1、第七章 微生物代謝控制育種第一節第一節 概論概論第二節第二節 初級代謝的調節控制初級代謝的調節控制第三節第三節 次級代謝的調節控制次級代謝的調節控制第四節第四節 代謝調節控制育種代謝調節控制育種【4學時學時】 p.155第第3 3個轉折期：以個轉折期：以19561956年谷氨酸發酵成功為標志，發酵工業進年谷氨酸發酵成功為標志，發酵工業進入第入第3 3個轉折期個轉折期代謝控制發酵時期。代謝控制發酵時期。大體過程：大體過程：以生物化學和遺傳學為基礎，研究代謝產物的生物合成途徑以生物化學和遺傳學為基礎，研究代謝產物的生物合成途徑和代謝調節的機制，選擇巧妙的技術路線，通過遺傳育種技和代謝調節的機制，選

2、擇巧妙的技術路線，通過遺傳育種技術獲得解除或繞過微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為術獲得解除或繞過微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產物選擇性地大量合成和累積。地使有用產物選擇性地大量合成和累積。關鍵：關鍵：解除微生物代謝調控機制，打破微生物正常的代謝調節，人解除微生物代謝調控機制，打破微生物正常的代謝調節，人為地控制微生物的代謝。為地控制微生物的代謝。代謝控制育種和發酵過程的代謝控制培養是實現這一目標的兩代謝控制育種和發酵過程的代謝控制培養是實現這一目標的兩個手段，而其中前者是主要支柱技術。個手段，而其中前者是主要支柱技術。與個學科密不可分：生物化學、分子生物學和分子遺傳學、過與

3、個學科密不可分：生物化學、分子生物學和分子遺傳學、過程控制方法。程控制方法。第一節第一節 概論概論1、初級代謝產物和初級代謝、初級代謝產物和初級代謝2、次級代謝產物和次級代謝、次級代謝產物和次級代謝3、初級代謝與次級代謝的關系、初級代謝與次級代謝的關系1. 概念概念微生物產生的對自身生長和繁殖必須的物質稱為微生物產生的對自身生長和繁殖必須的物質稱為初級代初級代謝產物謝產物(可細分為中間產物和終產物可細分為中間產物和終產物)，產生這些物質的，產生這些物質的代謝體系稱為代謝體系稱為初級代謝初級代謝(primary metabolism)。2. 初級代謝體系的組成初級代謝體系的組成分解代謝體系分解代

4、謝體系生物合成體系生物合成體系素材性生物合成體系：小分子素材性生物合成體系：小分子結構性生物合成體系：大分子結構性生物合成體系：大分子1.1 初級代謝產物和初級代謝初級代謝產物和初級代謝次級代謝產物次級代謝產物：對產生它們的生物體本身不：對產生它們的生物體本身不需要的一種產物，也稱為需要的一種產物，也稱為次生產物次生產物。次級代謝次級代謝(secondary metabolism)：以初級代：以初級代謝產物為前體，合成次生產物的代謝體系。謝產物為前體，合成次生產物的代謝體系。1.2 次級代謝產物和次級代謝次級代謝產物和次級代謝1. 從菌體生化代謝角度分析從菌體生化代謝角度分析1.3 初級代謝與

5、次級代謝的關系初級代謝與次級代謝的關系2. 從遺傳代謝角度分析從遺傳代謝角度分析1.3 初級代謝與次級代謝的關系初級代謝與次級代謝的關系第二節第二節 初級代謝的調節控制初級代謝的調節控制1、酶合成的調節、酶合成的調節2、酶活性的調節、酶活性的調節3、反饋阻遏與反饋抑制、反饋阻遏與反饋抑制1、酶合成調節的類型、酶合成調節的類型 (1) 誘導誘導 (induction) 根據酶的生成是否與環境中存在的該酶底物或其有關物的根據酶的生成是否與環境中存在的該酶底物或其有關物的關系，可分為：關系，可分為：組成酶：組成酶：細胞固有的酶，相應基因控制合成，不受底物影響。細胞固有的酶，相應基因控制合成，不受底物

6、影響。誘導酶：誘導酶：適應外來物臨時合成的酶，受底物影響。適應外來物臨時合成的酶，受底物影響。2.1 2.1 酶合成的調節酶合成的調節 (2) 阻遏阻遏 (repression)末端產物阻遏末端產物阻遏(end-product repression)：由某代謝途徑末：由某代謝途徑末端產物過量累積而引起的阻遏。端產物過量累積而引起的阻遏。對于直線式反應途徑，情況較為簡單對于直線式反應途徑，情況較為簡單對于分支代謝途徑，情況較復雜：對于分支代謝途徑，情況較復雜：每種末端產物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的每種末端產物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。酶。代謝途徑分支點以前的公共酶受到所有分支

7、途徑末端代謝途徑分支點以前的公共酶受到所有分支途徑末端產物的阻遏，稱為產物的阻遏，稱為多價阻遏作用多價阻遏作用。分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏(catabolite repression)：有兩種碳源：有兩種碳源(或氮或氮源源)分解底物同時存在時，細胞利用快的那種分解底物時分解底物同時存在時，細胞利用快的那種分解底物時會阻遏利用慢的底物有關分解酶合成的現象。會阻遏利用慢的底物有關分解酶合成的現象。2.1 2.1 酶合成的調節酶合成的調節1 1、酶合成調節的類型、酶合成調節的類型1. 酶合成調節的機制酶合成調節的機制(1) 誘導型操縱子負調控誘導型操縱子負調控2.1 2.1 酶合成的調節酶合成的調

8、節 (2) 阻遏型操縱子正調控阻遏型操縱子正調控2.1 2.1 酶合成的調節酶合成的調節1. 1. 酶合成調節的機制酶合成調節的機制1、反饋抑制的類型、反饋抑制的類型 (A) 直線式代謝途徑中的反饋抑制直線式代謝途徑中的反饋抑制2.2 2.2 酶活性的調節酶活性的調節(B) 分支代謝途徑中的反饋抑制分支代謝途徑中的反饋抑制(1) 優先合成優先合成(2) 協同反饋抑制協同反饋抑制(concerted feedback inhibition)2.2 2.2 酶活性的調節酶活性的調節(3) 合作反饋抑制合作反饋抑制(cooperative feedback inhibition)2.2 2.2 酶活

9、性的調節酶活性的調節(B) 分支代謝途徑中的反饋抑制分支代謝途徑中的反饋抑制(4) 累積反饋抑制累積反饋抑制(cumulative feedback inhibition)2.2 2.2 酶活性的調節酶活性的調節(B) 分支代謝途徑中的反饋抑制分支代謝途徑中的反饋抑制(5) 同工酶調節同工酶調節2.2 2.2 酶活性的調節酶活性的調節(B) 分支代謝途徑中的反饋抑制分支代謝途徑中的反饋抑制(6) 順序反饋抑制順序反饋抑制2.2 2.2 酶活性的調節酶活性的調節(B) 分支代謝途徑中的反饋抑制分支代謝途徑中的反饋抑制2. 反饋抑制的機制反饋抑制的機制(1) 受反饋抑制的調節酶一般都是受反饋抑制的

10、調節酶一般都是變構酶變構酶(allosteric enzyme)，酶活力調控的實質就是變構酶的變構調節。酶活力調控的實質就是變構酶的變構調節。(2) 變構酶一般由兩個以上亞基組成，有兩個和低分子物質變構酶一般由兩個以上亞基組成，有兩個和低分子物質結合位點：結合位點：活性中心：與底物結合的催化中心活性中心：與底物結合的催化中心變構中心：與調節因子相結合的調節中心變構中心：與調節因子相結合的調節中心2.2 2.2 酶活性的調節酶活性的調節2.3 2.3 反饋阻遏與反饋抑制的比較反饋阻遏與反饋抑制的比較第三節第三節 次級代謝的調節控制次級代謝的調節控制抗生素的生物合成途徑中，反饋調節作用包括：抗生素

11、的生物合成途徑中，反饋調節作用包括：抗生素本身積累起著反饋調節作用抗生素本身積累起著反饋調節作用作為抗生素合成前體的初級代謝產物，當其受到反饋調節時，必然會影作為抗生素合成前體的初級代謝產物，當其受到反饋調節時，必然會影響抗生素的合成。響抗生素的合成。 因此，這些代謝調節機制實質上是提高抗生素發酵單位的天然因此，這些代謝調節機制實質上是提高抗生素發酵單位的天然屏障，如果使調節機制脫敏，將有可能提高抗生素的產量。屏障，如果使調節機制脫敏，將有可能提高抗生素的產量。第三節第三節 次級代謝的調節控制次級代謝的調節控制1. 次級代謝產物的誘導調節次級代謝產物的誘導調節2. 次級代謝產物碳源分解調節次級

12、代謝產物碳源分解調節3. 次級代謝產物氮源分解調節次級代謝產物氮源分解調節4. 次級代謝次級代謝反饋反饋調節調節5. 磷酸鹽調節磷酸鹽調節6. 細胞膜透性的調節細胞膜透性的調節 1. 兩種可能的誘導機制兩種可能的誘導機制誘導物誘導物刺激影響初級代謝，造成代謝流的改變刺激影響初級代謝，造成代謝流的改變大量生成次生代謝物大量生成次生代謝物誘導物誘導物次生代謝物合成酶的合成次生代謝物合成酶的合成大量生產次生大量生產次生代謝物代謝物2. 實例實例色氨酸對麥角堿的作用色氨酸對麥角堿的作用蛋氨酸對頭孢霉素蛋氨酸對頭孢霉素C的作用的作用3. 大多數分解代謝酶屬于誘導酶，可以通過加大多數分解代謝酶屬于誘導酶，

13、可以通過加入誘導物使酶的產量提高。入誘導物使酶的產量提高。3.1 3.1 次級代謝產物的誘導調節次級代謝產物的誘導調節1. 涉及對終產物阻遏涉及對終產物阻遏實例實例1：青霉素發酵過程中，葡萄糖不利于青霉素合成，而乳糖：青霉素發酵過程中，葡萄糖不利于青霉素合成，而乳糖雖利用緩慢，但能提高青霉素產量。雖利用緩慢，但能提高青霉素產量。實例實例2：頭孢霉素：頭孢霉素C的生物合成中，抗生素比產率遞減順序為：的生物合成中，抗生素比產率遞減順序為：蔗糖蔗糖半乳糖半乳糖果糖果糖麥芽糖麥芽糖葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的兩倍葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的兩倍多。多。3.2 次級代謝產物碳源分解調節次級代謝產物碳源分解調

14、節2. 抗生素受碳源分解調節的可能機制抗生素受碳源分解調節的可能機制(1) 可能與菌體生長速率控制抗生素合成有關。菌體可能與菌體生長速率控制抗生素合成有關。菌體生長最好的碳源能抑制抗生素合成，因此，在低生生長最好的碳源能抑制抗生素合成，因此，在低生長率的情況下長率的情況下(例如青霉素合成中緩慢補加葡萄糖例如青霉素合成中緩慢補加葡萄糖)可減少葡萄糖的干擾作用。可減少葡萄糖的干擾作用。(2) 可能與分解代謝產物的堆積濃度有關。乳糖之所可能與分解代謝產物的堆積濃度有關。乳糖之所以比葡萄糖優越，是因為前者被水解為可利用單糖以比葡萄糖優越，是因為前者被水解為可利用單糖的速度正好符合青霉素在生產期合成抗生

15、素的需要，的速度正好符合青霉素在生產期合成抗生素的需要，而不會有分解代謝產物如丙酮酸的堆積。而不會有分解代謝產物如丙酮酸的堆積。3.2 3.2 次級代謝產物碳源分解調節次級代謝產物碳源分解調節1.定義：定義：氮源分解調節主要指含氮底物的酶氮源分解調節主要指含氮底物的酶(如蛋如蛋白酶、硝酸還原酶、酰胺酶、組氨酸酶和脲酶白酶、硝酸還原酶、酰胺酶、組氨酸酶和脲酶)的的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。3.3 3.3 次級代謝產物氮源分解調節次級代謝產物氮源分解調節NH4+影響：影響：(1）pH值質子梯度值質子梯度 改變能量代謝改變能量代謝 細胞壁物質和細胞壁

16、物質和 結構的功能；結構的功能；(2)谷氨酰合成酶和丙谷氨酰合成酶和丙氨脫氫酶的合成；氨脫氫酶的合成；(3)高度磷酸化的核苷，高度磷酸化的核苷，如如ppGpp和和pppGpp可能通過可能通過級聯機制調節次級級聯機制調節次級代謝，而代謝，而ppGpp等等受氨基酸過量的負受氨基酸過量的負控制調節。控制調節。3.3 3.3 次級代謝產物氮源分解調節次級代謝產物氮源分解調節2. 2. 氮源分解調節的可能機制：氮源分解調節的可能機制：抗生素對自身產物抗生素對自身產物抑制的規律：抑制的規律： 抑制特定產生菌合成抗抑制特定產生菌合成抗生素所需濃度與生產水生素所需濃度與生產水平具有相關性，產生菌平具有相關性，

17、產生菌產量高，對自身抗生素產量高，對自身抗生素的耐受力強，反之則越的耐受力強，反之則越敏感。敏感。實例：氯霉素對芳基氨實例：氯霉素對芳基氨合成酶的合成酶的 反饋調節反饋調節3.4 3.4 次級代謝反饋調節次級代謝反饋調節1. 1. 次級代謝自身產物的反饋調節次級代謝自身產物的反饋調節2. 分支代謝初級代謝物反饋調節對次級代謝的影響分支代謝初級代謝物反饋調節對次級代謝的影響次級途徑和初級途徑具有共同的分叉中間體，由分叉中間體產生的初級次級途徑和初級途徑具有共同的分叉中間體，由分叉中間體產生的初級代謝產物的反饋調節可能影響次級代謝產物的形成。代謝產物的反饋調節可能影響次級代謝產物的形成。3.4 3

18、.4 次級代謝反饋調節次級代謝反饋調節實例實例1：賴氨酸對青：賴氨酸對青霉素生物合成的反霉素生物合成的反饋調節饋調節3.4 3.4 次級代謝反饋調節次級代謝反饋調節2. 2. 分支代謝初級代謝物反饋調節對次級代謝的影響分支代謝初級代謝物反饋調節對次級代謝的影響(1) (1) 次級途徑和初級途徑次級途徑和初級途徑具有共同的分叉中間體具有共同的分叉中間體實例實例2：色氨酸對殺假：色氨酸對殺假絲菌素生物合成的絲菌素生物合成的反饋調節反饋調節3.4 3.4 次級代謝反饋調節次級代謝反饋調節2. 2. 分支代謝初級代分支代謝初級代謝物反饋調節對次謝物反饋調節對次級代謝的影響級代謝的影響(1) (1) 次

19、級途徑和初級途徑次級途徑和初級途徑具有共同的分叉中間體具有共同的分叉中間體 (2) 初級代謝終產物作初級代謝終產物作為前體合成次生產物。為前體合成次生產物。實例：纈氨酸對實例：纈氨酸對青霉素生物合成青霉素生物合成的反饋調節的反饋調節3.4 3.4 次級代謝反饋調節次級代謝反饋調節2. 2. 分支代謝初級代謝物反饋調節對次級代謝的影響分支代謝初級代謝物反饋調節對次級代謝的影響在抗生素發酵中，在抗生素發酵中，加入前體可顯著加入前體可顯著增產，但前體加增產，但前體加入超過一定限度，入超過一定限度，將產生毒性。將產生毒性。3.4 3.4 次級代謝反饋調節次級代謝反饋調節2. 2. 分支代謝初級代謝物反

20、饋調節對次級代謝的影響分支代謝初級代謝物反饋調節對次級代謝的影響(2) 初級代謝終產物作為前體合成次生產物。初級代謝終產物作為前體合成次生產物。1.磷酸鹽的亞適量磷酸鹽的亞適量: 已發現過量磷酸鹽對四環素、氨基糖苷類和多已發現過量磷酸鹽對四環素、氨基糖苷類和多烯大環內酯類等烯大環內酯類等32種抗生素的生物合成產生阻種抗生素的生物合成產生阻抑作用。所以，在工業生產中，磷酸鹽常常被抑作用。所以，在工業生產中，磷酸鹽常常被控制在適合菌體生長的濃度以下，即所謂的亞控制在適合菌體生長的濃度以下，即所謂的亞適量。適量。2. 磷酸鹽調節抗生素的生物合成的機制磷酸鹽調節抗生素的生物合成的機制按效應來說，有直接

21、作用和間接效應；按效應來說，有直接作用和間接效應；具體而言，磷酸鹽能影響抗生素合成中磷酸酯酶和前具體而言，磷酸鹽能影響抗生素合成中磷酸酯酶和前體形成過程中某種酶的活性；體形成過程中某種酶的活性；ATP直接影響某些抗生直接影響某些抗生素合成和糖代謝中某些酶的活性。素合成和糖代謝中某些酶的活性。3.5 3.5 磷酸鹽調節磷酸鹽調節如果細胞膜對某種物質不能運輸或者運輸如果細胞膜對某種物質不能運輸或者運輸功能發生障礙，其結果是：功能發生障礙，其結果是：一方面，細胞內合成代謝的產物不能分泌到胞一方面，細胞內合成代謝的產物不能分泌到胞外，必然會產生反饋調節作用，影響發酵產物外，必然會產生反饋調節作用，影響

22、發酵產物的生產量；的生產量；另一方面，細胞外的營養物質不能進入細胞內，另一方面，細胞外的營養物質不能進入細胞內，從而影響產物的合成，造成產量下降。從而影響產物的合成，造成產量下降。3.6 3.6 細胞膜透性的調節細胞膜透性的調節第四節第四節 代謝調節控制育種代謝調節控制育種 p.171 代謝調節控制育種代謝調節控制育種通過特定突變型的選育，達到改通過特定突變型的選育，達到改變代謝通路、降低支路代謝終產物的產生或切斷支變代謝通路、降低支路代謝終產物的產生或切斷支路代謝途徑及提高細胞膜的透性，使代謝流向目的路代謝途徑及提高細胞膜的透性，使代謝流向目的產物積累方向進行。產物積累方向進行。代謝控制發酵

23、：將微生物通過人工誘變，獲得代謝發生改變的突變株，在控制條件下，選擇性地大量生產某種人們所需要的產品。抗反饋調節抗反饋調節突變株選育突變株選育1. 概念：指操縱基因或調節基因突變引起酶合成誘導機制概念：指操縱基因或調節基因突變引起酶合成誘導機制失靈，菌株不經誘導也能合成酶、或不受終產物阻遏的調失靈，菌株不經誘導也能合成酶、或不受終產物阻遏的調節突變型。節突變型。調節基因突變，致使不能形成活性化的阻抑物；調節基因突變，致使不能形成活性化的阻抑物；操縱基因突變，喪失和阻抑物結合的親和力。操縱基因突變，喪失和阻抑物結合的親和力。 因此，可以利用一些易同化碳源或價廉易得的碳源作為因此，可以利用一些易同

24、化碳源或價廉易得的碳源作為基質生產所需的誘導酶類。基質生產所需的誘導酶類。2. 篩選方法及實例篩選方法及實例(1) 限量誘導物恒化培養限量誘導物恒化培養(2) 循環培養循環培養(3) 鑒別性培養基的利用鑒別性培養基的利用(4) 篩選篩選4.1 4.1 組成型突變株的選育組成型突變株的選育 (1) 限量誘導物恒化培養限量誘導物恒化培養將野生型菌種經誘變后移接到低將野生型菌種經誘變后移接到低濃度誘導物的恒化器中連續培養濃度誘導物的恒化器中連續培養由于底物濃度低到對由于底物濃度低到對野生型不發生誘導作野生型不發生誘導作用，所以誘導型的野用，所以誘導型的野生菌不能生長生菌不能生長突變株由于不經誘導突變

25、株由于不經誘導即可產生誘導酶而利即可產生誘導酶而利用底物，因而得以生用底物，因而得以生長成為組成型菌株長成為組成型菌株4.1 4.1 組成型突變株的選育組成型突變株的選育2. 2. 篩選方法及實例篩選方法及實例 (2) 循環培養循環培養含有誘導物含有誘導物的培養基的培養基不含誘導物不含誘導物的培養基的培養基交替連續循環培養交替連續循環培養由于組成型突變株在兩種培養基由于組成型突變株在兩種培養基上都能產酶，生長逐漸占優勢上都能產酶，生長逐漸占優勢4.1 4.1 組成型突變株的選育組成型突變株的選育2. 2. 篩選方法及實例篩選方法及實例(3) 鑒別性培養基的利用鑒別性培養基的利用甘油作惟甘油作惟

26、一碳源一碳源涂布誘涂布誘變孢子變孢子懸液懸液噴上噴上O-O-硝基苯酚硝基苯酚-D-D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)(ONPG)組成型組成型誘導型誘導型4.1 4.1 組成型突變株的選育組成型突變株的選育2. 2. 篩選方法及實例篩選方法及實例 (4) 篩選篩選經誘變劑處理后的菌體移接到含有誘導能力低，經誘變劑處理后的菌體移接到含有誘導能力低，但能作為良好碳源的誘導物的培養基中培養，但能作為良好碳源的誘導物的培養基中培養，突變體能良好生長，野生型不能生長。突變體能良好生長，野生型不能生長。例如：利用苯例如：利用苯-半乳糖半乳糖(PG)篩選篩選-半乳糖苷酶組成半乳糖苷酶組成型突變株。型突變株。4.

27、1 4.1 組成型突變株的選育組成型突變株的選育2. 2. 篩選方法及實例篩選方法及實例概念：抗分解阻遏和抗分解抑制的突變株。概念：抗分解阻遏和抗分解抑制的突變株。分解代謝阻遏現象：在初級或次級代謝中都存在，其含分解代謝阻遏現象：在初級或次級代謝中都存在，其含義是指代謝過程中酶的合成往往受高濃度的葡萄糖或其義是指代謝過程中酶的合成往往受高濃度的葡萄糖或其他易分解利用的碳源或氮源所抑制。他易分解利用的碳源或氮源所抑制。選育抗分解調節突變株選育抗分解調節突變株(如碳源、氮源或磷酸鹽分解調節如碳源、氮源或磷酸鹽分解調節)，其實就是篩選合成酶的產生不受碳、氮、磷的代謝阻遏其實就是篩選合成酶的產生不受碳

28、、氮、磷的代謝阻遏或抑制的突變株，使抗生素提前到菌體生長期開始合成，或抑制的突變株，使抗生素提前到菌體生長期開始合成，延長產抗期以提高產量。延長產抗期以提高產量。4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調節突變株的選育 篩選此類突變株的目的篩選此類突變株的目的由于葡萄糖分解產物的積累，阻遏抗生素合成的關鍵酶，由于葡萄糖分解產物的積累，阻遏抗生素合成的關鍵酶，從而抑制抗生素的合成。在實際生產中，采用流加葡萄從而抑制抗生素的合成。在實際生產中，采用流加葡萄糖或應用混合碳源可以控制分解中間產物的累積來減少糖或應用混合碳源可以控制分解中間產物的累積來減少不利影響，但最根本的辦法則是篩選抗碳源分解調

29、節突不利影響，但最根本的辦法則是篩選抗碳源分解調節突變株，以解除上述調節機制，達到增產的目的。變株，以解除上述調節機制，達到增產的目的。 篩選方法與實例篩選方法與實例(1) 循環培養法循環培養法(2) 鑒別性培養基鑒別性培養基(3) 特殊氮源特殊氮源(4) 葡萄糖結構類似物葡萄糖結構類似物4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調節突變株的選育1. 1. 解除碳源調節突變株的選育解除碳源調節突變株的選育(1) 循環培養法循環培養法快速利用的快速利用的碳源培養基碳源培養基慢速利用的慢速利用的碳源培養基碳源培養基交替培養交替培養突變型解除了阻遏現象，在乳糖突變型解除了阻遏現象，在乳糖的培養基上

30、比野生型生長速度快，的培養基上比野生型生長速度快，4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調節突變株的選育1. 1. 解除碳源調節突變株的選育解除碳源調節突變株的選育(2) 鑒別性培養基鑒別性培養基含有葡萄含有葡萄糖的瓊脂糖的瓊脂平板平板涂布誘涂布誘變后的變后的菌體菌體噴上噴上O-O-硝基苯酚硝基苯酚- -D-D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)(ONPG)突變型突變型野生型野生型4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調節突變株的選育1. 1. 解除碳源調節突變株的選育解除碳源調節突變株的選育(3) 特殊氮源特殊氮源用葡萄糖為碳源，受阻遏酶的底物作為惟一氮源用葡萄糖為碳源，受阻遏酶的底物

31、作為惟一氮源配制成培養基，連續移接誘變后的產氣桿菌配制成培養基，連續移接誘變后的產氣桿菌(Aerobacters aerogenes)，可以篩選出不受葡萄糖，可以篩選出不受葡萄糖阻遏的組氨酸酶突變株。阻遏的組氨酸酶突變株。4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調節突變株的選育1. 1. 解除碳源調節突變株的選育解除碳源調節突變株的選育(4) 葡萄糖結構類似物葡萄糖結構類似物 特性：特性：2-dG和和3-mG既不被微生物代謝又具有分解既不被微生物代謝又具有分解阻遏作用，因此可用來篩選抗分解阻遏的突變株。阻遏作用，因此可用來篩選抗分解阻遏的突變株。2-dG3-mG4.2 4.2 抗分解調節突

32、變株的選育抗分解調節突變株的選育1. 1. 解除碳源調節突變株的選育解除碳源調節突變株的選育 篩選方法篩選方法培養基要求含低濃度培養基要求含低濃度2-dG或或3-mG及一種生長碳源，該及一種生長碳源，該碳源必須經相應的誘導酶水解才能被微生物同化利用。碳源必須經相應的誘導酶水解才能被微生物同化利用。 抗性突變株的性質抗性突變株的性質應用應用2-dG或或3-mG不僅可以定向選育分解阻遏脫敏突變不僅可以定向選育分解阻遏脫敏突變株，也可有效地分離到高產菌株。株，也可有效地分離到高產菌株。4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調節突變株的選育1. 1. 解除碳源調節突變株的選育解除碳源調節突變株的

33、選育(4) (4) 葡萄糖結構類似物葡萄糖結構類似物2. 解除氮源分解調節突變株的選育解除氮源分解調節突變株的選育氮源分解調節：指含氮產物的酶受快速利用的氮源阻遏。氮源分解調節：指含氮產物的酶受快速利用的氮源阻遏。類型：細菌、酵母、霉菌等微生物對初級代謝產物的氮類型：細菌、酵母、霉菌等微生物對初級代謝產物的氮降解物具有調節作用。次級代謝的氮降解物的阻遏主要降解物具有調節作用。次級代謝的氮降解物的阻遏主要指銨鹽和其他快速利用的氮源對抗生素生物合成具有分指銨鹽和其他快速利用的氮源對抗生素生物合成具有分解調節作用。解調節作用。實例：篩選芽孢桿菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶產實例：篩選芽孢桿菌中耐氨基

34、酸菌株，是提高蛋白酶產量的一種有效方法。量的一種有效方法。4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調節突變株的選育3. 解除磷酸鹽調節突變株的選育解除磷酸鹽調節突變株的選育（A）磷酸鹽對次生產物的調節機制）磷酸鹽對次生產物的調節機制(1) 通過初級代謝的變化影響次級代謝通過初級代謝的變化影響次級代謝 加強初級代謝，推遲抗生素合成的起始；加強初級代謝，推遲抗生素合成的起始； 改變糖類分解代謝途徑，磷酸鹽有利于糖酵解，改變糖類分解代謝途徑，磷酸鹽有利于糖酵解，從而降低戊糖途徑的活力，導致某些以戊糖途徑為從而降低戊糖途徑的活力，導致某些以戊糖途徑為先導的抗生素合成受抑制；先導的抗生素合成受抑制；

35、 限制抗生素合成的誘導物；限制抗生素合成的誘導物； 抑制或阻遏磷酸脂酶類的合成。抑制或阻遏磷酸脂酶類的合成。(2) 磷酸鹽對磷酸鹽對ATP調節：磷酸鹽可能通過調節細胞內調節：磷酸鹽可能通過調節細胞內的效應物的效應物cAMP、ATP等來控制抗生素的基因表達。等來控制抗生素的基因表達。4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調節突變株的選育（B） 發酵過程中對磷酸鹽的控制發酵過程中對磷酸鹽的控制其添加濃度要嚴格限制在亞適量的水平，但最主要的目其添加濃度要嚴格限制在亞適量的水平，但最主要的目標是選育解除磷酸鹽調節突變株。標是選育解除磷酸鹽調節突變株。4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調

36、節突變株的選育3. 3. 解除磷酸鹽調節突變株的選育解除磷酸鹽調節突變株的選育 （C）抗磷酸突變）抗磷酸突變株的篩選方法株的篩選方法4.2 4.2 抗分解調節突變株的選育抗分解調節突變株的選育3. 3. 解除磷酸解除磷酸 鹽鹽調節突變株的調節突變株的選育選育 營養缺陷型突變株的特性：營養缺陷型突變株的特性： （1）代謝障礙突變株，由結構基因突變引起合成代謝中一個）代謝障礙突變株，由結構基因突變引起合成代謝中一個酶失活，使某個生化反應發生遺傳性障礙，使菌株喪失合成酶失活，使某個生化反應發生遺傳性障礙，使菌株喪失合成某種物質的能力，導致該菌株在培養基中不添加這種物質就某種物質的能力，導致該菌株在培

37、養基中不添加這種物質就無法生長。無法生長。 （2）營養缺陷型菌株常常會使發生障礙的前一步的中間代謝）營養缺陷型菌株常常會使發生障礙的前一步的中間代謝產物得到累積，這就成為利用營養缺陷型菌株進行工業發酵產物得到累積，這就成為利用營養缺陷型菌株進行工業發酵來積累有用中間代謝產物的依據。來積累有用中間代謝產物的依據。 （3）營養缺陷型菌株由于生物合成途徑中某一步發生障礙，）營養缺陷型菌株由于生物合成途徑中某一步發生障礙，合成反應不能完成，從而解除了終產物反饋阻抑。外加限量合成反應不能完成，從而解除了終產物反饋阻抑。外加限量需要的營養物質，克服生長的障礙，使終產物不至于積累到需要的營養物質，克服生長的

38、障礙，使終產物不至于積累到引起反饋調節的濃度，從而有利于中間產物或另一途徑的某引起反饋調節的濃度，從而有利于中間產物或另一途徑的某種終產物的積累。種終產物的積累。4.3 4.3 營養缺陷型在代謝調節育種中的應用營養缺陷型在代謝調節育種中的應用1、在初級代謝調節育種中、在初級代謝調節育種中 的的應用應用（1）直線式生物合成途徑）直線式生物合成途徑4.3 4.3 營養缺陷型在代謝調節育種中的應用營養缺陷型在代謝調節育種中的應用 （2） 分支式生物分支式生物合成途徑合成途徑 實例實例1：谷氨酸：谷氨酸棒狀桿菌的棒狀桿菌的L-谷氨酸生物合谷氨酸生物合成途徑成途徑生物素缺陷型生物素缺陷型硫胺素缺陷型硫胺

39、素缺陷型4.3 4.3 營養缺陷型在代謝調節育種中的應用營養缺陷型在代謝調節育種中的應用1 1、在初級代謝調節育種中的應用、在初級代謝調節育種中的應用實例實例2：谷氨酸棒狀桿菌的腺核苷酸、鳥核苷酸的合：谷氨酸棒狀桿菌的腺核苷酸、鳥核苷酸的合成代謝途徑成代謝途徑腺嘌呤缺陷型腺嘌呤缺陷型協同反饋抑制協同反饋抑制實例實例3 高絲氨酸營養缺陷型菌株的賴氨酸合成途徑高絲氨酸營養缺陷型菌株的賴氨酸合成途徑高絲氨酸缺陷型高絲氨酸缺陷型協同反饋抑制協同反饋抑制2. 在次級代謝調節育種中的應用在次級代謝調節育種中的應用（1）抗生素增產：抗生素產生菌的營養缺陷株多數生產能力）抗生素增產：抗生素產生菌的營養缺陷株多

40、數生產能力是下降的。然而，在初級或次級代謝產物的分支代謝途徑中，是下降的。然而，在初級或次級代謝產物的分支代謝途徑中，營養缺陷型切斷初級代謝支路，有可能使抗生素增產。營養缺陷型切斷初級代謝支路，有可能使抗生素增產。4.3 4.3 營養缺陷型在代謝調節育種中的應用營養缺陷型在代謝調節育種中的應用實例：四環素、制霉菌素產生菌的脂肪酸缺陷型實例：四環素、制霉菌素產生菌的脂肪酸缺陷型可增加抗生素。可增加抗生素。脂肪酸缺陷型脂肪酸缺陷型 （2）新產品）新產品 實例：實例： 金霉素第六碳原子上金霉素第六碳原子上甲基是由氮氨酸供甲基是由氮氨酸供應的，如果獲得蛋應的，如果獲得蛋氨酸缺陷型，阻斷氨酸缺陷型，阻斷

41、了蛋氨酸這一區段了蛋氨酸這一區段的合成，導致次級的合成，導致次級代謝中甲基供給受代謝中甲基供給受到限制，結果產生到限制，結果產生去甲基金霉素，而去甲基金霉素，而不產生金霉素。不產生金霉素。4.3 4.3 營養缺陷型在代謝調節育種中的應用營養缺陷型在代謝調節育種中的應用2. 2. 在次級代謝調節育種中的應用在次級代謝調節育種中的應用概念：滲漏缺陷型概念：滲漏缺陷型(leaky mutants)是一種特殊的營是一種特殊的營養缺陷型，是遺傳性代謝障礙不完全的突變型。其養缺陷型，是遺傳性代謝障礙不完全的突變型。其特點是酶活力下降而不完全喪失，并能在基本培養特點是酶活力下降而不完全喪失，并能在基本培養基

42、上少量生長。基上少量生長。篩選的方法：將大量營養缺陷型菌株接種到基本培篩選的方法：將大量營養缺陷型菌株接種到基本培養基平板上，挑選生長特別慢而菌落小的即可。養基平板上，挑選生長特別慢而菌落小的即可。應用：正是利用了滲漏缺陷型既能少量合成代謝終應用：正是利用了滲漏缺陷型既能少量合成代謝終產物，又不造成反饋抑制的特點。產物，又不造成反饋抑制的特點。4.4 4.4 滲漏缺陷型在代謝調節育種中的應用滲漏缺陷型在代謝調節育種中的應用概念：抗反饋調節突變株是一種解除合成代謝反饋調節機概念：抗反饋調節突變株是一種解除合成代謝反饋調節機制的突變型菌株。其特點是所需產物不斷積累，不會因其制的突變型菌株。其特點是

43、所需產物不斷積累，不會因其濃度超量而終止生產：濃度超量而終止生產：如果由于結構基因突變而使變構酶成為不能和代謝終產物相結如果由于結構基因突變而使變構酶成為不能和代謝終產物相結合的，便是失去了反饋抑制的突變，稱為合的，便是失去了反饋抑制的突變，稱為“抗反饋突變型抗反饋突變型”；如果是由于調節基因突變引起調節蛋白不能和代謝終產物相結如果是由于調節基因突變引起調節蛋白不能和代謝終產物相結合而失去阻遏作用的，稱為合而失去阻遏作用的，稱為“抗阻遏突變型抗阻遏突變型”。 一般而言，抗阻遏突變結果使胞內酶有可能成倍增長，而一般而言，抗阻遏突變結果使胞內酶有可能成倍增長，而抗反饋突變的胞內酶量沒有什么變化。但

44、從作用效果上講，抗反饋突變的胞內酶量沒有什么變化。但從作用效果上講，均造成終產物大量積累，而且往往兩種突變同時發生，難均造成終產物大量積累，而且往往兩種突變同時發生，難以區別。通常就統稱為以區別。通常就統稱為“抗反饋調節突變型抗反饋調節突變型”。4.5 4.5 抗反饋調節突變株的選育抗反饋調節突變株的選育在實際應用中，抗反饋調節突變株的選育可在實際應用中，抗反饋調節突變株的選育可以通過以下幾個方面：以通過以下幾個方面：從遺傳上解除反饋調節從遺傳上解除反饋調節 (如各種抗性和耐性育種、如各種抗性和耐性育種、回復突變子的應用等回復突變子的應用等)截流或減少終產物堆積截流或減少終產物堆積 (如借助營

45、養缺陷型或采用如借助營養缺陷型或采用滲漏缺陷型等滲漏缺陷型等)移去終產物移去終產物 (借助膜透性的突變等借助膜透性的突變等)4.5 4.5 抗反饋調節突變株的選育抗反饋調節突變株的選育1、回復突變引起的抗反饋調節突變株、回復突變引起的抗反饋調節突變株2、耐自身產物突變株選育、耐自身產物突變株選育3、抗終產物結構類似物突變株的選育、抗終產物結構類似物突變株的選育4、累積前體和耐前體突變株的選育、累積前體和耐前體突變株的選育4.5 抗反饋調節突變株的選育抗反饋調節突變株的選育1. 概念：一種可逆性突變，即具有突變型基因的個體通過再突變概念：一種可逆性突變，即具有突變型基因的個體通過再突變又成為野生

46、型表型的過程。又成為野生型表型的過程。2. 產生的原因產生的原因(1) 原有基因的回復突變：指基因內部位點突變引起的逆向突變現象，分以下原有基因的回復突變：指基因內部位點突變引起的逆向突變現象，分以下兩種情況：兩種情況： 同一基因內的同一個或幾個堿基的突變引起的回復，消除了原有突變同一基因內的同一個或幾個堿基的突變引起的回復，消除了原有突變效應，完全恢復野生基因型及其功能，即真正的回復突變；效應，完全恢復野生基因型及其功能，即真正的回復突變； 在同一基因內，但不同的位點堿基的變化，改變了基因的核苷酸序列，在同一基因內，但不同的位點堿基的變化，改變了基因的核苷酸序列，補償了原有突變點已失去的功能

47、，使其出現野生表型，稱為基因內抑制補償了原有突變點已失去的功能，使其出現野生表型，稱為基因內抑制突變。突變。4.5.1 4.5.1 回復突變引起的抗反饋調節突變株回復突變引起的抗反饋調節突變株(2) 非原有基因的回復突變非原有基因的回復突變概念：在概念：在DNA分子鏈上的一個基因突變成為突變分子鏈上的一個基因突變成為突變型，隨后在鄰近的基因某位點堿基發生突變，抑型，隨后在鄰近的基因某位點堿基發生突變，抑制了前一個突變基因的效應，重新出現野生型的制了前一個突變基因的效應，重新出現野生型的表型，又稱為抑制基因突變。表型，又稱為抑制基因突變。4.5.1 4.5.1 回復突變引起的抗反饋調節突變株回復

48、突變引起的抗反饋調節突變株2. 2. 產生的原因產生的原因 區別基因回復突變和抑制基因突變的方法區別基因回復突變和抑制基因突變的方法將回復突變菌株和野生型菌株進行回交試驗或雜交將回復突變菌株和野生型菌株進行回交試驗或雜交重組試驗，觀察它們的子代是否有突變型出現：重組試驗，觀察它們的子代是否有突變型出現： 有同樣的突變型重新出現，說明回復突變和原來突變有同樣的突變型重新出現，說明回復突變和原來突變型不在同一位置而是分開的，屬于抑制基因回復突變株；型不在同一位置而是分開的，屬于抑制基因回復突變株； 如果雜交后代沒有產生突變型，表明回復突變的位置如果雜交后代沒有產生突變型，表明回復突變的位置與原突變

49、型位點相同，是真正的回復突變。與原突變型位點相同，是真正的回復突變。4.5.1 4.5.1 回復突變引起的抗反饋調節突變株回復突變引起的抗反饋調節突變株3. 回復突變引起的抗反饋調節突變株的篩選回復突變引起的抗反饋調節突變株的篩選 (1) 初級代謝途徑障礙性回復突變型初級代謝途徑障礙性回復突變型采用回復突變方法來篩選抗反饋調節突變株是根據采用回復突變方法來篩選抗反饋調節突變株是根據“原原養型養型營缺型營缺型原養型原養型”選育途徑進行的。二次突變后選育途徑進行的。二次突變后的情況有以下兩種：的情況有以下兩種： 一種是在原位點發生回復突變，恢復野生型酶活力；一種是在原位點發生回復突變，恢復野生型酶

50、活力； 另一種是在原突變位點以外位置回復突變。這種回復突變體的另一種是在原突變位點以外位置回復突變。這種回復突變體的表型雖然與原養型相似，但基因型不同，它并不是原有結構基因表型雖然與原養型相似，但基因型不同，它并不是原有結構基因的恢復，而是反饋調節變構酶的調節中心發生突變造成。突變后的恢復，而是反饋調節變構酶的調節中心發生突變造成。突變后的調節中心與活性中心相互影響，催化位點得以恢復酶活力，由的調節中心與活性中心相互影響，催化位點得以恢復酶活力，由于調節位點已發生突變，它不能再和阻遏物結合，因此，回復突于調節位點已發生突變，它不能再和阻遏物結合，因此，回復突變解除了反饋調節機制，使有效代謝產物

51、大量累積。變解除了反饋調節機制，使有效代謝產物大量累積。4.5.1 4.5.1 回復突變引起的抗反饋調節突變株回復突變引起的抗反饋調節突變株 (2) 次級代謝途徑障礙性的回復突變次級代謝途徑障礙性的回復突變次級代謝回復突變，是一種初級代謝途徑或次級代謝途徑障次級代謝回復突變，是一種初級代謝途徑或次級代謝途徑障礙性回復突變型。例如金霉素回復突變就是利用礙性回復突變型。例如金霉素回復突變就是利用“原養型原養型營缺型營缺型原養型原養型”選育途徑進行的，獲得了增產。選育途徑進行的，獲得了增產。除放線菌外，真核微生物獲得高活性的回復突變的例子不多。除放線菌外，真核微生物獲得高活性的回復突變的例子不多。回

52、復突變的選育途徑也可以應用回復突變的選育途徑也可以應用“零變株零變株”的回復突變型來的回復突變型來達到超產目的。達到超產目的。“零變株零變株”指完全失去產生抗生素能力的突變株；指完全失去產生抗生素能力的突變株；選育途徑是：原養型選育途徑是：原養型零變株零變株回復突變型。回復突變型。“零突變零突變”可以發生在初級代謝，也可以發生在次生代謝途徑中，總可以發生在初級代謝，也可以發生在次生代謝途徑中，總之是失去了產量的代謝障礙突變。之是失去了產量的代謝障礙突變。“零變株零變株”的回復突變株的篩選的回復突變株的篩選4.5.1 4.5.1 回復突變引起的抗反饋調節突變株回復突變引起的抗反饋調節突變株3.

53、3. 回復突變引起的抗反饋調節突變株的篩選回復突變引起的抗反饋調節突變株的篩選發生障礙性突變的營養缺陷型，抗生素產量大多數發生障礙性突變的營養缺陷型，抗生素產量大多數都比親株低，而回復突變株往往比原養型親株高。都比親株低，而回復突變株往往比原養型親株高。原因在于：原因在于：A. 缺陷型菌株中幾種不能合成的氨基酸都是參與相應抗缺陷型菌株中幾種不能合成的氨基酸都是參與相應抗生素生物合成的，基因突變的結果是使菌體喪失參與合生素生物合成的，基因突變的結果是使菌體喪失參與合成這些氨基酸的酶活力，導致有關抗生素合成過程因缺成這些氨基酸的酶活力，導致有關抗生素合成過程因缺乏氨基酸而產量下降。乏氨基酸而產量下

54、降。B. 回復突變除原變異位點發生逆轉突變而使野生型基因回復突變除原變異位點發生逆轉突變而使野生型基因重建以外，有時還會發生原突變位點以外的基因內抑制重建以外，有時還會發生原突變位點以外的基因內抑制或抑制基因突變。或抑制基因突變。自身代謝產物，包括初級代謝產物和次級代謝產物。自身代謝產物，包括初級代謝產物和次級代謝產物。微生物控制初級代謝產物的反饋機制相當嚴格；微生物控制初級代謝產物的反饋機制相當嚴格；對次生產物，反饋調節機制也起重要作用。對次生產物，反饋調節機制也起重要作用。 要使這些產物適量生產，必須繞過這些調節機制。要使這些產物適量生產，必須繞過這些調節機制。一個菌株的生產能力與耐自身抗

55、生素的濃度是成正相關的。一個菌株的生產能力與耐自身抗生素的濃度是成正相關的。抗自身產物能力是高產菌株的特性之一。抗自身產物能力是高產菌株的特性之一。除耐自身產物之外，還可以考慮與以下情況結合進行：除耐自身產物之外，還可以考慮與以下情況結合進行：第一，抗第一，抗Mg 2離子突變離子突變第二，許多抗生素的鈍化酶已知作為選擇性標記，設想篩選高活第二，許多抗生素的鈍化酶已知作為選擇性標記，設想篩選高活性鈍化酶的變株，其自身耐性亦會提高。性鈍化酶的變株，其自身耐性亦會提高。 鈍化酶：又稱合成酶，可催化某些基團結合到抗生素的鈍化酶：又稱合成酶，可催化某些基團結合到抗生素的OH基或基或NH2基上，使抗生素失

56、活。基上，使抗生素失活。 4.5.2 4.5.2 耐自身產物突變株選育耐自身產物突變株選育1. 結構類似物是指那些在結構上和代謝終產物結構類似物是指那些在結構上和代謝終產物(氨基酸、嘌呤、維生素等氨基酸、嘌呤、維生素等)相似相似的物質。它們和終產物一樣能夠和變構酶的調節蛋白結合，起共遏物作用，的物質。它們和終產物一樣能夠和變構酶的調節蛋白結合，起共遏物作用，用酶變構引起反饋阻抑；所不同的是，終產物與酶結合是可逆的，而類似物用酶變構引起反饋阻抑；所不同的是，終產物與酶結合是可逆的，而類似物由于不真正摻入細胞結構，酶活性不會恢復，因而是由于不真正摻入細胞結構，酶活性不會恢復，因而是“假反饋抑制假反饋抑制”。4.5.3 4.5.3 抗終產物結構類似物突變株的選育抗終產物結構類似物突變株的選育2. 結構類似物對微生物是致死的，它們往往具有抑菌的作用。結構類似物對微生物是致死的，它們往往具有抑菌的作用。在含有結構類似物的培養基上野生型是不能生長，然而抗結在含有結構類似