1、人GM-CS基因真核表達載體構建與表達【摘要】【目的】構建以基因佐劑hGM-CS基因為基礎的真核表達質粒pIGM-CSF,并在宮頸癌細胞HeLa中表達與鑒定。【方法】采用聚合酶鏈反應從載體pORF-hGM-CS中，擴增出hGM-CS基因，克隆到雙順反子真核表達載體pIRES的多克隆位點B(MCSB中， 構建pIGM-CSF真核表達載體。 然后采用脂質 體轉染法將其轉染HeLa細胞，用RT-PCF在RNA水平和ELISA在蛋白水平檢測 其在真核細胞中的表達。【結果】所克隆hGM-CS基因片段經測序完全正確；重組質粒轉染Hela細胞后， 檢測有hGM-CSI表達。【結論】成功構建含基因佐劑真核表達

2、載體pIGM-CSF并在宮頸癌細胞中能有效表達，為繼續克隆目的 抗原從而構建雙順反子真核表達質粒奠定了基礎。【關鍵詞】真核表達載體；hGM-CS；F基因佐劑；雙順反子pressionAbstract:【Objectiveplasmid pIGM-CSF based】onTo construct eukaryotic exgene adjuvant hGM-CSF, and expressin Hela cells.【Methods】Plasmid pORF-hGM-CSF was used astemplate to amplify hGM-CSF gene by PCR, and the p

3、roduct was inserted into multiple cloning site sB of bicstroniceukaryoticexpression vectorpIRES to construct eukaryotic expression plasmid pIGM-CSF,thentransfectedinto Hela cellby usingliposome.Finally,thehGM-CSFgeneexpressionof protein wasdetected byRT-PCRfromRNA leveland ELISA fromprotein level.【R

4、esults】The length and sequence of the cloned hGM-CSF segment was correct. The hGM-CSF gene could be expressed in transfected Hela cells.【Conclusion】The eukaryoticexpression plasmid pIGM-CSF containing gene adjuvant was successfully constructed and expressed in Hela cellseffectively, lays a foundatio

5、n on constructing bicstronic eukaryotic co-expression plasmid.Key words: eukaryotic expression plasmid; hGM-CSF; gene adjuvant; bicstronic目前對DNA疫苗的研究已經成為熱點，一些研究表明DNA疫苗對許多病毒1,2、細菌3、寄生蟲4、腫瘤5和慢性退行性疾病6等有預防和 治療作用，還可以調節自身免疫應答。HIV、瘧原蟲和病人獨特型DNA疫苗等已進入人體臨床試驗7，但是核酸疫苗的免疫效果在不同動物個體中差異較大， 有些疫苗在小個體的動物中免疫和保護效果較好，而在大

6、個體動物中效果較 差。某些腫瘤及病毒的T、B細胞表位抗原性弱，難以誘導有效的T、B細胞免1.5pIGM-CSF真核載體的構建與鑒定疫應答。基因佐劑(gene adjuvant)可將某些細胞因子編碼基因與目的基因克 隆到同一載體或不同載體共同免疫動物，其表達的相應蛋白起到佐劑作用，可 大大增強T、B細胞的免疫應答水平。為此，我們構建以基因佐劑人粒細胞-吞噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colonystimulating factor,hGM-CSF為基礎的真核表達載體pIGM-CSF為今后在該載體上克隆我們所需的目的抗原基因奠定了基礎。1材料與方法1.1質粒與菌

7、株大腸桿菌DH5x和宮頸癌細胞Hela為本實驗室保存；載體pIRES購自BD Biosciences Clontech公司，質粒pORF-hGM- CSF購自InvivoGen公司。1.2主要試劑Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，*性內切酶Xbal和Not I, DL-1 kb marker，質粒提取試劑盒，DNA膠回收純化試 劑盒購自大連寶生物公司。1 kb DNA marker和300 bp marker購于 鼎國生物公司。一對PCR引物、重組質粒上目的基因的序列測定由上海生工生 物工程公司完成。MML逆轉錄酶和脂質體轉染試 劑Lipofectamine 2000及配套轉染液

8、Opti-MEMI Reduced Serum Medium購自Invitrogen公司。人hGM-CS蛋白ELISA雙抗體夾心法檢測試劑盒購自深圳市晶美生物科技公司。1.3引物設計 參照GenBank上人GM-CS!基因CDS序列分別設計引物如下。上游引物P1:5-CA TCTAGA AAGGAGGGCCACCATG3,含XbaI位點和起始密碼子ATG下游弓I物P2:5-AT GCGGCCGCGTCGAGCTAGCGAATTC-，含Not I位點，含終止密碼子TGA擴增基因長度為474 bp。1.4hGM-CS基因的PCF擴增以載體pORFhGM-CS為模板，用引物P1、P2進行PCF擴增h

9、GM-CSI基 因，反應體系為50卩L,其中上下游引物各1卩L，dNTP 3卩L,模板DNA 4卩L，10 x Ex Taq Buffer5卩L，MgCl2 3卩L，Ex Taq 0.4卩L，dd H2O 33卩L,反應條件為：95 C預變性5 min,95 C 30 s，56 C 30 s，72 C 60 s，共30個循環，72 C再延伸10 min。擴增產物取5卩L進行12 g/L瓊脂糖凝膠電 泳，以確定擴增產物大小。將hGM-CSF勺PCF產物經過回收純化后與載體pIRES,同時用Xbal和Not I雙酶切，酶切后進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并經過凝膠回收純化試劑盒回收酶切產物，將兩

10、者酶切純化的產物按照3:1的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶連接24 h,轉化用低溫CaCI2制備的E.coliDH5x感受態細菌，然后涂布于含氨芐青霉素50 ?滋g/mL的LB固體培養基中。次 日，隨機挑取10個單菌落，分別接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養液中，37 C下150 r/min振蕩培養過夜。將100卩L過夜培養的菌液煮沸后離心 取上清液2卩L作為模板以引物P1和P2進行菌落PCR如果結果經瓊脂糖凝 膠電泳顯示大小正確則用質粒提取試劑盒提取質粒DNA將提取的質粒DNAfflXbal和Not I雙酶切，進行電泳檢測，以DL-1000 bp marker為分子量參 照，將篩選出的陽

11、性克隆產物的菌液進行測序鑒定。測序采用Sanger雙脫氧鏈終止法，對引物所在序列的兩端進行測定，測序工作由上海生物工程公司完 成。1.6重組質粒轉染將HeLa細胞加入含有Lipofectamine2000及配套轉染液Opti-MEMI Reduced Serum Medium的6孔板內，500 ?滋L/孑L。取0.7 ?滋g重組質粒DNA和2 ?滋g脂質體分別溶于250 ?滋L的Opti-MEMI轉染液 中。5 min后加入到轉染專用的管中混勻，室溫靜置20 min，加入到上述6孔板內，培養6 h后，換成PRMI 1640完全培養基繼續培養。1.7細胞的培養和傳代凍存的Hela細胞株經復蘇后培

12、養于含100 mL/L小牛血清PRMI 1640完全培養基中，在37 C、5%CO飽和濕度的培養箱中培養，每3 d消化傳代一次。1.8重組質粒pIGM-CSF轉染Hela細胞轉染前1 d將HeLa細胞傳代接種在6孔板內，細胞生長至80%- 90%時；以Opti-MEM Reduced Serum Medium各250卩L分別稀釋5卩g pIGM-CSF質粒和10卩L Lipofectamine-2000轉染1孔，培養6h,更換PRMI 1 640完全培養基繼續培養。1.9RT-PCF檢測hGM-CS基因表達分別收集pIRES和pIGM-CSF質粒轉染48 h的HeLa細胞，應用已異 硫氰酸胍一

13、步法提取細胞中的總RNA， 以Oligo dT為引物， 在MML逆轉錄 酶作用下，37 C 1 h將RNA逆轉錄為cDNA 95 C滅活MMLV以cDNA為 模板用P1和P2為引物進行PCR反應體系為50卩L,其中上下游引物各1卩L，cDNA模板10卩L，5X PCR Buffer 10卩L，Ex Taq 0.25卩L，dd H2O 28.75卩L,反應條件為：95 C預變性5min,95 C 30 s，56 C 30 s,72 C 60 s，共30個循環，72 C再延伸10 min。擴增 產物取5卩L進行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳。1.10ELISA法檢測hGM-CS蛋白表達水平分別收集pI

14、RES和pIGM-CSF質粒轉染24 h和48 h的HeLa細胞的 細胞培養的上清液，采用ELISA雙抗體夾心法檢測hGM-CS蛋白的表達量，按 照試劑盒說明進行操作。用酶標儀在吸光度A450下測定樣品和試劑盒提供的標 準品的A值。 根據標準品所測A值繪制的蛋白濃度與A值相關標準曲線計算各 樣品中hGM-CS蛋白的含量。1.11統計學處理實驗數據以xs表示，處理數據統計用SPSS13.0軟件包進行分析,組間比較采用兩組樣本t檢驗，P 0.05具有統計學意義。2結果2.1hGM-CS基因的PCF產物電泳分析12 g/L瓊脂糖凝膠電泳的結果顯示，PCR擴增產物為均一條帶，對比Marker，大小同預

15、期結果一致（圖1）。2.2*性內切酶消化鑒定質粒pIGM-CSF經Xbal和Not I雙酶切后,電泳可見大小約為6.1 kb與0.47 kb兩片段，載體pIRES經上述兩個酶雙酶切后，僅見一條6.1 kb的片段（圖2）。2.3序列分析鑒定對質粒pIGM-CSFh的多克隆位點B（MCSB內的DNA序列進行序列分析 鑒定,結果與hGM-CSF（NCB登陸號：M11220的基因序列完全相同2.4RT-PCF結果如圖4所示，在電泳圖中轉染質粒pIGM-CSF的有hGM-CS基因條帶的 出現，而轉染了空質粒pIRES的則沒有hGM-CSI基因條帶的出現。2.5ELISA檢測結果分析以空載體pIRES為陰

16、性對照，結果表明，pIGM-CSF在轉染24 h和48 h可檢測到hGM-CS分泌，表達水平在標準曲線范圍之內，與對照組比較 均有統計學意義（表1）。細胞因子是一類可溶性的小分子多肽或蛋白質，通過與細胞膜表面受 體相互作用發揮其生理活性。細胞因子在體內能激活和調節免疫細胞，通過不 同的作用環節調節或增強DNA疫苗的免疫效應而發揮佐劑作用。目前已發現多 種細胞因子具有佐劑效應，在DNA疫苗領域研究最為活躍的是IL-2、IL-12、IL-18、GM-CS和IFN-丫。GM-CS屬于酸性糖蛋白，是一種多效的細胞因子， 它具有刺激髓樣祖細胞的增殖和成熟并維持髓性細胞的功能特性，促進巨噬細 胞的增殖和分

17、化， 調節粒細胞和單核組細胞生長和分化， 增強成熟的中性粒細 胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞的功能，以及加強單核-巨噬細胞抗腫瘤和ADCC作用等生物學活性。作為基因佐劑，GM-CS能夠增強CTL NK細胞活性，但更主要的是調節抗原提呈細胞尤其是樹突狀細胞的數量和功能來調節免疫應答的 強度。Hongxun等2將攜帶GM-CS基因的重組質粒(pNGV-hFL+3L)作為佐劑與HIV基因疫苗p17HIV共同免疫小鼠，結果在注射部位及其相應的淋巴結中可聚 集大量的樹突狀細胞，并且比單獨應用基因疫苗產生更強烈的細胞免疫應答及 脾細胞抗原特異性IFN-丫。Zhang等3發現將只含有結核桿菌單基因的重組質 粒p

18、Ag85A和有GM-CSI基因的重組質粒pAg85A/GMCS同時注射免疫小鼠時，結 果pAg85A/GM-CS組比pAg85A組產生更高水平的IFN-r，并能夠增強CTL細胞 活性。Miyashita等將克隆的GM-CSF專染JA細胞作為疫苗皮下包埋免疫患 食管癌的小鼠，與未轉染組比較結果腫瘤體積明顯縮小，表明對該腫瘤有抑制 作用。實驗證明，GM-CS可以作為免疫佐劑和腫瘤疫苗免疫促進劑8。目前 國內外對于GM-CSI基因的研究和報道多以鼠mGM-CS為主， 但對于人hGM-CSF基因克隆和研究的報道并不多見。本實驗以人hGM-CS基因為目的基因,主要是 為了進一步研究人hGM-CSI基因在

19、DNA疫苗中的免疫學作用，其對今后DNA疫苗 應用于臨床人體實驗比mGM-CS有著更為重要的臨床意義。本實驗所采用的真核表達載體pIRES能在細胞基因組外擴增表達目的 基因。質粒pIRES含有人巨細胞病毒啟動子、腦心機炎病毒的內部核糖體進入 位點(in ternalribosome en trysite,IRES)，IRES連接兩個開放讀碼框，其轉錄產物在翻譯時，核糖體能同時進入并開始翻譯IRES上游及下游的兩個轉錄子9。 本實驗在啟動子下游的MCSB勺酶切位點Xbal和Not I之 間插入人hGM-CSF勾建含有基因佐劑功能的真核表達質粒pIGM-CSF并通過RT-PCF在RNA水平和ELI

20、SA在蛋白水平檢測其在真核細胞中表達。 現已有研究 認為以pIRES為雙表達質粒將目的抗原與細胞因子共表達在不同的實驗系統中 均顯著增強免疫力10,11。我們成功構建含基因佐劑hGM-CSF勺真核表達質 粒，為下一步在該載體上克隆我們所用的抗原基因研制新型優效的DNA疫苗奠定了基礎。【參考文獻】*剛,江元森,楊 林,等.HBV S基因、PreS2/S基因真核重組 載體的構建與鑒定J.中山大學學報：醫學科學版,2004,25(3S):25-27.HONGXUNS, VLADIMIR M P, COREY M, et al.Regional, butnotsystemic recruitment/

21、 expansion of dendritic cells by a plu ronic-formulated Flt3-ligand plasmid with vaccine adjuvant activityJ.3, 21(26):3019-3020.Vaccine, 200ZHANG X Z, MAZIAR D, PATRICIA N, et al.Intramuscularimmunization with a monogenic plasmid DNA tuberculosis hancedimmunogenicity by electroporation and co-vaccin

22、e: Enexpreeion of GM-CSF transgene J. Vaccine, 2007, 25(7): 1342-1352.陳觀今，陳海峰，郭虹，等SAGI和IL-2基因佐劑混合免疫誘導鼠抗弓形蟲感染的研究J.熱帶醫學雜志，2002，2(1)：1-4，15.MIYASHITA T, ARMSTRONGT D, WANG J, et al. Granulocyte macr ophage colonystimulating factor transfected vaccine for esoph ageal cancer causes regression ofsubcutaneous implants in ra ts J. J Surg Res, 2007, 137(2):194-195.張 革,汪華僑,芻E俊濤,等.AB_(1-15)多價DNAS苗的構建及其對體液 免疫的效果J.中山大學學報：醫學科學版，2005,26(4):371-376.趙 楷.病毒疫苗的研究現狀與展望J.第二軍醫大學學報，2002，23 (8):813-815.KAPOOR D , AGGARWALS R, SINGH N P, et