1、CpG ODN序列結構特征對免疫活性影響的研究進展        【關鍵詞】  CpG ODN; CpG 基序; 免疫刺激; 序列結構CpG ODN（CpG oligonucleotide, CpG 寡脫氧核苷酸）是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（CpG）的寡脫氧核苷酸(ODN), 可模擬細菌DNA刺激多種哺乳動物包括人的免疫細胞。它能直接激活B細胞和單核細胞(巨噬細胞和樹突狀細胞), 間接激活NK細胞和T細胞等多種免疫效應細胞, 增強其功能和細胞因子的分泌, 增強抗原的加工提呈, 誘導Th

2、1型免疫應答, 產生較強的體液免疫和細胞免疫, 增強特異性和非特異性免疫反應。可腫瘤、 過敏反應性疾病、 感染性疾病和免疫功能低下的患者。國外已對目前對人免疫刺激活性最強的CpG ODN 7909進行了多項的臨床試驗, 包括對黑色素瘤、 非小細胞肺癌、 皮膚T細胞淋巴瘤、 非霍奇金淋巴瘤等腫瘤的/期臨床試驗, 以及對HBV、 HCV等感染性疾病的/期臨床試驗1-3, 證實是一種高效低毒的新型免疫治療劑和佐劑, 并已申請專利。目前國內的研究尚處于體外實驗和動物試驗階段, 尚無具有獨立知識產權的CpG ODN序列。    CpG ODN是多個脫氧核苷酸有的排列, 其組

3、合形式多樣。而不同序列結構特征的CpG ODN免疫活性相差很大, 改變序列中的某一個或某幾個核苷酸都可能會極大地影響其免疫活性, 這是設計免疫活性CpG ODN的理論基礎。通過研究并掌握CpG ODN的構效關系對于合成和篩選對人有效的CpG ODN序列有重要意義。1  CpG ODN的結構特征及分類    非甲基化的CpG二核苷酸為核心的六核苷酸特征結構, 即CpG及其上游、 下游各2個核苷酸所組成的六聚體, 是奠定CpG ODN免疫刺激作用的序列元件, 它是CpG ODN免疫刺激活性的核心結構。Krieg稱其為CpG基序(CpG motif), Sat

4、o等則稱其為免疫刺激序列(ISS, immunostimulatory sequences)。根據CpG ODN的骨架結構特點、 免疫活性、 免疫細胞識別特征的差異對其進行分類, 以便深入了解其構效關系, 從而更有針對性地設計具有不同治療目的CpG ODN。1.1  根據骨架分類  CpG ODN有兩種骨架: (1)磷酸二酯骨架（phosphodiester, PO）, 即相鄰的核苷酸以磷酸二酯鍵相連; (2)硫代磷酸骨架（Phosphorothiate, PS/PTO）, 即磷酸二酯鍵中一個非橋聯氧原子被硫取代。這種取代與其細胞攝取能力和抵抗3'端核酸外切酶的消化

5、能力密切相關, 從而影響其活性。1.2  根據外周血單個核細胞對CpG核心序列識別特征分類  根據CpG ODN活化人外周血單個核細胞（PBMC）亞群和產生的免疫效應的區別可將其分為兩類, 分別稱為D型和K型4。Krieg將上述兩類ODN分別命名為CpGA ODN和CpGB ODN。各型結構特征和免疫效應的區別如表1所示。    近年來, 一種新型的CpG ODN逐漸被人們識別, 這種ODN既能活化B細胞, 誘導人PBMC分泌型IFN, 還可以明顯增強PBMC中NK細胞的細胞毒作用。這種ODN被定義為C型ODN, 即CpGC ODN。其結構特征

6、為: (1)5末端或者靠近5末端有12個TCG三核苷酸。(2)至少有1012個堿基構成的回文序列, 最好在3端, 其中至少有2組CG二核苷酸5。(3)由poly T連接。表1  3型CpG ODN的比較（略）這種分類方法對CpG ODN臨床應用具有重要的意義。在進行腫瘤的臨床治療時, 可以根據機體對不同的抗腫瘤機制選擇應用不同的CpG ODN 以達到治療目的: 如果以NK細胞殺傷腫瘤細胞為主要機制, 則選擇A型ODN, 如果以誘導記憶性免疫應答及抗瘤抗體的作用為主要機制, 則選擇B型ODN6。治療病毒感染性疾病時, 首先選擇A型ODN。C型CpG ODN的作用則結合了兩者的特點, 在

7、腫瘤和感染性疾病的治療中具有更廣闊的前景。1.3  根據其免疫刺激活性進行分類  根據CpG ODN免疫作用的方向可將分為兩型: 一型是免疫刺激性CpG ODN (immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides,  CpGS ODN), 另一型是抑制性CpG ODN, 包括中和性CpG ODN（neutralizing CpG oligonucleotides, CpGN ODN）7和含有CGGG序列的抑制性ODN8。抑制性ODN能夠拮抗CpGS ODN的作用。上述研究結果對選擇性合成ODN具有指導意義: 如果進行腫瘤的基因

8、治療, 可以預先去除載體上不影響基因活性的CpGS 基序,  或將其轉換為CpGN 基序, 以減輕載體的免疫刺激效應; 如果將ODN作為免疫調節劑或疫苗佐劑使用, 需避免CpGN ODN在序列中出現, 盡量利用CpGS ODN增強其免疫刺激活性。2  影響CpG ODN的免疫刺激活性的因素    CpG ODN的免疫刺激活性受自身結構特征影響。CpG二核苷酸的缺失、 逆轉以及胞嘧啶的甲基化均可導致其活性喪失, 說明CpG ODN中非甲基化的CpG二核苷酸的存在是其免疫刺激活性的基礎。此外, 骨架的長度、 硫代化修飾、 側翼序列、 末端修飾及二級

9、結構形成等因素對其活性也有影響。2.1  骨架結構  （1）骨架長度: CpG ODN需要一定長度才能發揮其免疫刺激活性。許洪林等設計了一系列含1530個堿基的CpG ODN, 發現富含CpG基序的T7（含21個堿基）和T8（含24個堿基）具有較強的刺激B細胞產生IgM的作用; 含16, 27, 30個堿基的CpG ODN免疫作用較弱。而且, 目前公認對人以及對小鼠免疫刺激作用最強的CpG 7909（即CpG 2006）和CpG 1826分別含24個和20個堿基。綜上, 可以推測長度為1825個堿基左右的含有非甲基化的CpG基序的CpG ODN可以較好地發揮其免疫刺激活性,

10、 目前國內外研究中又以2024個堿基長度的CpG ODN多見。（2）骨架的化學修飾: 寡脫氧核苷酸骨架修飾中最常見、 應用最廣泛的是硫代化修飾, 即磷酸二酯骨架中一個非橋聯氧原子被硫取代。因磷酸硫代化修飾可抵抗體內核酸酶的消化作用, 有利于其在體內保持穩定; 并且增加胞內的吸收率, 從而加強其免疫活性。研究證實9, PS骨架的CpG ODN (PSODN)濃度僅為PO骨架的CpG ODN (POODN)的1/101/100時即可表現出強度相當的免疫活性, 如誘導NO分泌、 缺乏集落刺激因子1（macrophage growth and survival factor,  CSF1）時

11、維持細胞活性、 活化IL12啟動子等。而且PSODN刺激B細胞增殖作用強于相應的POODN。在誘導小鼠脾細胞分泌IL12和表達CD69方面, PSODN也強于POODN10。值得注意的是, PSODN在高濃度時反而表現出一定的抑制效應, 這在POODN是不存在的9。PSODN可引起小鼠脾臟腫大, 可能與髓外造血和免疫系統的過度激活有關, 尚未發現有報道POODN的類似作用。所以, 在設計具有免疫刺激活性的CpG ODN時, 可以對ODN骨架進行硫代化修飾以增強其免疫活性, 但需仔細研究最適劑量, 以獲得最佳治療效果和最低毒副作用。2.2  側翼序列  組成CpG基序的核苷酸

12、六聚體中, CpG二核苷酸兩側的其他核苷酸稱為側翼序列。通過調整側翼序列中的堿基可以改變其免疫活性。（1）堿基的順序: Krieg 等11發現具有刺激小鼠B淋巴細胞活性的CpG ODN其堿基序列大多有一定規律: CpG二核苷酸近5端兩堿基一般為嘌呤(Purine), 以GpA更佳, 近3兩堿基一般為嘧啶(Pyrimidine), 以TpC或TpT為佳。Ballas等12認為CpG二核苷酸近5端若為C或G可明顯抑制ODN刺激小鼠NK淋巴細胞的活性, 而近3端為C時對活性影響不大。可見, 5端為GA的GACGTT/C是對小鼠作用較強的CpG基序, 而改為GC或GG后形成了GCCGTT/C或GGCG

13、TT/C基序后, 其免疫活性降低。人外周血單個核細胞可被含有“GTCGTT”, “TTCGTT”, 或“AACGTT”基序激活, 作用最強的基序是GTCGTT。Hartmann等13,  14發現多個TCG重復序列有助于增強CpG ODN對人B細胞和NK細胞的刺激作用, 許洪林設計出含多個TCG重復序列的T7和T8, 對人PBMC也具有良好的免疫刺激活性。多個TCG重復序列即形成GTCGTC基序, 說明CpG二核苷酸3端為TpC時形成的GTCGTC基序同樣對人具有較強的免疫刺激活性。（2）堿基的修飾: CpG側翼序列中特定位點的核糖經2O或者3O甲基化修飾后, 其活性發生改變: 修飾

14、靠近CpG的脫氧核苷酸抑制其活性; 而在與CpG 5端相距3-4個核苷酸位點的修飾則增加了其免疫刺激活性15。還有文獻報道, 去除CpG寡脫氧核苷酸側翼序列中的核苷酸上的堿基也可影響其活性: 去除3端側翼序列中12個特定位置的核苷酸的堿基對其活性影響較小; 而對5端側翼序列進行相同的處理能夠增強其免疫刺激活性16。這些研究都可以用于設計具有更強的刺激活性的ODN, 實用價值尚待進一步驗證。2.3  末端poly G修飾  CpG ODN兩末端的Poly G結構可影響其活性: (1)Poly G為硫代磷酸（PS/PTO）修飾, CpG ODN其余序列為磷酸二酯（PO）骨架時,

15、 5和/或3端Poly G均明顯增強其活性;  (2)CpG ODN為全硫代磷酸骨架, 5和/或3端的Poly G尾抑制其活性。但5端為Poly G時, 其抑制效應可被增加濃度所克服12。2.4  CpG基序的頻率和位置  對于B型CpG ODN, 單個的CpG基序就足以使這類ODN 表現出活性, 但多個CpG基序的組合(特別是這些CpG基序處于略有差異的側翼序列中) 將使得其生物學活性極大增高17。含有單個CpG基序的ODN和具有多個（3）CpG基序的ODN相比, 其最大刺激強度只有后者的1/4（P<0.01）。可見, 含2-4個ISS 的CpG ODN可

16、作為有效的佐劑來增強疫苗的免疫效果。    CpG基序在ODN中所處的位置也影響活性18:  (1)CpG基序越靠近5端時活性越強。(2)5端有免疫刺激活性較強的CpG基序的ODN, 比起5端相同位置具有較弱活性的CpG基序的ODN, 前者激發的免疫活化作用顯著高于后者(63%: 19%)。如果將免疫刺激活性較強的CpG基序放在3端則導致活性減弱。這對設計作為免疫佐劑的B型ODN非常重要。為了使其發揮最大的免疫效應, 應該將刺激活性最強的CpG ODN基序放在ODN的5端。2.5  二級結構對活性的影響  Kandimalla等19研

17、究發現: (1)5端形成莖環結構的CpG不能誘導細胞因子的產生; (2)5端無論是CpG基序區的雙鏈結構還是延伸至全長的雙鏈結構, 誘導IL12和IL6分泌水平大大下降。更長的雙鏈結構盡管增加了CpG基序的含量, 但由于CpG基序形成了雙鏈結構, 對于受體識別CpG基序是不利的, 故而免疫活性也明顯減弱。這與以往的研究結果一致, 說明CpG寡核苷酸的5端是其受體識別和免疫刺激作用的關鍵部位。他還發現3端的莖環二級結構能增強CpG刺激小鼠脾細胞增殖的作用, 這可能與3端的莖環二級結構增加其對3端核酸酶水解的代謝穩定性有關。綜上, 5端二級結構的出現會使CpG寡核苷酸免疫刺激活性大大降低, 而3端

18、添加適當的二級結構可增強對免疫細胞的刺激作用。1         3  結語    CpG ODN的骨架、 側翼序列、 末端修飾、 CpG基序的數量和位置、 二級結構等均能影響其免疫刺激活性。各型ODN共同的影響因素如下: (1)序列中含有非甲基化的CpG基序; 必須具備一定的長度, 以18-25個堿基為宜。此外, A型ODN還需要具備磷酸二酯骨架; (2)序列中有回文序列, 能形成二級結構; (3)末端的Poly G結構可以增強其免疫刺激活性。B型ODN則還需要具備(1)全

19、硫代化修飾的骨架; (2)CpG基序位于5端活性較強; CG二核苷酸5端相鄰的堿基為T時活性最強, 3端側翼序列為TpT/TpC/TpA時活性最強。(3)5端Poly G或二級結構阻斷其免疫刺激活性, 3端Poly G或二級結構可增強其對免疫細胞的刺激作用, 改變細胞因子的分泌情況; (4)多個不同的CpG基序可極大地增強其免疫刺激活性, 特別是處在不同的側翼序列中。免疫刺激C型ODN對結構的要求與B型相似, 此外其5端TCG對于高效催生IFN是必不可少的。   國外研究機構對CpG ODN進行了多項臨床試驗, 如PF3512676（CpG ODN 7909）黑色素瘤; V

20、axImmune（CpG ODN 7909）作為疫苗佐劑對非小細胞肺癌進行免疫治療的期臨床試驗; 葛蘭素史克公司麾下35種疫苗的臨床試驗, 包括肺癌、 乳腺癌、 前列腺癌及感染性疾病中。我們曾經觀察過使用CpG ODN 1826作為免疫佐劑的腫瘤疫苗對急性白血病小鼠模型的免疫治療效果, 證實應用GpG ODN 1826瘤苗確可加強白血病小鼠的抗瘤作用20。CpG ODN免疫刺激作用源于對TLR9的活化, 這啟發了科研人員利用TLR調節免疫的思路, 催生出一種新的治療方法: TLR療法。2007年10月, 一項聯合阻斷TLR7、 TLR8、 TLR9治療自身免疫性疾病的期臨床試驗開始。此舉進一步

21、拓寬了CpG ODN的應用范圍。CpG ODN具有相當廣闊的前景, 了解并掌握其構效關系將有助于我們設計出更多具有免疫活性的序列。【】  1 Leonard JP, Link BK, Emmanouilides C, et al. Phase I trial of tollLike receptor 9 agonist PF3512676 with and following rituximab in patients with recurrent indolent and aggressive non hodgkins lymphomaJ. Clin Cancer Res, 200

22、7, 13(20): 6168-6174.2 Cooper CL, Davis HL, Morris ML, et al. CPG 7909, an immunostimulatory TLR9 agonist oligodeoxynucleotide, as adjuvant to EngerixB HBV vaccine in healthy adults: a doubleblind phase I/II studyJ. J Clin Immunol, 2004, 24(6): 693-701.3 McHutchison JG, Bacon BR, Gordon SC, et al. P

23、hase 1B, randomized, doubleblind, doseescalation trial of CPG 10101 in patients with chronic hepatitis C virusJ. Hepatology, 2007, 46(5): 1341-1349.4 Vollmer J, Weeratna R, Payette P, et al. Characterization of three CpG oligodeoxynucleotide classes with distinct immunostimulatory activitiesJ. Eur J

24、 Immunol, 2004, 34(1): 251-262.5 Marshall JD, Fearon K, Abbate C, et al. Identification of a novel CpG DNA class and motif that optimally stimulate B cell and plasmacytoid dendritic cell functionsJ. J Leukoc Biol, 2003, 73(6): 781-792.6 Ballas ZK, Krieg AM, Warren T, et al. Divergent therapeutic and

25、 immunologic effects of oligodeoxynucleotides with distinct CpG motifsJ. J Immunol, 2001, 167(9): 4878-4886.7 Krieg AM, Wu T, Weeratna R, et al. Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory CpG motifsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(21): 12631-12636.8 Stunz LL, Lenert P, Peckham D, et al. Inhibitory oligonucleotides specifically block effects of stimulatory CpG oligonucleotides in B cellsJ. Eur J Immunol, 2002, 32(5): 1212-1222.9 Sester DP, Naik S, Beasley SJ, et al. Phosphorothioate backbone modification modulates macrophage activation by CpG DNAJ. J I