1、2019 年考點29基因工程、蛋白質工程和細胞工程直擊考綱1.基因工程的誕生（A）。2.基因工程的原理及技術（含PCR技術）（B）。3.基因工程的應用（B）。4. 蛋白質工程（A）。 5.植物的組織培養（B）。6.動物細胞培養與體細胞克隆 （A）。7.細胞融合與單克隆抗體 （B）。8. 動物胚胎發育的基本過程 （A）。9.胚胎工程的理論基礎（A）。10.胚胎干細胞的移植（A）。11.胚胎工程的應用（B）。 12.轉基因生物的安全性（A）。13.生物武器對人類的威脅（A）。14.生物技術中的倫理問題（A）。15.生態工程的原 理（A）。 16.生態工程的實例及應用（B）。望靜悟提綱限制性榨.限內

2、口卷口同人迷三葩i目的城網的架枇 I1LE足注找母的出建I樸也的基國導A支巾訓袁iH的4網的椅M勺步定維作LH防巾程構和袍工程黜總的任俅件，孤胞牌的疏防性制心 棺物粗覘培奇口閭 Lfl'臉溝I柳胤輪窘 值尚繁嘀的新京行柞吃所后沖的給仃 劑胭冷物的JJ比'L聲動/訓班1片柞轉明乩小構INEKRW星周埼才中恂m批判花將也“金也用殖顯L在卅新的，不形威個體星一財物卻胞解的金康性M5t乘得克隆渝翱個砧繼胞雁帕前所性旬戶生E熱界中沒行打出臼啦檄作時t!旨口蛆工程體的P速胸庫法.牝學法，生物法 空生端小*在射“國用禽制陶她耳附或已兔疫的ti淋巴如枇和怖皖蝴用IJfe產十號一機體的步厘電汨愜

3、/核心點撥.1 .基因工程常考的 3種基本工具（1）限制性核酸內切酶：識別雙鏈DNA分子的某種特定核甘酸序列，并在特定位點上切割DNA分子。（2）DNA連接酶：Ecoli DNA連接酶只能連接黏性末端；T4 DNA連接酶能連接黏性末端和平末端。（3）載體：能在宿主細胞內穩定存在并大量復制。有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中。具有特殊的標記基因一一以便對含目的基因的受體細胞進行鑒定和選擇。2 .基因工程的4大操作程序（1）目的基因的獲取：從基因文庫中獲取。利用PC叱術擴增：a.原理：DNAa鏈復制。b.條件：模板DNA引物、游離的脫氧核甘酸、熱穩定的DNAM合酶。用化學

4、方法直接人工合成。(2)基因表達載體的構建基因表達載體模式圖基因表達載體的構建過程曲陣 < 喉粒>DN人分子(含目的基因)|一 M ¥1惻制酣切劑一個切口兩個切口兩個船性末端援幡目的星因(3)將目的基因導入受體細胞導入植物細胞：農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法。導入動物細胞：顯微注射技術。導入微生物細胞：感受態細胞法(用Ca"處理)。(4)目的基因的檢測與鑒定插入檢測：DNA分子雜交技術。轉錄檢測：DNL RN酚子雜交技術。翻譯檢測：抗原一抗體雜交。個體水平檢測：抗性接種實驗。3 .圖解記憶蛋白質工程Iail值期的的白白結陶找刎相對鹿的脫翅核皆 酸序列印因I

5、推測應打晌氣幕展序列; I4 .比較記憶植物組織培養與動物細胞培養項目植物組織培養取材植物幼嫩部位動物細胞培養動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織過程動均卯叔塊聊電HE白解處理惻胞懸液|林耳雌點睜抵I ma扁處狎細他恩浦I鈾明對兒塔姍.懂t世3賽結果獲得植株個體，可以體現全能性新的細胞，不形成個體，不體現全能性條件無菌；營養；適宜條件無菌、無毒；營養、血清等；溫度和pH;氣體環境： Q、CO5 .植物體細胞雜交與單克隆抗體制備過程比較步驟植物體細胞雜交過程單克隆抗體制備過程第一原生質體的制備（酶解法）正常小鼠免疫處理第二步原生質體融合（物理、化學法）動物細胞融合（物理、化學、 生物方法）第

6、三步雜種植株的篩選與培養雜交瘤細胞的篩選與培養第四步雜種植株的誘導與鑒定單克隆抗體的提純相同點兩種技術手段的培養過程中都進行有絲分裂，都是無性繁殖，都可 稱為克隆，都不涉及減數分裂；均為無菌操作，需要適宜的溫度、 pH等條件（1）誘導融合的方法分別有哪些？融合的細胞類型有哪幾種（僅考慮兩兩融合的細胞）？提示誘導植物體細胞的原生質體融合的方法主要有離心、振動、電激或用聚乙二醇（PEG）作為誘導劑。動物細胞融合常用的誘導因素有聚乙二醇（PEG）、滅活的病毒（誘導動物細胞融合的特有因素 ）、電激等。融合的細胞類型：前者一 AA BB AB。后者一瘤瘤、B瘤、BR （2）各自的原理分別有哪些？提示前者

7、有細胞膜的流動性和植物細胞的全能性，后者有細胞膜的流動性和細胞增殖。6 .掌握克隆動物培育的流程域性動物卵（§在花.O, 動物題體娜艷 施核F7*湍肝胎汴時蝴胞四呼我就性 金宿分境新個郵7 .理清單克隆抗體制備的過程/題組特訓題組一基因工程和蛋白質工程1. （2018 南通、泰州聯考）乙型腦炎和偽狂犬病是豬的兩種常見傳染病。如圖是利用基因工程技術生產能同時預防這兩種病疫苗的流程圖，其中PrM為乙型腦炎的特異性抗原基因，PK gG gD為偽狂犬病的主要抗原基因,TK為偽狂犬病的毒性基因，pgG為啟動子，BarHI和EcoRI為兩種限制酶，其識別序列及切割位點分別是 GGATCCG，AA

8、TTC請回答下列問題：（1）過程所需的酶有乙陋病毒RNAdt"屆" F 陸般白瞪苗嚴1辦離.純化彳曲什國國mH Er?rjR （思等入及5E I_I9電加仙立氏病柒新近峻而和。下列四種引物中適用于過程的一對引物是P1: 5' TTGGATCCATGGAAGGCTCAATCATGTG 3P2: 5' CACAAGCTTAGATGACGTATCCAAGGAG 3P3: 5' TACGGTACCTTAGGGGTTAAGTGGG 3P4: 5' GCGAATTCTAACTGTAAGCCGGAGCG 3 （2）過程所需的酶有 。過程中要用Ca"

9、;處理大腸桿菌，其目的是（3）重組偽狂犬病毒中不帶 TK基因的優點是。（4）將獲得的病毒疫苗注射到豬體內，一方面病毒中抗原基因在豬細胞中大量表達，誘導豬獲得 免疫；另一方面 使得病毒疫苗具有用量小、作用更持久等優點。答案 （1）反（逆）轉錄酶 耐高溫的DNA聚合酶（或Taq酶）P1和P4 （2）限制酶和DNA1接酶 使大腸桿菌成 為感受態細胞，有利于外源DNA的導入 （3）不具毒性，注射后不會引發豬患病 （4）體液免疫和細胞（或特異性） 病毒在動物體內可增殖并長期保留解析（1）圖中過程表示乙腦病毒的 RNA經反（逆）轉錄形成相應的目的基因，并通過 PCR技術擴增該目的基因 的過程，該過程涉及逆

10、轉錄和 PCRa術，因此需要逆轉錄酶和耐高溫的 DNA聚合酶（Taq酶）的催化。圖中目的基2019 年 因兩側是限制酶（Bamn和EcoRi）的識別序列，故應該選擇的引物是 P1和P4。（2）圖中過程表示構建基鹵袤一 達載體，需要的工具酶有限制酶和DNA連接酶。過程表示將重組DNA導入受體細胞（大腸桿菌）的過程，用Ca2+處理大腸桿菌使其成為感受態細胞，有利于外源DNA的導入。（3） TK為偽狂犬病的毒性基因，因此重組偽狂犬病毒中不帶TK基因的優點是不具毒性，注射后不會引發豬患病。（4）將獲得的病毒疫苗注射到豬體內，一方面病毒中抗原基因在豬細胞中大量表達，誘導豬獲得特異性免疫（體液免疫和細胞免

11、疫）；另一方面由于病毒在動物體內可增殖并長期保留，使得病毒疫苗具有用量小、作用更持久等優點。2. （2018 揚州模擬）為研究肝癌致病機理，科研工作者利用如圖所示的差異雜交法和基因工程獲取相關癌基因 以作進一步研究。請據圖回答問題：肝感硼 黑叢戀嚕A人抬叩曲戡火、八71喘了能 xD、 含/下的cDNA 串銀腋Wl 不含描嫉因mRYA 正常肝細時的空,mRNA fi*一則幅 因工庫一未雜交價F朵之分子解基網(目的基因)nwkb)Iti 2圖1中，A過程需要用 酶，D過程需要回收 （填“未雜交”或“雜交分子”）的含32P的cDNA 單鏈，繼而通過人工合成，獲得 ,并用其構建基因文庫。（2）從圖1構

12、建的基因文庫中獲取的目的基因，一般還需進行人工改造后才能用于基因表達載體的構建，改造內容除了在基因兩端添加限制酶的識別序列外，還需添加 ,以便其隨載體導入受體細胞后， 能正常調控表達過程。（3）圖2為改造后的目的基因。 圖3為兩種質粒，其中Amp為氨茉青霉素抗性基因，Tetr為四環素抗性基因，lacZ 為藍色顯色基因，其表達產物可使底物X-Gal呈藍色。EccRI （0.7 kb）、Not I （1.2 kb）等為限制酶及其切割位點與復制原點之間的距離 （1 kb =1 000個堿基對）。圖3中能作為載體的最理想的質粒是 （填“X”或"Y”），用選定的質粒與圖2的目的基因構建基因表

13、達載體時，應選用的限制酶是 。為篩選出成功導入目的基因的受體細胞，培養基中應適量添加若用EcoRI完全酶切上述中獲得的重組質粒，并進行電泳觀察，可出現四種長度不同的片段，其長度分別為 1.7 kb、5.3 kb、。答案 （1）逆轉錄 未雜交雙鏈cDNA （2）啟動子和終止子（3）X Not I四環素和 X-Gal3.1 kb 和3.9 kb解析 （1）圖1中，A過程是以mRN的模板通過逆轉錄合成 cDNAll鏈的過程，該過程需要用到的酶是逆轉錄酶。 由于正常肝細胞總 mRN解中不含癌基因 mRNA不能與以癌基因mRN徼模板合成的cDNA單鏈完成分子雜交，因 此，要獲取癌基因應回收未雜交的cDN

14、A單鏈，繼而通過人工合成，獲得雙鏈cDNA肉基因），并用其構建基因文庫。（2）基因正常表達需要啟動子和終止子的調控，而人工合成的目的基因（癌基因）中不含啟動子和終止子，因此在對獲得的目的基因進行人工改造時需添加啟動子和終止子。（3）根據圖 2可知，目的基因中間含有 EcoRI酶切割位點，兩端具有 Not I酶切割位點，因此只能用 Notl酶切割目的基因而不能用EcoRI酶切害U,否則會破壞目的基因。分析質粒 X和質粒Y的結構可知，質粒 Y的復制原點中含有 Notl酶切割位點，因此不能用質粒Y作為載體。因此，圖 3中能作為載體的最理想的質粒是X,應選用的限制酶是 Notl。由于質粒X中含有四環素

15、抗性基因Tetr,因此，用含有四環素的培養基可篩選出導入了普通質粒（不含目白基因）和重組質粒（含目的基因）的受體細胞；由于Not I酶切會破壞質粒 X中的藍色顯色基因lac Z,因此，用含有X-Gal的培養基可鑒別導入的 是普通質粒還是重組質粒：培養結果呈藍色說明導入的是普通質粒，培養結果不呈藍色說明導入的是重組質粒。綜上所述，為篩選出成功導入目的基因的受體細胞，培養基中應適量添加四環素和X-Galo構建重組質粒時，只使用一種限制酶，則目的基因可以以兩種不同方向連接到質粒X被切開的切口中。由于目的基因和質粒中均含有1個EcoRI酶切割位點，因此每種重組質粒中含有2個EcoRI酶切割位點，若用

16、EcoRI完全酶切獲得的每個重組質粒，都將得到 2種不同長度的DNA片段，最終可出現四種長度的DNA片段，長度分別為1.7 kb、5.3 kb、3.1 kb 和 3.9 kb。3.干擾素是用于治療病毒感染和癌癥的免疫活性蛋白質，若人的干擾素基因在大腸桿菌內表達，產生的抗病毒性較低且保存困難，若將第17位的半胱氨酸改造為絲氨酸，則生產出的干擾素的抗病毒性是原來的100倍，且可在-70 C條件下保存半年，下圖是構建干擾素工程菌的過程示意圖。回答下列問題:F擾相改油后的干擾點戰因結合-2.抗氨節芹戊備邛因抗四環素需崗點為目的拓四與 戰粒A的結合.也（1）要改變干擾素的功能，可以考慮對干擾素的 進行改

17、造。對干擾素進行改造，也可直接對干擾素基因進行改造，其原因是（2）過程將B導入大腸桿菌，需用 對大腸桿菌進行處理，使其處于能 的生 2019 年理狀態。（3）要檢測B是否導入大腸桿菌，將過程后的大腸桿菌先接種于含 的培養基上，然后將在該 培養基上生長的大腸桿菌接種在含 的培養基上，在前者培養基上能生長而在后者培養基上不能生 長的是導入B的工程菌。（4）利用圖中工程菌不能生產有活性的干擾素，這是因為答案 （1）氨基酸序列蛋白質的結構由基因決定，基因可以直接遺傳；對基因進行改造比對蛋白質改造容易（2）Ca 2+吸收周圍環境中的 DNA分子（3）氨茉青霉素 四環素 （4）大腸桿菌為原核生物，無內質網

18、和高爾基 體，不具備加工干擾素的能力解析（1）根據題干信息，若將第 17位的半胱氨酸改造為絲氨酸，則生產出的干擾素的抗病毒性是原來的100倍，且可在-70 c條件下保存半年，因此可以對干擾素的氨基酸序列進行改造。對干擾素進行改造，也可直接 對干擾素基因進行改造，原因是：蛋白質的結構由基因決定，基因可以直接遺傳； 對基因進行改造比對蛋白質改造容易。（2）將重組質粒導入大腸桿菌，需用COT處理，使大腸桿菌處于一種能吸收周圍環境中的DNA分子的生理狀態，成為感受態細胞。（3）將目的基因導入受體細胞時，大腸桿菌有三種狀態，一是沒有導入任何質粒，二是導入普通質粒，三是導入 重組質粒。分析圖示可知：在構建

19、基因表達載體時，抗四環素基因的結構遭到破壞，而抗氨芳青霉素基因結構完 好，因此沒有導入任何質粒的大腸桿菌，不含上述兩種抗性基因， 在含有氨茉青霉素或四環素的培養基中都不能生長；導入普通質粒的大腸桿菌含有的上述兩種抗性基因的結構均完好，在含有氨茉青霉素或四環素的培養基中都能生長；導入重組質粒的大腸桿菌含有的抗四環素基因的結構遭到破壞，而含有的抗氨茉青霉素基因結構完好，因此在含有氨茉青霉素的培養基中能生長，但在含有四環素的培養基中不能生長。可見，將過程后的大腸桿菌進行篩選時，先用含氨茉青霉素的培養基進行培養，淘汰沒有導入任何質粒的大腸桿菌，能生長的則是含有普通質粒和重組質粒（二者都含抗氨茉青霉素基

20、因）的大腸桿菌；然后將該培養基上生長的菌落用“蓋章”的方法接種 到含四環素的培養基上，在含四環素的培養基上能生長的是含普通質粒的大腸桿菌，將兩個培養基進行位置對照，在含氨茉青霉素的培養基上能生長，而在含四環素的培養基上該位置沒有菌落出現，則屬于導入重組質粒的工程菌。（4）干擾素是分泌蛋白，在核糖體中合成后需要經過內質網和高爾基體加工才具有生物活性，而大腸桿菌是原核 生物，無內質網和高爾基體，不具備加工干擾素的能力，所以利用圖中工程菌不能生產有活性的干擾素。題組二細胞工程4. （2018 無錫期末）多年生禾本科堿茅屬草本植物小花堿茅種子細小，外包被穎殼，研究人員以小花堿茅成熟 種子為外植體，對種

21、子脫穎處理，用不同濃度激素配比誘導愈傷組織形成及分化，成功建立了完整的小花堿茅組織培養植株再生體系。以下是部分研究數據，請分析回答：處理激素濃度（mg/L）愈傷組織誘導率（）2,4-D6-BA13052.1 ±2.225055.2 ±2.1330.142.4 ±1.9450.146.9 ±2.0570.138.6 + 1.4630.343.7 ±2.8（1）誘導小花堿茅愈傷組織最佳的激素配比濃度為 。（2）誘導形成愈傷組織的過程稱為 ,該過程在以 MSF 3%蔗糖+ 0.7%瓊脂（pH 78）為基本培養基、25 c左右的 條件下無菌培養，基本培

22、養基中加入蔗糖的目的是 。（3）從下圖分析可知，種子脫穎后，發芽率、污染率的變化是 ,種子穎殼影響發芽率可能的原因有很多，其中之一是因為穎殼妨礙了種子和 的接觸，從而影響了種子細胞的有氧呼吸。（4）對脫穎種子無菌處理的方法有（多選）。用70%勺酒精處理20%勺次氯酸鈉處理無菌水沖洗高壓蒸汽滅菌答案（1）5.0 mg/L 2,4-D 、不添加6-BA （2）脫分化 避光 提供營養物質，調節滲透壓（3）種子發芽率顯著提高，污染率降低培養基、Q （4）解析（1）分析題表可知，處理2的愈傷組織誘導率最高，因此誘導小花堿茅愈傷組織最佳的激素配比濃度為5.0mg/L的2,4-D和不添加6-BA。（2）誘導

23、形成愈傷組織的過程稱為脫分化，該過程在以M* 3須糖+ 0.7%瓊脂（pH78）為基本培養基、25 C左右的避光條件下無菌培養，基本培養基中加入蔗糖的目的是提供營養物質并調節滲 透壓。（3）分析柱狀圖可知，種子脫穎后，發芽率顯著提高、污染率降低。種子穎殼影響發芽率可能的原因之一是穎殼妨礙了種子和培養基、Q的接觸，從而影響了種子細胞的有氧呼吸。（4）用70%勺酒精或20%勺次氯酸鈉處理脫穎種子以及用無菌水沖洗脫穎種子，都能達到對脫穎種子進行消毒的目的，正確；高壓蒸汽滅菌會導致脫穎種子死亡，錯誤。5.美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭奶牛，年產奶量達 人用該高產奶牛的耳朵細胞，采用核移植技術獲得高產奶牛30.8 t ,我國奶牛產奶量年平均水平僅為34 t。某（如圖），請據圖回答下列問題：（1）目前完成的方法有獸通奶牛aI去極卵對細胞自產奶牛h伊耳朵那限核重蛆細胞 c<小牛d、梯度離心、紫外光短時間照射及化學物質處理等。（2）過程中選擇去核卵母細胞作為受體細胞的原因是 。（3）過程所利用的技術是 ,其原理是 。（4）該實驗的成功說明已分化的耳朵細胞的細胞核中含有與 一樣的全套基因，這種繁殖方式屬于（5）若研究發現該高產奶牛線粒體發達，故它的產奶量高，則小牛d成年后具有這一優良性狀嗎？ 。你的依據是。答案（1）顯微操作去核法（