)Bruch膜，被脈絡(luò)膜毛細(xì)血管清除。Bruch膜中不同的脂類成

24、份，可能反映了RPE細(xì)胞內(nèi)不同降解酶的功能減退，沉積物的化學(xué)性質(zhì)則決定著AMD的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸：極性磷脂可能通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)Bruch膜而導(dǎo)致新生血管的產(chǎn)生；而中性脂類成份則損害Bruch膜的親水特性造成Bruch膜的水壓傳導(dǎo)性(hydraulic conductivity)降低，使液體積存于RPE和Bruch膜之間，形成RPE脫離；RPE和脈絡(luò)膜之間的代謝交流亦可因此受阻，使RPE細(xì)胞功能下降，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜萎縮2。RPE細(xì)胞染色的特性和分布與Wing等14描述的脂褐素在RPE細(xì)胞內(nèi)的積累一致。脂褐素雖然對(duì)有機(jī)溶劑有抵抗作用，但仍保持著某些脂類的特點(diǎn)9。因而RPE細(xì)胞染色不受脂溶劑影響，可能

25、反映了脂褐素的特性，而表明了RPE細(xì)胞內(nèi)脂褐素的沉積特點(diǎn)。AMD眼中RPE細(xì)胞高度染色支持脂褐素可能對(duì)AMD發(fā)病過(guò)程具有重要作用的觀點(diǎn)10，12，14。作者單位：200031上海醫(yī)科大學(xué)眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科(張勇進(jìn))；Dept of Ophthalmology,Manchester University,U.K(Grenham TRELAND、Mike BOULTON)4參考文獻(xiàn)1Pauleikhoff D,Harper CA,Marshall J,et al.Ageing changes inBruch?s membrane：A histological and morphological s

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