1、克隆形成實驗細胞生長狀況有關指標的檢測方法一、細胞計數 這是細胞培養中常用的基本技術之一。所用材料為血球計數板，巴氏吸管和顯微鏡。細胞計數的基本步驟：(1) 取清潔計數板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕拭干 . 取細胞懸液0.3mL,加入0.9mL結晶紫(或臺盼至)染液，混勻后滴半滴于血球計數板內，以充滿不外溢 為宜。也可直接將細胞懸液在一側滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過少或出現氣泡.(3)在顯微鏡下用10X物鏡觀察計數四角大分格中的細胞數。代入下式得出細胞密度。細胞數/ml=(4大格細胞數之和/4) X104端釋倍數臺盼藍染色法可計算出活細胞數和死細胞數以測定細胞存活百分率。一般0.5%1%勺

2、臺盼藍染液可使死細胞染成藍色，活細胞不著色。此外還可用0.02%的藻紅 B 染液將死細胞或受損細胞染成紅色，或用 0.05%的苯胺黑染液將死細胞染成黑色。細胞存活百分率=(4大格活細胞數/4大格活細胞+死細胞數)X100% 細胞計數除用上述方法外，目前還有新型的自動計數儀，可供大規模細胞計數工作使用。各種型號的計數 操作不盡相同，可根據使用說明進行操作。在進行細胞計數操作時，必須把細胞懸液準備好，細胞應分散良好，并充分混勻，若出現較多細胞團或細胞數少于200個/10mm2或多于500個/10mm2時，需重制細胞懸液，重新計數。二、細胞生長曲線和生長倍數細胞生長曲線是細胞培養實驗中最基本的指標，

3、是測定細胞絕對增長數值和生長繁殖基本規律常用的簡便 方法。常用的方法為：在同一規格的培養瓶中，接種同等量的同一代細胞，經培養后每隔24小時取出幾瓶細胞進行計數，以培養時間為橫座標，不同時刻的細胞數的對數為底座標，標出各點并連成線，即為該細 胞的生長曲線，可反應出細胞生長的動態。測定生長曲線的另一種方法是用96 孔/24 孔細胞培養板，分 7 組，每組 3 孔，培養一周 (7 天) ，期間逐日檢測一組，計數，最后把 7 天中的細胞數值繪成圖，即為細胞生長曲線。也可采用MTT法來進行生長曲線測定，較上述方法簡便。標準的細胞生長曲線近似 S形，一般在傳代后第一天細胞數有所減少，經過一段時間的潛伏期，

4、再進入對 數生長期，達到平臺期和生長穩定，最后衰老。細胞生長倍數是指測定接種時活細胞的濃度，經一個生長周期達到最大活細胞濃度的比率。生長倍數 =培養后最大活細胞濃度 /接種時的活細胞濃度三、細胞分裂指數細胞分裂指數是表示細胞增殖旺盛程度的指標。它以被測 1000個細胞中的分裂細胞數來計算。其方法為： 用秋水仙素將細胞處理 1 2小時后，按染色體制片法制片并染色，計算 1000個細胞中分裂相的數目，重 復4 次取平均值，用百分比表示?；静襟E：(1) 細胞準備 用蓋片 (支持物 ) 培養法。(2) 每24小時取出一個小玻片，按常規方法進行固定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標本。(3) 顯微鏡

5、下選擇細胞密度適中的區域觀察分裂細胞并計數。 逐個視野進行， 對每一時間組的玻片各取細胞 多、中、少 3 個區域各一區，共數 1000個細胞，計算出平均分裂相值所占百分比。觀察時要掌握好分裂相 標準，主要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以減少誤差。細胞分裂指數=細胞分裂相數/細胞總數(1000) X1000四、細胞接種存活率細胞接種存活率又稱細胞貼壁率。它是細胞被制成分散的懸液后，以低密度（25個細胞/cm2）被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細胞小群（克?。┑募毎俜謹抵担靡员硎炯毎纳婺芰图毎旱幕盍?。 基本步驟：（1 ）取對生長期細胞，用消化法制成細胞懸液，計數后按檢

6、測細胞生長曲線的接種細胞的原則，將細胞接 種于培養瓶（濃度相對高些）。接種1215瓶。（2 ）每2小時取出一瓶細胞，倒掉培養液，然后加入胰酶消化已貼壁細胞，計數已貼壁細胞，用下面公式 逐個計算每個時間上的貼壁率。每2小時一次，共觀察 24小時即12。接種存活率（貼壁率）=（貼壁存活細胞數/接種細胞數）X100%五、克隆形成率細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形 成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞

7、系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種 密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續一 周，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養。1、平板克隆形成試驗基本步驟：（1）取對數生長期的單層培養細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養液中備用。（2）將細胞懸液作梯度倍數稀釋， 以適當的細胞密度（根據增殖能力）接種于培養皿中。一般分每皿50、100、 200個細胞的梯度密度分別接種含 10mL37C預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。

8、置37C 5% CO2及飽和濕度的環境下，靜置培養 23周。經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量 Giemsa應用染色液染1030分鐘，然后 用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。（4）將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數大于10個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。克隆數克隆形成率=X100%接種細胞數平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是 細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好

9、，不能有細胞團，接種密度不能過大。2、軟瓊脂培養克隆形成試驗基本步驟：（1）取對數生長期細胞，用 0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用含20%|臺牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至 1 X106細胞/L。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。（2）用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40C中不會凝固。（3）按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2 XDMEM培養基（含有2X抗生素和20%的小牛血清）混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中（10cm平皿加710mL），冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2XDME培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液， 充分混勻，注入鋪有 1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37C 5%CO2溫箱中培養1014天。(5) 把平皿放置在倒置顯微鏡下，