1、畢赤酵母實驗操作手冊【精選文檔】畢赤酵母表達實驗手冊大腸桿菌表達系統最突出的優點是工藝簡單、產量高、生產成本低。然而,許多蛋白質在翻譯后,需經過翻譯后的修飾加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等過程才能轉化成活性形式。大腸桿菌缺少上述加工機制，不適合用于表達結構復雜的蛋白質。另外，蛋白質的活性還依賴于形成正確的二硫鍵并折疊成高級結構,在大腸桿菌中表達的蛋白質往往不能進行正確的折疊，是以包含體狀態存在。包含體的形成雖然簡化了產物的純化，但不利于產物的活性,為了得到有活性的蛋白，就需要進行變性溶解及復性等操作,這一過程比較繁瑣，同時增加了成本。與大腸桿菌相比，酵母是低等真核生物，具有細胞生長

2、快，易于培養，遺傳操作簡單等原核生物的特點,又具有真核生物時表達的蛋白質進行正確加工，修飾，合理的空間折疊等功能，非常有利于真核基因的表達,能有效克服大腸桿菌系統缺乏蛋白翻澤后加工、修飾的不足。因此酵母表達系統受到越來越多的重視和利用。大腸桿菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表達系統，當前已商業化的基因工程產品大多是通過大腸桿菌表達的,其主要優點是成本低、產量高、易于操作。但大腸桿菌是原核生物，不具有真核生物的基因表達調控機制和蛋白質的加工修飾能力,其產物往住形成沒有活性的包涵體，需要經過變性、復性等處理，才能應用.近年來，以酵母作為工程菌表達外源蛋白日益引起重視，主更是因為酵母是單細胞真核生

3、物，不但具有大腸桿菌易操作、繁殖快、易于工業化生產的特點，還具有真核生物表達系統基因表達調控和蛋白修飾功能，避免了產物活性低，包涵體變性、復性等等間題1。 與大腸桿菌相比，酵母是單細胞真核生物,具有比較完備的基因表達調控機制和對表達產物的加工修飾能力，人們對釀酒酵母（Saccharomyces。Cerevisiae)分子遺傳學方面的認識最早，釀酒酵母也最先作為外源基因表達的酵母宿主1981年釀酒酵母表達了第一個外源基因一干擾素基因，隨后又有一系列外源基因在該系統得到表達。雖然干擾素和胰島素已大量生產并在人群中廣泛應用,但很大部分表達由實驗室擴展到工業規模時，培養基中維特質粒高拷貝數的選擇壓力消

4、失，質粒變得不穩定，拷貝數下降，而大多數外源基因的高效表達需要高拷貝數的維特,因此引起產量下降.同時,實驗室用培養基復雜而昂貴，采用工業規模能夠接受的培養基時,往往導致產量的下降。為克服釀酒酵母的局限，人們發展了以甲基營養型酵母（methylotrophic yeast）為代表的第二代酵母表達系統2.甲基營養型酵母包括：Pichia、Candida等以Pichia.pastoris（畢赤巴斯德酵母）為宿主的外源基因表達系統近年來發展最為迅速,應用也最為廣泛，已利用此系統表達了一系列有重要生物學活性的蛋自質。畢赤酵母系統的廣泛應用，原因在于該系統除了具有一般酵母所具有的特點外，還有以下幾個優點1

5、、2、3； 具有醇氧化酶AOX1基因啟動子,這是目前最強,調控機理最嚴格的啟動子之一。 表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩定整合.（即同源重組） 菌株易于進行高密度發酵,外源蛋白表達量高. 畢赤酵母中存在過氧化物酶體,表達的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細胞的毒害作用. Pichia。pastoris基因表達系統經過近十年發展，已基本成為較完善的外源基因表達系統,具有易于高密度發酵,表達基因穩定整合在宿主基因組中，能使產物有效分泌并適當糖基化，培養方便經濟等特點.利用強效可調控啟動子AOX1，已高效表達了HBsAg、TNF、EGF、破傷風毒素 C片段、基因工程抗

6、體等多種外源基因，證實該系統為高效、實用、簡便，以提高表達量并保持產物生物學活性為突出特征的外源基因表達系統，而且非常適宜子擴大為工業規模4。目前美國FDA已能評價來自該系統的基因工程產品，最近來自該系統的Cephelon制劑已獲得FDA批準,所以該系統被認為是安全的 Pichia.pastoris表達系統在生物工程領域將發揮越來越重要的作用，促進更多外源基因在該系統的高效表達，提供更為廣泛的基因工程產品2、3。 近年來，Invitrogon公司開發了畢赤酵母表達系統的系列產品，短短幾年已經有300多種外源蛋自在該系統得到有效表達,被認為是目前最有效的酵母表達系統. 畢赤酵母宿主菌常用的有GS

7、115和KM71兩種，都具有HIS4營養缺陷標記.其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點被ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉化方法。 Pichia.pastoris酵母菌體內無天然質粒,所以表達載體需與宿主染色體發生同源重組，將外源基因表達框架整合于染色體中以實現外源基因的表達5包括啟動子、外源基因克隆位點、終止序列、篩選標記等。表達載體都是穿梭質粒，先在大腸桿菌復制擴增,然后被導入宿主酵母細胞。為使產物分泌胞外，表達載體還需帶有信號肽序列。 畢赤酵母表達系統有多種分泌型表達質粒,有許多蛋白在

8、畢赤酵母得到了高效分泌表達。胞外表達需要在外源蛋白的N末端加上一段信號肽序列，引導重組蛋白進入分泌途徑，可使蛋白蛋白質在分泌到胞外之后獲得準確的構型。畢赤酵母對外源蛋白自身的信號序列識別能力差，在本試驗中所使用pPICZA質粒，其信號肽來自釀酒酵母的交配因子(factor)，能很好的達到以上的要求。并且作為新一代的畢赤酵母分泌表達質粒，它還擁有一個特點是其具有Zeocin抗性標記基因，給我們篩選轉化子的工作帶來很大的便利1、2。 pPICZA質粒是作為新一代的畢赤酵母分泌表達質粒，它的主要特點簡介如下： 具有強效可調控啟動子AOX1（alcohol oxidase,醇氧化酶）; 具有Zeoci

9、n抗性篩選標記基因，重組轉化子可直接用Zeocin進行篩選，即在YPDZ平板上生長的轉化子中，100都有外源基因的整合，大大簡化了重組轉化酵母的篩選過程5。在操作過程中,Zeocin也可用來篩選含表達載體pPICZA的大腸桿菌轉化子，不必另外使用Amp，經濟而又簡便；。 在表達載體A0X1 5端啟動子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位點，多克隆位點下游有A0X1 3端終止序列； 分泌效率強的信號肽factor. Invitrogen公司開發的畢赤酵母表達系統的系列產品作為目前被應用為最為廣泛的酵母表達系統,其主要的優點有：醇氧化酶可調控的強啟動子，能高密度發酵,重組蛋白表達量高。外源基因整合

10、在酵母基因組上,可以穩定存在。同時，高效分泌表達質粒能將外源蛋白表達后，進行翻譯后加工處理，將外源蛋白分泌到細胞外，不但提高表達蛋白的活性，而且，有利于產物的純化。一畢赤酵母表達常用溶液及緩沖液的配制11 各種母液的配制10YNB (含有硫酸銨、無氨基酸的13。4酵母基礎氮源培養基) 4保存.34g酵母基礎氮源培養基(無硫酸銨）+100g硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌。500*B （0。02%生物素 Biotin) 4保存 保存期為1年。20mg的生物素溶于100ml水中，過濾除菌。100H （0.4Histidine 組氨酸） 4保存 保存期為1年.400mg的L組氨酸溶于100ml

11、水中，(加熱至50以促進溶解），過濾除菌。10D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期為1年.200g葡萄糖溶于1000ml水中，滅菌15min或過濾除菌。10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期為2個月。將5ml的甲醇與95ml水混勻，過濾除菌。10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期為1年以上。將100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。100AA （0.5 of each Amino Acid，各種氨基酸) 4保存 保存期為1年。分別將500mg的L-谷氨酸、L蛋氨酸、L賴氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸溶于100ml水中，過濾除菌。1M 磷酸鉀溶液

12、（potassium phosphate buffer,pH6.0),將1mol/L的K2HPO4溶液132ml與1mol/L的KH2PO4溶液868ml混勻,其pH為6。0，如需調節pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調節pH.1.2 常用溶液及緩沖夜1.2.1 堿裂解法抽提質粒DNA所用溶液：溶液：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA,25mmol / L TrisHCI （pH 8。0)溶液：0.2molL NaOH，1 SDS（臨用時配制）溶液：29。44g KAc，11。5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。4保存.1。2.2 10 甘油

13、 （Glycerol）:將100ml甘油和900ml水混勻后,高壓滅菌或過濾除菌.保存期為1年以上.1.2。3 RnaseH2O:1ul Rnase 加入1ml 滅菌 dd H2O。4保存。1。2.4 TE緩沖液：10mmol / Tris-CI（pH 80）， lmmol / L EDTA(pH 8。0)1。2.5 STE緩沖液:0。1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl （pH 8。0)， 1mmol / L EDTA （pH 8。0）1.2.6 SCE緩沖液：1mol / L Sorbitol （山梨醇）， 10mmol / L 檸檬酸鈉 ， 10mmol / L E

14、DTA1.2。7 1M potassium phosphate buffer （pH 6。0)： 132 ml 1M K2HPO4 868 ml 1M KH2PO41.2.8 50X TAE 瓊脂糖凝膠電泳緩沖液，pH 8.0（1L)： 242 g Tris 57。1 ml Acetic Acid 37。2 g EDTA二畢赤酵母表達的培養基配制52.1 LB（LuriaBertani）培養基： Trypton l Yeast Extract 0。5 NaCl l PH 7.0制作平板時加入 2瓊脂粉。121高壓滅菌 20min。可于室溫保存。用于培養pPICZA原核宿主菌TOP10F時可加入

15、Zeocin 25ug / ml。2.2 LLB（Low Salt LB）培養基: Trypton l Yeast Extract 0。5 NaCl 0。5 PH 7.0制作平板時加入 2%瓊脂粉.121高壓滅菌 20min。可于室溫保存數月。用于培養pPICZA原核宿主菌TOP10F時,加入Zeocin 25ug / ml，可以4條件下保存12周。2.3 YPD （又稱YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養基） Trypton 2%

16、dextrose (glucose） 2%+agar 2%+Zeocin 100 g/ml液體YPD培養基可常溫保存；瓊脂YPD平板在4可保存幾個月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養基，可以4條件下保存12周。2。4 YPDS + Zeocin 培養基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：yeast extract 1%peptone 2dextrose （glucose） 2sorbitol 1 M+agar 2+ Zeocin 100 g/ml不管是液體YPDS培養基，還是YPDS + Zeocin 培養基，都必須存放4條件

17、下，有效期12周.2。5 MGY Minimal Glycerol Medium （最小甘油培養基)（34%YNB；1%甘油;4105生物素）。將800ml滅菌水、100ml的10YNB母液、2ml的500B母液和100ml的10*GY母液混勻即可,4保存，保存期為2個月.2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培養基 + 0.004%組氨酸）在1000ml的MGY培養基中加入10ml的100*H母液混勻，4保存，保存期為2個月。2。7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培養基）（含有：1mol/

18、L的山梨醇；2%葡萄糖；1。34%YNB；4*105生物素；0.005氨基酸）1.將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌；2.冷卻后于45水浴；3。將100ml的10D、100ml的10*YNB；2ml的500B；10ml的100AA等母液和88ml無菌水混勻,預熱至45后，與步驟2的山梨醇溶液混合.4保存。2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培養基 + 0.004%組氨酸）在RD培養基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。4保存。2。9 RD及R

19、DH平板的制備1.將186g的山梨醇和1520g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60水浴；2。參照RD/RDH液體培養基配制的步驟4，將100ml的10D、100ml的10*YNB；2ml的500B；10ml的100AA等母液、（10ml的100H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預熱至45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3.迅速制備平板。4可保存數月。2.10 RD及RDH 的TOP 瓊脂的制備(常用于酵母菌的包被）1。將186g的山梨醇和7。510g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻后于60水浴；2.參照RD/RDH液體培養基配制的步驟4，將100ml的10D、100ml

20、的10YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液)和88(78）ml無菌水混勻，預熱至45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3.將該TOP瓊脂置于45水浴冷卻、保溫,備用.2.11 MD與MDHMinimal Dextrose Medium +(Histidine） 最小葡萄糖培養基 +( 0.004 %組氨酸）（含有：1。34YNB；;4*10-5 生物素;2%葡萄糖)1。100ml的10YNB；2ml的500B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可;2。如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可;3。如

21、配制平板，可無菌水的滅菌前，加入1520g的瓊脂。4可保存數月。2。12 SOC培養基： Trypton l Yeast Extract 0。5 NaCl 0.05 Glucose （1mol / L） 2%121高壓滅菌 20min,冷卻后，4保存三主要試驗環節的操作3。1 酵母菌株的分離純化 接種GS115于5ml YPD液體培養基,30,200rpm振蕩過夜，涂布 YPD平板，30培養48 小時,用 YNB基本培養基和含His的補充培養基作點種分離純化，挑選在補充培養基生上生長而在基本培養基上不生長的單菌落劃YPD平板，4保存。3。2 pPICZA原核宿主菌TOP10F的活化培養TOP1

22、0F做為菌種保存在70 條件下，在進行擴大培養抽提質粒之前,先要進行活化培養。接種TOP10F于5ml LLB(加入25ug / ml Zeocin)中，37，200 rpm ,培養1618小時。3。3畢赤酵母表達的試驗方法3.3。1線狀質粒DNA的脫磷酸化處理 為了防止載體質粒DNA的自身環化，用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理酶切后的質粒DNA，具體操作如下： 建立反應體系：線性化的質粒 35ul 10x CIP buffer 4ul CIP 1ul ddH2O 5ul -total 45ul 在PCR儀上控制反應溫度(加石蠟油封閉），37,15 min ；50，15 min;56,30 m

23、in（滅活）。 在56未開始前停止，加入proteinse K ，用于滅活CIP,加入試劑如下：反應物 45ul10x 5 SDS 7ul10x EDTA (pH 8.0） 7ulproteinse K 5ulddH2O 6ul - total 70ul 純化使用QIAquick spin kit ,按照2.2.3.3步驟進行，20 ul 滅菌ddH2O洗脫純化產物。進行1瓊脂糖凝膠電泳,120 V, 觀察純化結果,并大約估計DNA濃度.3。3。2 E.coli TOP10F 感受態細胞的制備及轉化 取10 ul TOP10F 菌液,接種于 200ml LB液體培養基中活化培養，37 ,200

24、 rpm，1618小時.取100 ul菌液接種于 200 ml 液體LB培養基中。 37 ，200 rpm，培養1618小時。 滅菌500 ml 離心管，4，4000 rpm，20 min 。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10甘油重懸并洗滌.重復洗滌3次。 第三次離心后,棄絕大部分上清，留下約1ml 液體用于重懸菌體。 從制得的感受態細胞中，取200 ul于滅菌EP管中，加入連接反應產物 5ul ，混勻，不要產生氣泡，在冰上放置 5 min。 將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。 使用電擊穿孔儀進行轉化,設置為 電壓 2500 V,時間 5 ms. 電擊后,往電擊杯中加入 800ul SOC培養

25、基,沖洗出菌體，轉移至滅菌1.5 ml EP管中。37，150 rpm ，輕搖4560 min。 取全部均勻涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLBZeocin平板上，正放，待涂布液不在流動，37 培養1216小時.*注:設空載體做對照。3.4 畢赤酵母電轉化方法3。4。1 菌體的準備:1。挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養基的50ml三角瓶中，30、250300r/min培養過夜；2。取100500l的培養物接種至含有500ml新鮮培養基的2L三角搖瓶中,2830、250300r/min培養過夜,至OD600達到1。31.5;3。將細胞培養物于4，1500g離心5min，

26、用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；4.按步驟3離心，用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；5。按步驟3離心，用20ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸;6。按步驟3離心,用1ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5ml；7。備注：可將其分裝為80l一份的包裝冷凍起來，但會影響其轉化效率（2周之內）。3.4。2 電擊轉化：8.將520g的線性化DNA溶解在510l TE溶液中，與80l的上述步驟6所得的菌體混勻，轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中；9。將電轉化杯冰浴5min；10。根據電轉化儀提供的資料，參考其他文獻及多次摸索,確定合適的電壓

27、、電流、電容等參數，按優化的參數，進行電擊；11.電擊完畢后，加入1ml冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻,轉至1.5ml的EP管中；12.將菌體懸液涂布于MD或RDB平板上，每200600l涂布一塊平板；13.將平板置于30培養，直至單個菌落出現.推薦：電壓1.5kV；電容25F;電阻200.電擊時間為410msec。3。5 Pichia酵母表達直接PCR鑒定重組子的方法3.5。1 模板的處理:1。平板上的菌落長到肉眼可見時（約12小時）；2.將除了模板之外的其它PCR反應液的組分準備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可

28、以鑒定非定向克隆的方向）；3.用半根滅菌的牙簽（節約，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下,放入一個滅菌的1.5毫升離心管，對PCR管和1。5毫升離心管編號；4。PCR擴增,1 agarose電泳；5.對于PCR擴增顯現特異性條帶的克隆，把置于1.5毫升離心管中的半截牙簽扔到5毫升YPDZ培養基中，30度培養,812小時后提質粒，酶切鑒定確認。 注意:本試驗方法應用在需要挑取的克隆較多（也就是克隆效率低），使用PCR初篩可以使工作量大為降低.3。5。2 PCR反應體系: 以TaKaRa Taq DNA聚合酶反應為例：組分50l體系20l體系10xReaction Buffer5。0l2.0l

29、25mmol/L MgCl23.0l1.2l2。5mmol/L dNTPs5.0l3.0lPrimer 1(10mol/L)2.5l1.0lPrimer 2（10mol/L）2.5l1.0lddH2O31。5l12。6lTaq DNA聚合酶0.5l0.2lTOTAL50。0l20。0l3。5.3 PCR反應條件:初始變性94 4min變性94 30s34個循環退火5054 30s延伸72 30s結束延伸72 10min保存43.6 畢赤酵母基因組提取方法 接種重組和空質粒轉化子于5ml YPDZ培養基, GS115菌于YPD培養基作對照，30，培養1618小時. 室溫下，1500 g離心510

30、min收集菌體 100 ulTE（pH 7。0）重懸，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M TrisHCl，3 ul-巰基乙醇，1ul Lyticase ，37水浴30 min。 10000g離心510min，取沉淀，加90ul TE重懸。 200ul 飽和酚，200ul氯仿,混勻,離心30s ,取上層水相。 加入兩倍體積無水乙醇以及1/10體積的NaAC，20放置30min； 10000g離心20min，棄上清；75乙醇漂洗沉淀一次; 干燥后，加入15 l的TE或H2O溶解，-20備用.3。7 Mut+表型重組酵母的誘導表達實驗1. 挑選一單菌落，置于裝有25ml MGY、

31、BMG或BMGY培養基的250ml搖瓶中，于2830C/250-300 rpm培養至OD600 = 26 (1618 h）；2. 室溫下15003000g離心5min，收集菌體，用MM、BMM或 BMMY重懸菌體，使OD600 =1.0左右（約100200ml)；3。 將步驟2所得的菌液置于1L的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30C/250300 rpm的搖床上繼續生長;4. 每24h向培養基中添加100 甲醇至終濃度為0.51.0%；5. 按時間點分別取菌液樣品,取樣量為1ml，置于1。5ml EP管中，最大轉速離心23min,分別收集上清和菌體,分析目的蛋白的表達量和菌液最佳

32、收獲時間。時間點一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h;6. 對分泌表達,分離樣品的上清液；對胞內表達，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測樣品用液氮或干冰速凍后,于80C保存備用；7. 可以用SDSPAGE、Western-Blot及活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達。3。7 Muts表型重組酵母的誘導表達實驗1。 挑選一單菌落，置于裝有25ml MGY、BMG或BMGY培養基的250ml搖瓶中，于2830C/250-300 rpm培養至OD600 = 26 (1618 h）；2。 室溫下15003000g離心5min，收集菌體，用1/5到1/10原培養體積的MM、BMM或 B

33、MMY重懸菌體(約1020ml）；3。 將步驟2所得的菌液置于100ml的搖瓶中,用雙層紗布或粗棉布封口,放置于2830C/250-300 rpm的搖床上繼續生長；4。 每24h向培養基中添加100 甲醇至終濃度為0。51.0；5。 按時間點分別取菌液樣品，取樣量為1ml，置于1。5ml EP管中，最大轉速離心23min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間。時間點一般取：0、24、48、72、96和120h;6。 對分泌表達,分離樣品的上清液；對胞內表達，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測樣品用液氮或干冰速凍后,于80C保存備用;7。 可以用SDSPAGE、Western-Bl

34、ot及活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達.四 試驗的注意事項4.1信號肽識別位點的設計 以質粒pPICZA為例。在利用PCR反應在外源基因兩端引入酶切位點的試驗中.如果質粒pPICZA雙酶切中丟失了KEX2蛋白酶的酶切位點LysArg，應該在上游中，增加了編碼Lys、Arg的密碼子AAA、AGA .酵母細胞膜中中的KEX2蛋白酶是-factor信號肽的切割酶，它能有效識別酶切位點LysArg，通過對信號肽的切割使基因表達產物釋放至胞外。4.2 PCR產物酶切保護堿基的設計 利用PCR轉換酶切位點，通過P3、P4兩引物的擴增在rhEGF的兩端加上Xho、Xba的識別位點和5個保護堿基。根據限制性核

35、酸內切酶的工作原理，內切酶首先需要結合到核苷酸序列上,并在上面進行滑行,直至識別到酶切位點，為了能使內切酶有效的結合到序列上以利于其的有效加工。在利用PCR進行酶切位點轉換的時候,通常應在5端限制酶位點外再加3個保護堿基GC6,防止引物合成中因為合成效率和純化問題而導致的酶切位點的殘缺。核苷酸保護堿基之為了保證限制型內切酶的工作效率,在其識別位點的兩側應該保證一定的旁側序列，換言之,識別位點是限制型內切酶識別并特異性切割底物的必要而不充分的條件。鑒于NEB(New England Biolabs)公司在限制酶領域的總體研究水平和對保護堿基方面的獨到理解,在設計引物時可以參照NEB公司的產品目錄

36、后面的附錄:Cleavage to the end of DNA fragments進行7，但是，一些不常用的酶或雖有推薦的保護堿基序列但酶切效率仍不高的酶還是很難設計保護堿基。本次實驗中，根據美國基因動力實驗室文獻的報道8；XbaI、NheI和SpeI位點5端保護堿基須在5個左右才容易被酶切割，以及一些前人的經驗總結,我們在設計引物時在識別位點5端，設計了5個保護堿基。以保證較高的酶切效率。4。3高保真DNA聚合酶的使用 Vent DNA聚合酶是從高溫嗜熱菌中分高出的高保真（High Fidelity）耐高溫 DNA聚合酶,能糾正 DNA擴增中產生的錯誤，而傳統的Taq DNA聚合酶，Tth

37、 DNA聚合酶及其變體 AmpliTaq，KlenTaq等都無3至5糾錯功能，因此在擴增時出現堿基錯配的機率為 2。1x104。這對于大批量的PCR產物而言，并不是十分嚴重的問題，因為又同樣錯誤的DNA分子僅占全部合成的DNA分子群體的極少一部分。但是，如果PCR擴增的DNA片段是用于分子克隆,那么這就是件值得重視的事情，因為此種分子含有一個或數個錯誤摻入的核苷酸,那么在該克隆中的所有克隆DNA都將帶有同樣的“突變”。將會導致嚴重的后果9.具有校正功能的 DNA聚合酶還有Pfu，Deep Vent，Pwo，UlTma等，Pfu是其中出錯率最低的，比Taq DNA聚合酶低10倍.在本論文中，為了

38、減少hEGF 在 PCR過程的錯誤擴增，在人工合成hEGF的過程中使用了Vent DNA聚合酶.隨著PCR技術的不斷發展成熟(擴增長度、保證性、產量和特異性等）,質粒構建過程的大多數細胞內的DNA復制將被PCR這一細胞外的DNA復制所代替，質粒構建效率將有質的飛躍。4。4密碼子的偏好性的原則 酵母菌對外源基因的表達也和外源基因密碼子的選用有關。了解表達系統宿主在密碼子使用上的偏愛性對從翻譯水平分析外源基因表達的規律有重要意義，也為改造外源基因或改造宿主細胞提供依據10、11。4.5線性化及采用電轉化的原因:在pPICZA-EGF電轉整合入GS115的時候，因為需要比較高的轉染率，我們對其用限制

39、性內切酶Sac進行線性化的處理。細菌內同源重組被認為是重組質粒構建過程的難點。因為未線性化的環狀質粒之間發生同源重組的幾率非常低，所以重組轉移載體必須用特定的限制性內切酶進行線性化處理。這種處理的目的： 防止隨機插入重組時質粒在功能區斷開,造成目的基因表達失活； 讓同源重組以指定的方式發生。4。5 乙醇沉淀法的問題主要步驟如下：1）酶切體系（80ul）中2倍體積的無水乙醇加1/10體積的PH5。2 NaAC，混勻2)-20 20分鐘沉淀3）13200rpm，20min,離心后棄上清4)75%乙醇300ul輕輕洗，同上離心5min,棄上清5）37度烘箱至無乙醇氣味（或是用搖床的出風口吹出的暖風吹

40、）。6）20ul ddH2O重溶如果想提高轉化效率,可以稍微做一些改進:1。 還是用酚抽一下，去除內切酶；2。 75%乙醇應洗兩遍，盡可能去除鹽離子,防止電轉化杯被擊穿,同時可提高效率；3。 在沉淀時，如用終濃度2。5M的醋酸鈉+2。5倍體積的無水乙醇，可沉淀幾乎所有的DNA,但需要用75的乙醇認真的洗兩遍。4.6 酶切的總結影響重組質粒構建效率的最關鍵步驟在于酶切，不管是否是定向克隆還是非定向克隆。酶切的關鍵在于切干凈，徹底的酶切反應是成功的一半,特別是載體的酶切，尤其是雙酶切。 雙酶切一般是先反應低鹽buffer的、后反應高鹽buffer的,如果低鹽buffer的酶在高鹽buffer的酶的反應條件下有低活性(一般來講在NEB的手冊上都有標示），最好就先純化(酚/氯仿抽提、乙醇沉淀）過,再進行第二次酶切反應.注意：有相同功能（如：切同一序列，并產生相同末端）的酶，不一