1、常用緩沖液配置 實(shí)驗(yàn)室常用緩沖液配置方案 1)1 m tris-hcl (ph7 、4, 7 、6, 8 、0) 組份濃度:1 m tris-hcl 配制量:1 l 配制方法: 1、 稱量 121.1 g tris 置于 1 l 燒杯中。 2、 加入約 800 ml 得去離子水,充分?jǐn)嚢枞芙狻?3、 按下表量加入濃鹽酸調(diào)節(jié)所需要得 ph 值。 ph 值 濃 hcl 7、4 約 70ml 7、6 約 60ml 8、0 約 42ml 4、 將溶液定容至 1 l。 5、 高溫高壓滅菌后,室溫保存。 注意:應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定 ph 值,因?yàn)?tris 溶液得 ph 值隨溫度得變化差異很大,溫度

2、每升高 1,溶液得 ph 值大約降低 0、03 個(gè)單位。 2)10te buffer (ph7 、4, 7 、6, 8 、0) 組份濃度:100 mm tris-hcl, 10 mm edta 配制量:1 l 配制方法: 1、 量取下列溶液,置于 1 l 燒杯中。 1m trishcl buffer(ph7、4,7、6,8、0) 100ml 500mm edta(ph8、0) 20ml 2、 向燒杯中加入約 800 ml 得去離子水,均勻混合。 3、 將溶液定容至 1 l 后,高溫高壓滅菌。 4、 室溫保存。 3)1.5 m tris-hcl (ph8、8) 組份濃度:1.5 m tris-h

3、cl 配制量:1 l 配制方法: 1、 稱量 181.7 g tris 置于 1 l 燒杯中。 2、 加入約 800 ml 得去離子水,充分?jǐn)嚢枞芙狻?3、 用濃鹽酸調(diào)節(jié) ph 值至 8、8。 4、 將溶液定容至 1 l。 5、 高溫高壓滅菌后,室溫保存。 注意:應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定 ph 值,因?yàn)?tris 溶液得 ph 值隨溫度得變化差異很大,溫度每升高 1,溶液得 ph 值大約降低 0、03 個(gè)單位。 4)3 m 醋酸鈉(ph5 、2) 組份濃度:3m 醋酸鈉 配制量:100ml 配制方法: 1、稱量 40.8g naac3h2o 置于 100-200ml 燒杯中,加入月 40ml

4、 得去離子水?dāng)嚢枞芙?2、加入冰醋酸調(diào)節(jié) ph 值至 5、2 3、加去離子水將溶液定容至 100ml 4 高溫高壓滅菌后,室溫保存。 5)pbs buffer 組份濃度:137 mm nacl, 2.7 mm kcl, 10 mm na2hpo4, 2 mm kh2po4 配制量:1 l 配制方法: 1、 稱量下列試劑,置于 1 l 燒杯中。 nacl 8g kcl 0.2g na2hpo4 1.42g kh2po4 0.27g 2、 向燒杯中加入約 800 ml 得去離子水,充分?jǐn)嚢枞芙狻?3、 滴加濃鹽酸將 ph 值調(diào)節(jié)至 7、4,然后加入去離子水將溶液定容至 1 l。 4、 高溫高壓滅菌

5、后,室溫保存。 注意:上述 pbs buffer 中無(wú)二價(jià)陽(yáng)離子,如需要,可在配方中補(bǔ)充 1 mm cacl2 與 0.5 mm mgcl2。 6)10 m 醋酸銨 組份濃度:10 m 醋酸銨 配制量:100 ml 配制方法: 1、 稱量 77、1 g 醋酸銨置于 100200 ml 燒杯中,加入約 30 ml 得去離子水?dāng)嚢枞芙狻?2、 加去離子水將溶液定容至 100 ml。 3、 使用 0、22 mm 濾膜過(guò)濾除菌。 4、 密封瓶口于室溫保存。 注意:醋酸銨受熱易分解,所以不能高溫高壓滅菌。 7) 苯酚/ 氯仿/ 異戊醇 (25 : 24 : 1) 配制方法: 1、 說(shuō)明:從核酸樣品中除去

6、蛋白質(zhì)時(shí)常常使用苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)。氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相得分離,而異戊醇則有助于消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)得氣泡。 2、 配制方法:將 tris-hcl 平衡苯酚與等體積得氯仿/異戊醇(24 : 1)混合均勻后,移入棕色玻璃瓶中 4保存。 8)10 (w/v) sds 組份濃度:10 (w/v)sds 配制量:100ml 配制方法: 1、稱量 10g 高純度得 sds 置于 100-200ml 燒杯中,加入約 80ml 得去離子水,68加入溶解 2、滴加濃鹽酸調(diào)節(jié) ph 值至 7、2 3、將溶液定容至 100ml 后,室溫保存。 9)2 n naoh 組份濃

7、度:2 n naoh 配制量:100 ml 配制方法: 1、 量取 80 ml 去離子水置于 100200 ml 塑料燒杯中(naoh 溶解過(guò)程中大量放熱,有可能使玻璃燒杯炸裂)。 2、 稱取 8 g naoh 小心地逐漸加入到燒杯中,邊加邊攪拌。 3、 待 naoh 完全溶解后,用去離子水將溶液體積定容至 100 ml。 4、 將溶液轉(zhuǎn)移至塑料容器中后,室溫保存。 10)2 、5 n hcl 組份濃度:2、5 n hcl 配制量:100 ml 配制方法: 1、 在 78、4 ml 得去離子水中加入 21、6 ml 得濃鹽酸(11、6 n),均勻混合。 2、 室溫保存。 11)5 m nacl

8、 組份濃度:5 m nacl 配制量:1 l 配制方法: 1、 稱取 292.2 g nacl 置于 1 l 燒杯中,加入約 800 ml 得去離子水后攪拌溶解。 2、 加去離子水將溶液定容至 1 l 后,適量分成小份。 3、 高溫高壓滅菌后,4保存。 11)20 (w/v) glucose 組份濃度:20 (w/v) glucose 配制量:100 ml 配制方法: 1、 稱取 20 g glucose 置于 100200 ml 燒杯中,加入約 80 ml 得去離子水后,攪拌溶解。 2、 加去離子水將溶液定容至 100 ml。 3、 高溫高壓滅菌后,4保存。 12)solution i( 質(zhì)

9、粒提取用) 組份濃度:25 mm tris-hcl(ph8、0), 10 mm edta, 50 mm glucose 配制量:1 l 配制方法: 1、 量取下列溶液,置于 1 l 燒杯中。 1m tris-hcl(ph8、0) 25ml 0.5m edta(ph8、0) 20ml 20glucose(1.11m) 45ml dh2o 910ml 2、 高溫高壓滅菌后,4保存。 3、 使用前每 50 ml 得 solution i 中加入 2 ml 得 rnase a(20 mg/ml)。 13)solution ii( 質(zhì)粒提取用) 組份濃度:200mm naoh,1(w/v)sds 配制量

10、:500ml 配制方法: 1、量取下列溶液,置于 500ml 燒杯中 10 sds 50ml 2n naoh 50ml 2、加滅菌水定容至 500ml,充分混勻 3、室溫保存,此溶液保存時(shí)間最好不要超過(guò)一個(gè)月 注意:sds 易產(chǎn)生氣泡,不要?jiǎng)×覕嚢?14)solution iii( 質(zhì)粒提取用) 組份濃度:3 m koac, 5 m ch3cooh 配制量:500 ml 配制方法: 1、 稱量下列試劑,置于 500 ml 燒杯中。 koac 147g ch3cooh 57、5ml 2、 加入 300 ml 去離子水后攪拌溶解。 3、 加去離子水將溶液定容至 500 ml。 4、 高溫高壓滅菌后

11、,4保存。 15)0.5 m edta(ph8 、0) 組份濃度:0.5 m edta 配制量:1 l 配制方法: 稱取 186、1 g na2edta2h2o,置于 1 l 燒杯中。 2、 加入約 800 ml 得去離子水,充分?jǐn)嚢琛?3、 用 naoh 調(diào)節(jié) ph 值至 8、0(約 20 g naoh)。 注意:ph 值至 8、0 時(shí),edta 才能完全溶解。 4、 加去離子水將溶液定容至 1 l。 5、 適量分成小份后,高溫高壓滅菌。 6、 室溫保存。 16)1 m dtt 組份濃度:1 m dtt 配制量:20 ml 配制方法: 1、 稱取 3、09 g dtt,加入到 50 ml 塑

12、料離心管內(nèi)。 2、 加 20 ml 得 0、01 m naoac(ph5、2),溶解后使用 0、22 mm 濾器過(guò)濾除菌。 3、 適量分成小份后,-20保存。 17)10 mm atp 組份濃度:10 mm atp 配制量:20 ml 配制方法: 1、 稱取 121 mg na2atp3h2o,加入到 50 ml 塑料離心管內(nèi)。 2、 加 20 ml 得 25 mm tris-hcl(ph8、0),攪拌溶解。 3、 適量分成小份后,-20保存。 一、常用貯液與溶液 1mol/l 亞精胺(spermidine): 溶解 2.55g 亞精胺于足量得水中,使終體積為 10ml。分裝成小份貯存于-20

13、。 1mol/l 精胺(spermine):溶解 3.48g 精胺于足量得水中,使終體積為 10ml。分裝成小份貯存于-20。 10mol/l 乙酸胺(ammonium acetate):將 77.1g 乙酸胺溶解于水中,加水定容至 1l 后,用 0、22um孔徑得濾膜過(guò)濾除菌。 10mg/ml 牛血清蛋白(bsa):加 100mg 得牛血清蛋白(組分 v 或分子生物學(xué)試劑級(jí),無(wú) dna 酶)于 9、5ml 水中(為減少變性, 須將蛋白加入水中,而不就是將水加入蛋白),蓋好蓋后,輕輕搖動(dòng),直至牛血清蛋白完全溶解為止。不要渦旋混合。加水定容到 10ml,然后分裝成小份貯存于-20。 1mol/l

14、 二硫蘇糖醇(dtt):在二硫蘇糖醇 5g 得原裝瓶中加 32、4ml 水,分成小份貯存于-20?；蜣D(zhuǎn)移 100mg 得二硫蘇糖醇 至微量離心管,加 0、65ml 得水配制成 1mol/l 二硫蘇糖醇溶液。 8mol/l 乙酸鉀(potassium acetate):溶解 78.5g 乙酸鉀于足量得水中,加水定容到 100ml。 1mol/l 氯化鉀(kcl):溶解 7.46g 氯化鉀于足量得水中,加水定容到 100ml。 3mol/l乙酸鈉(sodium acetate):溶解40.8g得三水乙酸鈉于約90ml水中,用冰乙酸調(diào)溶液得ph至 5、2,再加水定容到 100ml。 0、5mol/l

15、 edta:配制等摩爾得 na2edta 與 naoh 溶液(0、5mol/l),混合后形成 edta 得三鈉鹽。或稱取 186.1g 得 na2edta2h2o 與 20g 得 naoh,并溶于水中,定容至 1l。 1mol/l hepes:將 23、8ghepes 溶于約 90ml 得水中,用 naoh 調(diào) ph(6、8-8、2),然后用水定容至 100ml。 1mol/l hcl:加 8、6ml 得濃鹽酸至 91、4ml 得水中。 25mg/ml ipgt:溶解 250mg 得 ipgt(異丙基硫代-d-半乳糖苷)于 10ml 水中,分成小份貯存于-20。 1mol/lmgcl2:溶解

16、20.3g mgcl26h2o 于足量得水中,定容到 100ml。 100mmol/l pmsf:溶解 174mg 得 pmsf(苯甲基磺酰氟)于足量得異丙醇中,定容到 10ml。分成小份并用鋁箔將裝液管包裹 或貯存于-20。 20mg/ml 蛋白酶 k(proteinase k):將 200mg 得蛋白酶 l 加入到 9、5ml 水中,輕輕搖動(dòng),直至蛋白酶 k 完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到 10ml,然后分裝成小份貯存于-20。 10mg/mlrnase(無(wú) dnase)(dnasefree rnase):溶解 10mg 得胰蛋白 rna 酶于 1ml 得10mmol/l得乙酸鈉水溶液

17、中(ph 5、0)。溶解后于水浴中煮沸15min,使dna酶失活。用1mol/l得 trishcl 調(diào) ph 至 7、5,于-20貯存。(配制過(guò)程中要戴手套) 5mol/l 氯化鈉(nacl):溶解 29.2g 氯化鈉于足量得水中,定容至 100ml。 10n 氫氧化鈉(naoh):溶解 400g 氫氧化鈉顆粒于約 0.9l 水得燒杯中(磁力攪拌器攪拌),氫氧化鈉完全溶解后用水定容至 1l。 10sds(十二烷基硫酸鈉):稱取 100gsds 慢慢轉(zhuǎn)移到約含 0.9l 得水得燒杯中,用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至 1l。 2mol/l 山梨(糖)醇(sorbitol):溶解 36.4

18、g 山梨(糖)醇于足量水中使終體積為 100ml。 100三氯乙酸(tca):在裝有 500gtca 得試劑瓶中加入 100ml 水,用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。(稀釋液應(yīng)在臨用前配制) 2、5 xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷):溶解 25mg 得 xgal 于 1ml 得二甲基甲酰胺(dmf),用鋁箔包裹裝液管,貯存于-20。 100denhardt 試劑(denhardt"s regent) 成分及終濃度 配制 100ml 溶液各成分得用量 2聚蔗糖(ficoll,400 型) 2聚乙烯吡咯烷酮(pvp-40) 2bsa(組分 v) 水 2g 2g 2g 加水至總

19、體積為 100ml 依照上表稱取各組分,溶于水中定容。過(guò)濾除菌及雜質(zhì),分裝成小份于-20貯存。 10 標(biāo)準(zhǔn) dna 連接酶緩沖液(standard dna ligase buffer)( 粘端、平端連接) 成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分得用量 0、5mol/l tris-hcl 100mmol/l mgcl2 100mmol/l dtt 2mmol/l atp 5mmol/l 鹽酸亞精胺(可選) 0、5mg/ml bsa(組分 v)(可選) 水 5ml 1mol/l 貯液 1ml 1mol/l 貯液 1ml 1mol/l 貯液 200ul 100 mmol/l 貯液 50ul 1 m

20、mol/l 貯液 0、5ml 10 mg/ml 貯液 2、25ml 將配制好得緩沖液分裝成小份,貯存于-20 。 100 mmol/l dntp 溶液(dntp solutions) 可以購(gòu)買(mǎi)到 100mmol/l 純 dntps 貯液,-80可貯存至少 6 個(gè)月。 10mmol/l dntp 混合液 成分及終濃度 配制 20ul 溶液各成分得用量 10mmol/l datp 10mmol/l dctp 10mmol/l dgtp 10mmol/l dttp 水 2ul 100 mmol/l datp 貯液 2ul 100 mmol/l dctp 貯液 2ul 100 mmol/l dgtp

21、貯液 2ul 100 mmol/l dttp 貯液 12ul 20peg 8000/2.5m nacl 成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分得用量 質(zhì)量濃度為 20聚乙二醇 2、5mol/l 氯化鈉 水 20g 50ml 5 mol/l 氯化鈉 或 14.6g 固體氯化鈉 補(bǔ)足 100ml 加聚乙二醇于含有氯化鈉得燒杯中,加水至終體積 100ml,用磁力攪拌器攪拌溶解。 20ssc 成分及終濃度 配制 1l 溶液各成分得用量 300mmol/l 檸檬酸三鈉(二水) 3mol/l 氯化鈉 水 88.2g 175.3g 補(bǔ)足 1l 溶解檸檬酸三鈉(二水)與氯化鈉于約 0.9l 水中,加幾滴 1

22、0n naoh 溶液調(diào) ph 為 7、0,用水補(bǔ)足體積至 1l。 depc(焦碳酸二乙酯)處理水 加 100ul depc 于 100ml 水中,使 depc 得體積分?jǐn)?shù)為 0、1。在 37溫浴至少 12h,然后在 15 psi 條件下高壓滅菌 20min,以使殘余得 depc 失活。depc 會(huì)與胺起反應(yīng),不可用 depc處理 tris 緩沖液。 甲酰胺(deionized formamide) 直接購(gòu)買(mǎi)或加 dowex xg8 混合樹(shù)脂于裝有甲酰胺得玻璃燒杯中,用磁力攪拌器輕輕攪拌 1h,可去除甲酰胺中得離子。經(jīng) whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾除去樹(shù)脂后分成小份,充氮?dú)庥?80貯存(防止氧

23、化)。 磷酸緩沖液(phosphate buffer) 按照下表所給定得體積,混合 1 mol/l 得磷酸二氫鈉(單堿)與 1mol/l 磷酸氫二鈉(雙堿)貯液,獲得所需 ph 得磷酸緩沖液。配制 1 mol/l 得磷酸二氫鈉(nah2po4h2o)貯液:溶解 138g 于足量水中,使終體積為1l;1mol/l 磷酸氫二鈉(na2hpo4)貯液:溶解142g于足量水中使終體積為 1l。 1mol/l 磷酸二氫鈉(ml) 1mol/l 磷酸氫二鈉(ml) 最終 ph 值 877 850 815 775 735 685 625 565 510 450 390 330 280 123 150 185

24、 225 265 315 375 435 490 550 610 670 720 6、0 6、1 6、2 6、3 6、4 6、5 6、6 6、7 6、8 6、9 7、0 7、1 7、2 te( 用于懸浮與貯存 dna) 成分及終濃度 制 配制 100ml 溶液各成分得用量 10mmol/l trishcl 1mmol/l edta 水 1ml 1mol/l tris-hcl(ph7、4-8、0,25) 200ul 0、5 mol/l edta(ph 8、0) 98、8ml tris 緩沖液(tris-hcl buffer) 將121g得tris堿溶解于約0.9l水中,再根據(jù)所要求得ph(25下

25、)加一定量得濃鹽酸(11、6n),用水調(diào)整終體積至 1l。 濃鹽酸得體積(ml) ph 8、6 14 21 28、5 38 46 56 66 71、3 76 9、0 8、8 8、6 8、4 8、2 8、0 7、8 7、6 7、4 7、2 二 、 電泳緩沖液、染料與凝膠加樣液 電泳緩沖液 50tris- 乙酸(tae) 緩沖液 成分及終濃度 配制 1l 溶液各成分得用量 2mol/l tris 堿 1mol/l 乙酸 100 mmol/l edta 水 242g 57、1 ml 得冰乙酸(17、4 mol/l) 200ml 得 0、5 mol/l edta(ph 8、0) 補(bǔ)足 1l 5tris

26、- 硼酸(tbe) 緩沖液 成分及終濃度 配制 1l 溶液各成分得用量 445 mmol/l tris 堿 445 mmol/l 硼酸鹽 10 mmol/l edta 水 54g 27.5g 硼酸 20 ml 得 0、5 mol/l edta(ph 8、0) 補(bǔ)足 1l 染料 1 溴酚藍(lán)(bromophenol blue) 加 1g 水溶性鈉型溴酚藍(lán)于 100ml 水中,攪拌或渦旋混合直到完全溶解。 1 二甲苯青 ff(xylene cyanole ff) 溶解 1g 二甲苯青 ff 于足量水中,定容到 100ml。 10mg/ml 得溴化乙錠(ethidium bromide) 小心稱取 1

27、g 溴化乙錠,轉(zhuǎn)移到廣口瓶中,加 100ml 水,用磁力攪拌器攪拌直到完全溶解。用鋁箔包裹裝液管,于 4貯存。 凝膠上樣液(gel loading solutions) 6 堿性凝膠上樣液( 室溫貯存) 成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量 0、3 n 氫氧化鈉 6 mmol/l edta 18聚蔗糖(400 型) 0、15溴甲酚綠 0、25二甲苯青 ff 300ul 10n 氫氧化鈉 120ul 0、5mol/l edta(ph8、0) 1.8g 15mg 25mg 水 補(bǔ)足到 10ml 6聚 聚 蔗糖凝膠上樣液( 室溫貯存) 成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量 0、15溴

28、酚藍(lán) 0、15二甲苯青 ff 5 mmol/l edta 15聚蔗糖(400 型) 水 1、5ml 1溴酚藍(lán) 1、5ml 1二甲苯青 ff 100ul 0、5mol/l edta(ph8、0) 1.5g 補(bǔ)足到 10ml 6 溴酚藍(lán)/ 二甲苯青/ 聚蔗糖凝膠上樣液( 室溫貯存) 成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量 0、25溴酚藍(lán) 0、25二甲苯青 ff 15聚蔗糖(400 型) 水 2、5ml 1溴酚藍(lán) 2、5ml 1二甲苯青 ff 1.5g 補(bǔ)足到 10ml 6 甘油凝膠上樣液(4 貯存) 成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量 0、15溴酚藍(lán) 0、15二甲苯青 ff 5 m

29、mol/l edta 50甘油 水 1、5ml 1溴酚藍(lán) 1、5ml 1二甲苯青 ff 100ul 0、5mol/l edta(ph8、0) 3ml 3、9ml 6 蔗糖凝膠上樣液( 室溫貯存) 成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量 0、15溴酚藍(lán) 0、15二甲苯青 ff 5 mmol/l edta 40聚蔗糖 水 1、5ml 1溴酚藍(lán) 1、5ml 1二甲苯青 ff 100ul 0、5mol/l edta(ph8、0) 4g 補(bǔ)足到 10ml 10 十二烷基硫酸鈉/ 甘油凝膠上樣液( 室溫貯存) 成分及終濃度 配制 10ml 溶液各成分用量 0、2溴酚藍(lán) 0、2二甲苯青 ff 200

30、mmol/l edta 0、1sds 50甘油 水 20mg 20mg 4ml 0、5mol/l edta(ph8、0) 100ul 10 sds 5ml 補(bǔ)足到 10ml 三 、 常用培養(yǎng)基 1) lb 培養(yǎng)基 將下列組分溶解在 0.9l 水中: 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化鈉 10g 如果需要用1n naoh(1ml)調(diào)整ph至7、0,再補(bǔ)足水至1l。注:瓊脂平板需添加瓊脂粉12g/l,上層瓊脂平板添加瓊脂粉 7g/l。 sob 培養(yǎng)基 將下列組分溶解在 0.9l 水中: 蛋白胨 20g 酵母提取物 5g 氯化鈉 0.5g 1 mol/l 氯化鉀 2、5ml 用水補(bǔ)足體積到 1l

31、。分成 100ml 得小份,高壓滅菌。培養(yǎng)基冷卻到室溫后,再在每 100ml 得小份中加 1ml 滅過(guò)菌得 1mol/l 氯化鎂。 2)soc 培養(yǎng)基 成分、方法同 sob 培養(yǎng)基得配制,只就是在培養(yǎng)基冷卻到室溫后,除了在每 100ml 得小份中加1ml 滅過(guò)菌得 1mol/l 氯化鎂外,再加 2ml 滅菌得 1mol/l 葡萄糖(18g 葡萄糖溶于足夠水中,再用水補(bǔ)足到 100ml,用 0、22um 得濾膜過(guò)濾除菌)。 3)tb 培養(yǎng)基 將下列組分溶解在 0.9l 水中: 蛋白胨 12g 酵母提取物 24g 甘油 4ml 各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到 60,再加 100ml 滅菌得 170mmol/l kh2po4/0、72 mol/l k2hpo4 得溶液(2、31g 得 kh2po4 與 12、54gk2hpo4 溶在足量得水中,使終體積為 100ml。高壓滅菌或用 0、22um 得濾膜過(guò)濾除菌)。 4)2yt 培養(yǎng)基 將下列組分溶解在 0.9l 水中: 蛋白胨 16g 酵母提取物 10g 氯化鈉 4ml 如果需要用1n naoh(1ml)調(diào)整ph至7、0,再補(bǔ)足水至1l。注:瓊脂平板需添加瓊脂粉12g/l,上層瓊脂平板添加瓊脂粉