1、人類EGF速因突變熒光PCR檢測試劑盒說明書人類EGFR基因突變熒光PCR檢測試劑盒說明書【產(chǎn)品名稱】通用名稱:人類"盧夫基因突變熒光PCR檢濡試劑盒英文名稱:Shuwt'n1HumanEGFRGvncMutationDetectionKitfwrRcal-limcPCR【包裝規(guī)格】7測試/盒【預期用途】EGFR是一種細胞膜表面的糖蛋白受體,具有解氨酸激酶Kinase,TK）活性，是原癌基因七4出口（HER-1的表達產(chǎn)物*EGFR的主要信號轉導途徑有tPI3K-PDK通路，RAS-RAF-Mfr：K-KRK-MAiJK通路，PLOy通路，JAK-STAT通路口通過這些途徑，將

2、胞外信號轉化為胞內信號，從而有數(shù)應對外界的信號剌激,調節(jié)細胞的生長、增殖、分化,抑制細胞的凋亡.EGFR異常調節(jié)通過多種機制促進細胞惡性轉化.包括受體的過度表達、突變、生長因子受體自分泌環(huán)的活化以及特定的磷酸酶失活其中涉及腫瘤發(fā)生和進展的機制中最常見的是EGFR的基因突變和過度表達.EGFR基因位于7號柒色體短臂7|1區(qū)14區(qū)，由2H個外顯子組成中其突變主要發(fā)生在EGF#酪氨酸激酶的ATP結合位點的編碼區(qū)（第1%20外顯子），研究表明，EGFR酷氨酸激幅抑制劑（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可普尼等）療效與五仃F*基因的突變有密切的相關性*目前已經(jīng)報道大約有軸種突變與吉非替尼的藥物反應相關，主要是

3、以外顯子上的缺失突變和21外顯子上的L85XR的點突變.外顯子網(wǎng)上747-750位氨基酸的大約油種缺失約占所有突變的45%,其中吸兩種次IEM6-A750Q2352249加115和2235_W50ckl15）最為常見，占到外顯子19缺失總數(shù)的75%：外顯于"上L858R的點突變占所有突變的45%左右*外顯子18的3種點突變（G7WX）約占5%:外顯子加的突變占1%左右口另外研究發(fā)現(xiàn)外顯子20上的T7KM突變與酷氨酸激酶抑制劑藥物的耐藥性相關，本試劑盒以腫瘤DN*為檢刑樣本，提供基因突變的定性檢測.本試劑盒僅為臨床醫(yī)生腫瘤靶向治療藥物的選擇提供參考，具體臨床應用時須結合實際情況進行判斷

4、，不能以本試劑盒檢測結果作為臨床診斷的唯一依據(jù).【檢測原理】本試劑盒結合特異性引物和丁叫Man探針技術，用實時熒光PCR方法檢泅RN.4樣品中的£守尸片突變基因,利用特異性引物對突變靶序列進行擴增，同時阻滯野生型的擴增，通過T叫Nhm探針對擴增產(chǎn)物迸行撿測，使得突變基因得到擴增而野生型基本不擴增.從而達到高檢測特異性和高靈敏度口E主要組成成分】本試劑盒具體包含組分如表1表1編號組分份數(shù)體積01L）119JJM檢測反應液1150219-DcI（2）檢測反應液11503S76M檢測反應液1ISO41（Hns檢測反應液11505T790酎檢測反應液11506L85XR檢測反應液11507L

5、861Q檢測反畫液1150NG7I9X檢利反庖液1150外控槍測反應液1)50r-Taq酶130陽性對照DNA11011無菌超純水1500E儲存條件及有效期】避光，-2（FC以下保存，避免反復凍融（不要超過5次）,有效期6個月.【適用儀器】ABI7300,ABI7500,ARABIStepOnc,ABIStcpOnvPhis,Rwtar-Gcn<'Q【樣本要求】本試劑盒可以檢測從新鮮組織及FFPE組綱中提取的INA,DNA質量及濃度彩響檢測的特異性和靈敏度。DNA的質量與樣本保存時間、樣本組成、口號為提取方法密切相關：而且所采集的臨床樣本中正常組織細胞的混雜程度也不同.因此對樣本

6、做如下要求；K新鮮標本的制備過程中，術后標本取下后應立即放入-卻C以下冰箱中保存*石蠟包埋組織制備過程中，術后標本應在I個小時內放入1U膝中性緩沖福爾馬林溶液中固定，用量應為組織塊的4gl倍，固定時間應在6T8小時之間；2 .新鮮組織樣本，要確保含有腫描細胞大于1%，盡量減少正常組織.間質及壞死組織.推薦使用商業(yè)化試劑盒提取DNA（AXVGEN,QIAGE、等公司產(chǎn)品）。提取的DN.4用分光光度計檢測DNR苑度.A260/A280在1.6.工口之間，如果不能立即檢測請置于40t保存中狷FFPE組取樣本，要確保含有腫瘤印胞,盡量去除壞死組織及石蠟邊緣，推薦使用商業(yè)化試劑盒提取DNA（QAampD

7、NAFFPETUsueKit）.提取的IN人用分光光度計檢測DMA純度，X26WA2Ho在L6-L0之間，如果不能立即檢到謂置于保存.FFPE組織樣本保存年限尚未超過3年0看、樣本切片規(guī)格要求為:橫切面面積至少6mnix6mni,厚度附吟3片，如果切片面積小清適當增加切片數(shù).最終提取的DNA用IDO1*L】OOnL水溶解.分光光度計檢測儂度后，稀釋或濃能成5-10n/NL&【檢驗方法】本試劑盒可以進行S人份的檢測反應，井為每個樣本額外提供一個參照基因擴增反應，用于估測樣本實際DNA的濃度，建議每批次實驗都檢前一個陽性對照作小iti¥<?ent）和一個無模板陰性對照ETC

8、L建議根據(jù)實驗條件進行分區(qū)操作，如樣品處理區(qū)，反應液配制區(qū)等，具體操作步驟如下L將試劑就中所有組分冰上融化,渦旋混勾并短替離心，放置于冰上口注意：試劑盒中的所有試管在開蓋前均應短哲離心，以免粘在管口或管蓋上的試劑在開蓋時被污染*I3 .每批實驗根據(jù)特檢測樣本數(shù)、一個陽性對照、一個陰性對照，同時計算并分別配制1-8號反應液.每個反應液所需反應數(shù)=特測樣本數(shù)+2（一個陽性對照、個陰性對照）.而每個反應所需反應液l*7pL*需r-Taq酶0J/L,即從14號反應液中分別取（1*7式反應數(shù)）于對應編號的L5EP管.再分別加入（0.3k反應數(shù)）pL的r-T叫酶.注意；由于取樣誤差，請根據(jù)情況適當多配置0

9、J個反應即可/工將配制好的混合液輕輕充分混勾，并按照每管2卯L分裝到每個PCR反應管中。4 .然后向每個反應管中加入加L待檢泅DNA,或陽性參照,或水（試劑盒提供），待檢測樣本最佳濃度范圍為511K加叫單L,即每個反應管中有效DN*總量為255所即5 ,短將離心消除反應管中的氣泡.將PCR反應管放入PCR儀口樣本在PCR反應板中的布局可蓼見表2表工建議布局突變19-del(1)19-del(2)S768I20-InsT790ML858RL861QG719X外控1樣品1樣品1樣品1樣品1樣品1樣品1樣品1樣品1樣品12樣品2樣品2樣品2樣品2樣品2樣品2樣品2樣品2樣品23樣品3樣品3樣品3樣品

10、3樣品3樣品3樣品3樣品3樣品34樣品4樣品4樣品4樣品4樣品4樣品4樣品4樣品4樣品45樣品5樣品5樣品5樣品5樣品5樣品5樣品5樣品5樣品56STDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTDSTD7NTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTCNTC1.打開操作軟件，設置PCR擴增程序為19-del(1)19-del(2)S768I20-InsT790ML858RL861QG719X陽CT<28CT<28CT<3CT<2CT<28CT<2CT<2CT<28性0889陰CT>28CT>28CT>3CT>2CT>2

11、8CT>2CT>2CT/8性0889Stagel:95c5minStage2:95c20s,57c32s,5個循環(huán)Stage3:95c20s,60c32s,40個循環(huán)收集FAM信號注：如果使用ABI定量PCR儀，將"PassiveReference's"None,“reported:置為“FAM ,"quenche暇置為"TAMRA檢測結果判定:1. 當樣品CT值大于或等于陰性臨界值時，則該樣品為陰性或低于本試劑盒的檢測下限。2. 當樣品CT值小于陰性臨界值時，則該樣品為陽性。表3結果判定【實驗結果的解釋】1. 閾值設定：針對ABI7

12、500機型，對以上9種檢測分別設定閾值，其中19-del(1),19-del(2)和G719X閾值設定為12000,其他為300002. 陰性無模板空白對照(NTC)應無擴增曲線升起；否則表明此次實驗結果無效，建議更換操作環(huán)境或反應試劑，重新試驗。(若只稍稍升起，但對結果判斷無顯著影響，則結果依然有效)3. 陽性對照Ct值一般小于25,參照基因體系的陽性對照CT值一般小于23,但須根據(jù)儀器型號等情況進行判斷。4.CT值確定：建議對于一個突變檢測體系應同時選擇參照基因反應管,STD反應管，NTC和樣品反應管，一并劃定閾值，從而得到外控CT值和樣品的突變CT值5.參照基因CT值應控制在23之前，以

13、用于評估反應體系中的DNA模板量。若外控CT值大于23,說明加入的DNA含有PCR抑制劑或DNA加入量太少，需重新提取或增大DNA加入量再做。(僅對全陰性結果而言；若已經(jīng)判斷為陽性，結果仍然可靠)附表:突變外顯子堿基變化CosmicID對應檢測體系E746_A750del(1)192235-2249del1562231號反應體系19-Del(1)E746_A750del(2)192236-2250del156225L747_P753>S192240-2257del1812370E746_T751>I192235-2252>AATdel1813551E746_T751>A

14、192237-2251del1512678E746_S752>D192238-2255del186220L747_A750>P192238-2248>GCdel1112422L747_T751>Q192238-2252>GCAdel1512419L747_E749del192239-2247del96218L747_T751del192239-2253del156254L747_S752del192239-2256del186255L747_A750>P192239-2248>Cdel1012382L747_P753>Q192239-2258&g

15、t;CAdel2012387L747_T751>S192240-2251del126210L747_T751del192240-2254del1512369L747_T751>P192239-2251>Cdel1312383E746_T751del192236-2253del18127282號反應體系19-Del(2)E746_S752>A192237-2254del1812367E746_S752>V192237-2255>Tdel1912384S768I202303G>T62413號反應體系S768IH773_V771insH202319-2320insCAC123774號反應體系20-InsD770_N771in