1、質粒圖譜大全質粒圖譜大全（轉載）1 .九種表達載體Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA2 .克隆載體pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS()L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD9263 .PET系列表達載體ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p

2、ETDsbFusionSystems39band40bProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETExpressionSystem33bProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETExpressionSystemsProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETGSTFusionSystems41and42Pr

3、oteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETNusAFusionSystems43.1and44ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?S trep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表達載體TEcoR?pGEX-1I/BAP pGEX-2T pGEX-2TK pGEX-3X pGEX-4T-1 pGEX-4T-2 pGEX-4T-3 pGEX-5X-1 pGEX-5

4、X-2 pGEX-5X-3 pGEX-6P-1 pGEX-6P-2 pGEX-6P-3五.PTYBsystem PTYB1PTYB2PTYB11 PTYB12六.真核表達載體 pCDNA3.1(-) pCDNA3.1()pPICZalphaApGAPZ APYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何閱讀分析質粒圖譜載體主要有病毒和非病毒兩大類，其中質粒DNA 是一種新的非病毒轉基因載體。一、一個合格質粒的組成要素復制起始位點Ori?即控制復制起始的位點。原 核生物DN粉子中只有一個復制起始點。而真核 生物DN粉子有多個復制起始位點。抗生素抗性基因可

5、以便于加以檢測，如Amp ?,Kan多？克隆位點MCSE：隆攜帶外源基因片段P/E?啟動子/增強子Terms終止信號？加poly (A)信號？可以起到穩定mRN徘用八如何閱讀質粒圖譜 第一步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型(原 核/真核/穿梭質粒)第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么 篩選標記。(1)Ampr水解3內酰胺環，解除氨芳的毒性。(2) tetr可以阻止四環素進入細胞。(3) camr生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。(4) neor (kanr)氨基糖甘磷酸轉移酶使 G418(長那霉素衍生物)失活(5) hygr使潮霉素3失活。第三步：看多克隆位點(MCS 。它具有

6、多個限 制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在 這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志 基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基 因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNAif入片段大小。質粒一般 只能容納小于10Kb的外源DNAt段。一般來說, 外源DNAt段越長，越難插入，越不穩定，轉化 效率越低 第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子一核 糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號。 這是 用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入 一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選 用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。啟動子一核糖體結合位點一克隆位點-轉錄終 止信號啟動子一促進DNA專

7、錄的DNA版序，這個DN嶇 域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA+ 子上可以與RNApol特異性結合并使之開始轉錄 的部位，但啟動子本身不被轉錄。？增強子/沉默子-為真核？基因組（包括真核病毒 基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的 調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無 關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。 /沉默子一負增強子，負調控序列。核糖體結合位點/起始密碼/SD序列 （Rbs/AGU/SDS : mRNAt核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和SD序 列。？轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA勺

8、保 守序列）此位點down stream有一段GT或T富 豐區）這2部分共同構成poly （A）加尾信號。結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA的保守序列）此位點down stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly （A）加尾信號。？回答有人之前提出的一個問題：為什么質粒圖譜 上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代 表兩條DNA連，即質粒是環狀雙鏈 DNA它的啟 動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一 條鏈上.三、介紹一下關于載體的知識（雖然課本上都有 寫）1 .什么是載體即要把一個有用的基因（目的基因一一研究或應 用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體 細

9、胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基 因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體(vector )P.S.基因工程所用的vector實際上是DN冊子,是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的 DNA2 .載體的分類按功能分成：（1）克隆載體都有一個松弛 的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制 擴增。它是用來克隆和擴增DNAt段（基因）的 載體。（所以有時實驗時擴增效率低下，要注意 是不是使用的嚴謹行載體）（2）表達載體具有克隆載體的基本元件 （ori,Ampr,Mcs等）還具有轉錄/翻譯所必需的DNA版序的載體。按進入受體細胞類型分：（1）原核載體（2） 真核載體（3）穿梭載體（sbuttle

10、vector ）指在 兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運 載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）.P.S.穿梭質粒含原核和真核生物2個復制子，以 確保兩類細胞中都能擴增。3 .基因工程載體的3個特點：（一）都能獨立自主的復制：載體DN份子中有 一段不影響它們擴增的非必需區域，如 MCS插 在其中的外源DNM段，能被動的跟著載體一起 復制/擴增，就像載體的正常成分一樣。(二)都能便利的加以檢測：如載體的藥物抗性 基因，多是抗生素抗性基因，將受體細胞放在含 有該抗生素培養板上培養生長時，只有攜帶這些 抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。(三)都能容易進入宿主細胞中去，也易從宿主 細胞中分離純

11、化出來。4 .載體的選擇和制備：選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體 中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是 要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載 體。載體選擇主要考慮下述3點：【1】構建DN履組體的目的，克隆擴增/表達表 達，選擇合適的克隆載體/表達載體。【2】.載體的類型：(1)克隆載體的克隆能力一據克隆片段大小(大 選大，小選小)。如10kb選質粒。(2)表達載體據受體細胞類型一原核/真核/穿 梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。(3)對原核表達載體應該注意3點：選擇合適的啟動子及相應的受體菌；用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位；表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考O【3】載體MC滸的酶切位點數與組成方向因載 體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不 產生閱讀框架錯位。選用質粒（最常用）做載體的4點要求：選分子量小的質粒，即小載體（1 1.5kb）一 不易損壞，在細菌里面拷貝