1、精選優質文檔-傾情為你奉上（一）液體配制1. 完全培養基DMEM+10%FBS+1%雙抗+（1%HAPS液）若放置時間長于2周 加1%谷氨酰胺2. PBS1000ml去離子水中溶解 8.0gNaCl、 0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO43. 胰酶用之前調節PH值至7.64. CaCl2將0.165gCaCl2粉末溶于10ml去離子水中配制成50X的溶液每5ml膠原酶中加入100l CaCl2溶液（終濃度3mol/L） 用于激活膠原酶的活性5. 雙抗終濃度：青霉素 100萬U/100ml 鏈霉素 100萬U/100ml青霉素 0.6g為1個單位 鏈霉素 1.219

2、5g為一個單位稱取青、鏈霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中 再定容至100ml6. 兩性霉素B100mg兩性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成濃度為2.5mg/ml(1000X)的濃縮液每100ml完全培養基中加入100l 濃縮液，稀釋為終濃度2.5g/ml7. 細胞凍存液20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS)8 STZ溶液STZ溶于檸檬酸和檸檬酸三鈉的鹽溶液中稱取檸檬酸0.105g溶于5mlPBS 稱取檸檬酸三鈉0.145g溶于5mlPBS中 混合兩者制成10毫升的溶解液. 再將100mgSTZ粉末溶于該溶解液中 制成濃度1%的STZ溶液，調節PH值

3、至4.5，4°避光保存，由于STZ水溶性不穩定，溶液最好在半小時內使用完畢.9 油紅O原液：油紅 O 0.6g溶于異丙醇（ 99% ） 100ml 。稀釋液：油紅 O 原液 20ml ，蒸餾水 20ml ，過濾后使用。10 茜素紅稱取0.1g茜素紅粉溶于100mlPBS，調節PH值到7.2，過濾后使用.11 成骨誘導液配方：DMEM(H)+10%FBS+10mmol/L-甘油磷酸鈉+0.1mol/L地塞米松+50mg/LVitC1）-甘油磷酸鈉分子量：216 溶于水10mmol/L=216mg/100ml稱取216mg-甘油磷酸鈉粉末溶于100ml低糖完全培養基中2）地塞米松分子量：

4、392.5 在無水乙醇中的溶解度為1mg/ml.0.1mol/L=0.04mg/L將100mg地塞米松溶于100ml無水乙醇中 制成25000X的濃縮液每100ml低糖完全培養基中加入4l地塞米松濃縮液3）VitC分子量176.1 溶于水 稱取5mgVitC粉末溶于100ml低糖完全培養基中12 成脂誘導液配方：DMEM(L)+10%FBS+10mol/L地塞米松+200mol/L吲哚美辛+0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）+10mg/L胰島素1） 每100ml高糖完全培養基中400l地塞米松濃縮液2）吲哚美辛分子量：357.79 在無水乙醇中的溶解度為1g/50ml P

5、H 7.4以下 0.2mmol/L=7.16mg/100ml 稱取720mg吲哚美辛粉末溶于50ml無水乙醇 制成200X的濃縮液 每100ml高糖完全培養基中加入500l吲哚美辛濃縮液3）IBMX分子量：222.25 在DMSO中的溶解度為1M(222.25mg/ml)0.5mmol/L=1.1mg/100ml 將100mgIBMX粉末溶于1mlDMSO 制成100mg/ml(9100X)濃縮液 每100ml高糖完全培養基中加入11lIBMX濃縮液4）Insulin濃縮液濃度為10mg/ml(1000X) 每100ml高糖完全培養基中加入Insulin濃縮液100l.溶解粉末時均需先用少量液

6、體溶解，再定容。（二）細胞培養1.骨髓基質干細胞（BMSC）、脂肪基質干細胞（ADSC）的原代培養1）準備工作所需液體：培養基，血清（FBS），膠原酶消毒（器械、燒杯、濾紙、離心管等）（PBS,槍頭，青瓶和塞子，5套器械+34個燒杯+濾紙，離心管50+15ml）水浴鍋調節溫度至37°預熱配制BMSC清洗液 將PBS倒入50ml的燒杯中加2%雙抗和200ul兩性霉素配制ADSC清洗液 由于脂肪組織易污染，故將清洗液裝入青瓶中，每100mlPBS加2%雙抗和2040ul兩性霉素配制骨髓沖洗液（PBS+3%FBS）即300ul血清 BMSC沖洗液及膠原酶可放入37度水浴鍋或溫箱中預熱 2）

7、 取組織 將SD大鼠（4周 60-80g）引頸處死，用75%酒精浸泡5-10分鐘 取大鼠內臟脂肪，取脂肪時剪開皮膚及剪取脂肪分別用兩套器械減少污染，將取好的腹部脂肪放入事先配制好的青瓶清洗液中取大鼠長骨，盡量將附著的肌肉剔除干凈，若骨頭斷裂髓腔暴露，污染可能性大，棄之。將取出的脂肪及骨頭分別在清洗液中清洗3-5次 3） 收集細胞 ADSC: 將清洗后的脂肪組織在廣口小青瓶中剪碎，加入適量II型膠原酶（每1ml脂肪組織加1ml膠原酶）以及CaCl2（200X），將混合物移至15ml離心管中37°C水浴30分鐘（每間隔十分鐘震蕩15秒）,30分鐘后將混懸液用細胞篩網濾過，并用終止夜（10

8、%FBS的PBS）2ml終止消化，收集液體至離心管，1500rpm離心5-6分鐘，棄上清重懸細胞，細胞計數并種入培養瓶中，加適量培養基，在培養瓶上標記動物種屬、細胞類別、原代、日期. BMSC：用器械剪去長骨兩端，暴露骨髓腔，5ml注射器沖洗骨髓腔，收集液體至離心管，1000rpm離心8分鐘，棄上清重懸細胞，細胞計數并種入培養瓶中，加適量培養基，在培養瓶上標記動物種屬、細胞類別、原代、日期. 2.換液每2-3天一次，具體時間和頻率根據細胞狀態及培養基的顏色而定.準備物品：PBS、試管吸管步驟：吸出培養基，PBS清洗2遍，再加入培養基. 原代細胞首次換液時無需PBS清洗.3.傳代原代細胞7天后傳

9、代，之后每2-7天傳代，依據細胞密度及狀態而定傳代時根據細胞密度選擇所傳的瓶數，一般1瓶90%融合的細胞可傳2-4瓶.準備物品：15ml離心管、試管吸管、培養瓶、PBS、培養基、胰酶（ph調至7.4-7.6）步驟：1）吸出培養基，用PBS清洗2遍（應徹底清除培養基，否則血清會影響胰酶的消化作用）2) 加3-5ml（75cm規格培養瓶）胰酶至培養瓶中，放入37°C水浴鍋或培養箱中消化2-3分鐘，此過程中，顯微鏡下觀察細胞形態由梭形變為圓形，立即加入3-5ml培養基終止消化.3）用吸管輕柔吹打內壁數次幫助細胞脫落，也可用手輕拍瓶壁數下，將細胞懸液收集至離心管中，1000rpm離心6-8分

10、鐘4）沿細胞沉淀方向緩慢傾倒液體，加1ml培養基重懸，將重懸液分配至各培養瓶中，再加入適量培養基，標記日期、代數.4.凍存準備物品：15ml離心管、試管吸管、凍存管、PBS、培養基、胰酶、凍存液、冰步驟：1）將凍存液及培養基冰浴，保持低溫,2) 如傳代步驟中的1-3將細胞離心后，加入冰浴的培養基500l重懸，移至凍存管中3）在凍存管中加入等量凍存液，約550l（一滴一滴地加入），混勻4）直接放入-80°C冰箱（梯度降溫效果不理想），過夜轉入液氮罐5.復蘇準備物品：37°C水浴鍋、15ml 離心管、培養瓶、培養基步驟：1）預熱水浴鍋（37°C），在離心管中事先加入7

11、-8ml培養基2）將凍存的細胞在37°C水浴鍋中迅速地搖晃，使其快速溶解3）將1ml培養基加入凍存管中（一滴一滴地加入），混勻4）將凍存管中混勻的細胞懸液加入有培養基的離心管中，1000rpm離心5分鐘5）棄上清，用1ml培養基重懸細胞，種入培養瓶，加適量培養基，標記6.細胞計數步驟：1）細胞懸液的制備同前2）取細胞懸液15l與等量0.08%胎盤藍染液混合，將30l混合液注入細胞計數板3）數出四個象限（各16小格）的細胞總數后除以4，再乘以稀釋倍數（一般細胞懸液與染液是1：1混合，故乘以2），最后乘以104，即為細胞數量7.流式細胞檢測前的樣品制備準備物品：15ml離心管、1.5ml

12、EP管、PBS、洗滌液（PBS+1%FBS）步驟：1）將細胞消化、離心、去上清2）用洗滌液洗滌一次，加1ml洗滌液重懸，將細胞懸液分裝至數個EP管中（數量依據上機管數而定）3）繼續用洗滌液將EP管中的細胞洗滌2遍，最后每管中加適量PBS重懸4）將所需抗體與PBS進行1：1稀釋，每EP管細胞懸液中加3-5l相應抗體，保留1管空白對照，4°C保存，待上機8.流式細胞檢測的抗體選擇設置同型對照，也可設置雙標（FITC/PE）1)CD29-FITC hamster IgG control2)CD45-FITC mouse IgG1 control3)CD44-FITC mouse IgG2a

13、 control4)CD34-FITC rabbit IgG control9.細胞爬片的制備準備物品：六孔板、蓋玻片、離心管、PBS、胰酶、培養基步驟：1）將第三代ADSC（數量約為2x104）制成細胞懸液1.8ml2）將消毒好的蓋玻片放入六孔板中，每孔取300l細胞懸液平鋪在蓋玻片上3）待細胞貼壁后（約30分鐘），每孔加入約3ml 培養基10.干細胞的誘導分化1）成骨誘導：ADSC(P3-P5)制細胞爬片，待細胞70%融合后，將培養基換成成骨誘導液誘導，每3天換液，共誘導21天，之后進行茜素紅染色2）成脂誘導: ADSC(P3-P5)制細胞爬片，待細胞70%融合后，將培養基換成成脂誘導液誘

14、導，每3天換液，誘導21天，之后進行油紅O染色11.染色方法茜素紅法 作用原理：利用沉積的鈣于茜素紅發生顯色反應，得到紅色的染色效果。 步驟：1） 吸去誘導液，再PBS洗一到兩次； 2） 加入10中性甲醛，固定30min-60min； 3） 吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色6-10min； 4） 用PBS洗兩次，去處殘留的染色液；結果：染料品種的不同，礦化結節呈現不同的紅色。 油紅O染色法作用原理：細胞在胞漿中不斷有油滴的累積，并不斷的增加變大，利用Oil Red O的油溶性對油滴染色。步驟：1） 吸去誘導液，再PBS洗一到兩次；2） 加入10中性甲醛

15、，固定60min；3） 吸去固定液，加入現配和過濾后的Oil Red O染色液，染色60min；4） 用PBS洗2-5次，去處殘留的染色液和殘渣結果：分化的脂肪細胞呈紅色（三）動物模型的建立免疫炎性1型糖尿病小鼠模型的建立采用小劑量多次STZ腹腔注射Balb/c小鼠（6-8周，22-25g）、1%STZ、 40-60mg/Kg劑量連續五天注射步驟：1）小鼠禁食過夜2）次日清晨，甲紫溶液標記小鼠，測空腹血糖，稱體重，計算所需藥物劑量3）配制1%STZ溶液（方法件上文）4）1ml注射器抽取STZ對小鼠進行腹腔注射（注意注射器內因殘留而損失的藥物）重復上述步驟共五天在造模第三天進行第一次干細胞注射步驟：1）制細胞懸液，每只小鼠1X106細胞2）注射器抽取細胞懸液，用5#或4.5#頭皮針對小鼠進行尾靜脈注射，注射