1、CpG ODN增強乙肝疫苗免疫反應的研究                    作者：戴帆，董斌，郭曉磊，石碧珠，方麗娟，莫家琳，田素娟，孟民杰  【摘要】  目的 研究人工合成的CpG ODN對乙肝表面抗原的免疫增強效應，評價CpG ODN的佐劑效應。方法 將不同劑量特定的CpG ODN與乙肝表面抗原聯合免疫小鼠，用ELISA檢測小鼠乙肝表面抗體的滴度。結果 CpG ODN聯合乙肝表面

2、抗原免疫小鼠，在短期檢測中，高劑量組能較快的達到檢測閾，各劑量組間抗體滴度檢測值差異有顯著性(P<0.05)，在長期檢測中，各劑量組間抗體滴度檢測值差異有顯著性(P<0.05)，檢測值隨CpG劑量的增高而增大。結論 CpG ODN增強乙肝表面抗原的免疫反應短期和長期都具有劑量效應。 【關鍵詞】  CpG ODN 乙肝表面抗原 免疫佐劑 體液免疫 Abstract:Objective To investigate the effects of immunological enhancement of HBsAg with synthetic CpG oligodeoxynu

3、cleotides,evaluate the adjuvant effect of CpG ODN. Methods Mice were vaccinated with CpG oligodeoxynucledtides and HBsAg at different doses,and then titers of HBsAb in the blood serums of mice were detected with ELISA. Results CpG ODN and HBsAg immunize the BALb/c mice,the high?dose group could be d

4、etected quickly in shot term,the levels of antibodies in groups which use different doses of CpG ODN and HBsAg were different in statics(P<0.05),in long term the levels of antibodies in groups which use different doses of CpG ODN and HBsAg were different in statics(P<0.05),the levels of antibo

5、dies were corresponded with the levels of CpG ODN (P<0.05).Conclusion The immunological effect of HBsAg was enhanced with CpG ODN as adjuvant in short and long terms. Key words:CpG ODN; HBsAg; immunoadjuvant; humoral immunity CpG基序是一種具有非特異性免疫刺激能力的DNA序列，為非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸重復序列。CpG ODN (unmethylated C

6、pG motif?based oligodeoxynucleotide)是人工合成的含未甲基化CpG基序的寡核苷酸序列。CpG ODN可刺激人類和多種動物產生自然免疫和獲得性免疫，主要通過TLR9信號系統活化免疫系統，最終促使多種免疫細胞的成熟分化和增殖，包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞和DC細胞。CpG ODN能快速活化T、B細胞，誘導Th1型免疫反應并能促進抗原遞呈細胞的增生和成熟1。現階段我國對乙型肝炎的預防主要是通過注射乙型肝炎疫苗，但接種免疫過程當中和接種免疫后會出現免疫較弱和不免疫現象2,3。所以，選擇一種安全有效的免疫佐劑是增強免疫效果的有效途徑。本文通過

7、測定不同時間段的小鼠注射CpG ODN和乙肝表面抗原后的抗體滴度，評價CpG ODN作為免疫佐劑增強乙肝疫苗的免疫效果。    1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 動物 BAL b/c小鼠，雄性，6周齡，體質量1822 g，SPF級，購自中山大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2004?0011。 1.1.2 試劑 血源性乙肝表面抗原購自上海前塵生物，CpG ODN 由本實驗室保存。 1.2 動物分組及免疫方案 1.2.1 動物分組 50只BAL b/c小鼠根據隨機分配表，隨機平均分成5組：第1組為HBsAg和高劑量CpG?ODN聯合免疫組，

8、第2組為HBsAg和中劑量CpG?ODN聯合免疫組，第3組HBsAg和低劑量CpG?ODN聯合免疫組，第4組為HBsAg單用組，第5組為生理鹽水對照組。各組飼養條件相同。 1.2.2 動物免疫 分別于第0、2、4周免疫BAL b/c小鼠，每次免疫劑量相同。第1組：尾靜脈注射含2 g HBsAg 和100 g CpG?ODN生理鹽水溶液，100 L/只;第2組：尾靜脈注射含2 g HBsAg 和1 g CpG?ODN生理鹽水溶液，100 L/只;第3組：尾靜脈注射含2 g HBsAg 和10 ng CpG?ODN生理鹽水溶液，100 L/只;第4組：尾靜脈注射含2 g HBsAg生理鹽水溶液，1

9、00 L/只;第5組：100 L生理鹽水/只。 1.3 乙肝表面抗原檢測 1.3.1 血清采集 斷尾后玻璃毛細管采血，室溫自然凝固，常溫離心后取上清，-20 保存。 1.3.2 抗原檢測 96孔板用碳酸氫鈉緩沖液(15 mmol/LNa2CO3，355 mmol/LNaHCO3，pH 9.6)適當稀釋的乙肝表面抗原包被，4 過夜孵育。用含Tween?20的PBS(0.1 mol/LPBS,0.1% Tween?20)洗滌3次，每次間隔3 min，每孔加入100 L經PBS(0.1 mol/L PBS,1% BSA)適當稀釋的待測血清， 37 孵育90 min。 PBS洗滌5次， 每孔加入100

10、 L 1 000倍稀釋的HRP標記的乙肝表面抗原，37孵育40 min。PBS洗滌5次，每孔加入100 L TMB底物(含0.1 mg/mL 3355?四甲基聯苯胺的磷酸鹽?檸檬酸緩沖液，pH 5.4，用前加5 mL 30% H2O2 10 mL)，37 孵育1 h。每孔加入100 L H2SO2(0.2 mol/L)終止顯色反應。Bio?Rad 680 測定A450/630讀數。 1.4 統計學分析 應用SPSS統計軟件，采用重復測量方差分析對數據進行分析，P<0.05為差異有顯著性。 2 結 果 2.1 小鼠免疫后728 d外周血中乙肝表面抗體的平均滴度變化 乙肝表面抗原單用組的抗體

11、在717 d時間段內檢測不到，乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯合免疫的抗體在第14天檢測到，乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯合免疫組的抗體在第10天檢測到，乙肝表面抗原和高劑量CpG ODN聯合免疫的抗體出現時間較早，在第7天即可檢測到。在第1428天的各個時間點上，乙肝表面抗原和高劑量CpG ODN聯合免疫組的抗體滴度均顯著高于乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯合免疫組(P<0.05);在第14、17、21天時間點上，乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯合免疫組之間差異無顯著性(P&l

12、t;0.05)，在第24、28天時間點上，兩組差異有顯著性 (P<0.05);在第21、24、28天時間點上，乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯合免疫組的抗體滴度均顯著高于乙肝表面抗原單用組(P<0.05)。見圖1和表1。表1 免疫728 d HBsAb滴度對數轉換數據    2.2 小鼠免疫后38周外周血中乙肝表面抗體的平均滴度變化 在第38周時間內，第4周乙肝表面抗原和高劑量CpG ODN聯合免疫組、疫苗和中劑量CpG ODN聯合免疫組之間的抗體滴度差異有顯著性(P<0.05);在其他

13、時間點上，乙肝表面抗原和高劑量CpG ODN聯合免疫組的抗體滴度與其他組別差異均有非常顯著性(P<0.01)，并持續快速升高。乙肝表面抗原和中劑量CpG ODN聯合免疫組、乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯合免疫組的抗體滴度從第3周之后均逐漸升高，在第3、4、5、6周時間點上，只有第4周兩組之間差異有顯著性 (P<0.05)，其他時間點差異均無顯著性 (P<0.05);到第7、8周時兩組差異有顯著性(P<0.05)。對于乙肝表面抗原單用組，雖然抗體滴度有逐漸升高的趨勢，但卻一直處于比較低的水平，除了第4周與乙肝表面抗原和低劑量CpG ODN聯合免疫組之間的抗體滴度差異

14、無顯著性外(P>0.05)，其他時間點上與其他各組差異均有顯著性(P<0.05)。見圖2和表2。表2 免疫38周HBsAb滴度對數轉換數據 3 討 論 對于CpG ODN的免疫刺激作用人們已經進行了大量的研究。在應用方面，人們較為關注其安全、有效的佐劑特性。因為CpG ODN能同時增強抗原特異性體液免疫應答和細胞免疫應答，尤其對細胞免疫應答具有更突出的增強作用4。本實驗發現,應用CpG ODN作為乙肝表面抗原的佐劑，能較早較快地刺激機體產生乙肝表面抗體，CpG ODN作為佐劑使用增強乙肝表面抗原的免疫效應，CpG ODN的使用量在實驗的劑量范圍內具有一定的劑量效應關系，高劑量的Cp

15、G ODN的使用對增強乙肝表面抗原的免疫效應效果更早更好。由實驗數據觀察來看，單純的乙肝表面抗原抗原性是較弱的，搭配佐劑使用，才能有效地提高乙肝表面抗原的免疫原性5，提高乙肝表面抗原的免疫效果。實驗劑量范圍內，增強乙肝疫苗抗原抗體反應是顯著的，并且動物也無逆毛、腹瀉、發熱或其他中毒現象等任何異常，表明CpG ODN的使用是安全可靠的。 CpG ODN的作用是通過有Toll樣受體家族的細胞，主要是TLR9受體識別CpG的基序，從而通過若干信號傳遞途徑活化轉錄因子，啟動相關細胞因子的基因轉錄6。本實驗所用的CpG ODN是將60 bp磷酸二脂修飾的ODN與pUC18載體體外連接構建的重組質粒pUC

16、18?ODNs，更真實地模擬了天然的包含CpG基序的非甲基化的ODN。在免疫過程中，CpG ODN以模擬細菌感染的方式激活了細胞經由TLR9通道的固有免疫6，由于CpG ODN僅僅是一段DNA序列，在激活免疫的同時不具有感染性，小鼠未發生任何炎性反應7,8。同時，CpG ODN激活了體內的免疫細胞，調動了免疫系統，使乙肝疫苗能夠較早較快的產生免疫反應7,8。由于CpG ODN的免疫刺激作用，小鼠的機體可以較長時間的處于免疫活化狀態，免疫細胞免疫活性高，乙肝表面抗體得以長期高水平的經由B細胞分泌7,8。在有的實驗中，大量的細菌DNA產生抗雙鏈DNA的自身抗體，加重小鼠的自身免疫性疾病;在本實驗中

17、使用CpG ODN，乙肝表面抗體產生早，滴度高，持續久，并且安全可靠。在應用CpG ODN作為乙肝疫苗佐劑的臨床試驗中，首次和第2次免疫后抗體水平甚至可以提高1345倍9;同時，由于CpG對CD8+T細胞刺激作用，誘導的CTL細胞在細胞免疫作用殺傷腫瘤以及治療胞內感染也具有很好的應用前景10。但是對長期性觀察的缺失，還不能夠全面反映CpG ODN的作用效果，長期效應的機制也未被揭開。    本研究結果表明，本實驗室制備的CpG ODN作為乙肝表面抗原的佐劑能較早較快地促進乙肝表面抗原的抗原抗體反應，并且安全可靠。在長期效應上，CpG ODN作為佐劑對維持

18、乙肝表面抗體的有效滴度具有長期效應。 【參考文獻】  1 YAMAMOTO M,SATO S,MORI K,et al. Cutting edge: a novel Toll/IL?1 receptor domain?containing adapter that preferentially activates the IFN?beta promoter in the Toll?like receptor signalingJ.J Immunol,2002,169:6668-6672.2 羅妖星，李建基，張吉凱，等.廣東省19972002年新生兒乙型肝炎疫苗接種率及其影響因素分析J

19、.中國計劃免疫,2006,12(2):100-102.3 馮春顏,汪宇嬰,趙詳勝.乙肝疫苗接種后無弱應答分析J.熱帶醫學雜志,2005,3: 405-406.4 DAVIS H L. Use of CpG DNA for enhancing specific immune responsesJ. Curr Top Microbiol Immunol,2000,247:171-183.5 MOLDOVEANU Z,LOVE?HOMAN L,HUANG W Q,et al. CpG DNA,a novel immune enhancer for systemic and mucosal immunization with influenza virusJ.Vaccine,1998,16(11/12):1216-1224.6 KRIEG A M. The role of CpG motifs in innate immunityJ. Curr Opin I