1、.SARSW毒滅活疫苗臨床前研究技術要點等技術要求的通知狀態：有效 發布日期：2003-08-19 生效日期：2003-08-19發布部門：廣東省藥品監督管理局發布文號：粵藥監注2003240號各市藥品監督管理局：現將國家食品藥品監督管理局關于印發 SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術要點等 技術要求的通知（國食藥監注 2003128號）轉發給你們，請通知從事 SARSB治藥物研 究開發的單位遵照執行。二。三年八月十九日關于印發SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術要點等技術要求的通知國食藥監注2003128號各省、自治區、直轄市藥品監督管理局：為加強SARS診斷試劑、疫苗以及防治藥物篩選研發工作的

2、管理，規范技術研究及實驗方法，確保研究結果真實可靠，我局組織制定了SARSW毒滅活疫苗臨床前研究技術要點、細胞模型篩選抗 SARSW毒藥物試驗技術要求、SARS斷試劑生產研制技術要求及SARSW毒毒株資料登記表等技術要求，現予印發，請從事SARSB治藥物研發的單位遵照執行，并就相關問題通知如下：一、從事SARSS苗研究、診斷試劑研制和有關藥物篩選等工作的單位，在執行相關技 術要求的同時，必須嚴格按照科學技術部、衛生部、國家食品藥品監督管理局和國家環境 保護總局四部局聯合頒發的關于印發傳染性非典型肺炎病毒實驗室暫行管理辦法和傳染性非典型肺炎病毒的毒種保存、使用和感染動物模型的暫行管理辦法的通知（

3、國科發農社字2003129號）要求保存和使用 SARSW毒毒株，任何單位不得擅自進行 毒株的轉讓。因SARSW毒毒株保存或者使用不當引起嚴重后果者，將承擔相應的法律責 任。二、各藥物研究開發單位應按照SARSW毒毒株資料登記表的要求整理有關毒株的詳細資料，于2003年7月31日前報中國藥品生物制品檢定所（北京天壇西里2號，郵編100050;聯系人：董關木；聯系電話：）。未按規定要求提交 SARSW毒毒株 資料的，國家食品藥品監督管理局將不受理其研發制品的注冊申報和審批。三、中國藥品生物制品檢定所接到各單位報送的SARSW毒毒株資料后，應及時審核并將審核意見和進行藥物

4、研究用毒種的基本情況，書面報國家食品藥品監督管理局。四、請各省、自治區、直轄市藥品監督管理局盡快將本通知轉發至轄區內從事SAR斯治藥物研究開發單位。特此通知附件：1. SARSW毒滅活疫苗臨床前研究技術要點2. 細胞模型篩選抗 SARSW毒藥物試驗技術要求3. SAR淤斷試劑生產研制技術要求4. SARSW毒毒株資料登記表（略）國家食品藥品監督管理局二。三年七月一日附件 1：SARSW毒滅活疫苗臨床前研究技術要點隨著對非典型肺炎的病原學、流行病學、診斷和治療等學科進行全面深入的研究，在各領域已取得重要進展，尤其是確定了SARSW毒為其病原體，已成功分離到多株SARSW毒，并已驗證其能在Vero

5、細胞和2BS等細胞系中培養增殖，這為研制疫苗提供了基礎和基本條件。但是由于 SARSW毒的研究有待進一步深入，疫苗的研制尚存在很多的不確定因 素。為使SARSW毒滅活疫苗的臨床前研究工作科學規范，特制定SARSW毒滅活疫苗臨床前研究考慮要點。一、毒種研究本疫苗所用的毒種須證明為SARSW毒，如該毒種分離自人體，須提供以下資料（一）病毒株名稱及來源1名稱2宿主情況：（ 1）病人姓名、年齡、性別、民族、家庭住址；（ 2）發病地點、發病日期；（ 3）收住入院日期、臨床確診日期、實驗室確診日期；（ 4）病人病程及病人轉歸：死亡、痊愈、是否有后遺癥；（ 5）毒株分離原樣本：咽試子、漱口液、痰液、血液、糞

6、便或尸解標本組織名稱；（ 6）取樣日期；.（ 7）取樣時病人的病期；（ 8）取樣地點；（ 9）病人是否留有恢復期血清；如有：采血日期（病期）和血清量；鑒于人類咽試子、漱口液、痰液、糞便等樣品難免污染其他外原因子，因此建議盡可能采用病人血液分離的病毒株。（二）毒株分離過程1用細胞分離病毒，須提供所用細胞名稱、代次、來源和細胞無菌檢測、外原因子檢測等資料；鑒于 Vero E6細胞的生物學特性，用 Vero E6細胞分離的SARSW毒不能直接 用于疫苗生產用毒種，須將 Vero E6細胞的適應株重新轉適應到Vero細胞或二倍體細胞株的毒種方能用于生產，因此建議盡可能使用直接以 Vero 細胞或二倍體

7、細胞株分離的毒 種。2通過動物分離病毒，須提供所用動物名稱、動物品系、動物級別、動物年齡和制備毒種的動物臟器名稱等資料；如再適應到細胞，則還須提供 1 項中的 6 所述的細胞資 料。（三）病毒分離傳代特性樣品處理方法、首次盲傳確證病毒陽性代次、病毒確證檢定方法、每代培養天數、病毒滴度、滴定方法、動物是否發病或死亡等資料。（四）毒種建立和保存原始毒種代次、毒種病毒滴度、毒種添加的保護劑的名稱和濃度、毒種存儲條件。毒種批的建立應按中國生物制品規程疫苗毒種要求進行，應建立原始毒種、主毒種和工作毒種批三級毒種庫，主種子和工作種子批還須有毒種的限定代次的資料，以證明主種子和工作種子批在規定代次內的生物學

8、特性與原始毒種一致。（五）毒種的檢定1毒種的鑒別試驗：應提供檢定方法、檢定日期、檢定結果等資料，建議采用下述方法進行鑒別試驗：（1）可使用確診為SARSlf人的恢復期高效價血清中和病毒。（ 2）測定中和前后的病毒滴度。（ 3）應有病毒株的核酸全序列分析的資料，包括序列測定的方案、測定方法和測定結果，測定結果應附核酸序列圖、推導的氨基酸序列圖、種系發生樹圖等以進一步證明為SARSB狀病毒。2毒種的無菌試驗應根據中國生物制品規程疫苗生產用毒種的要求進行無菌試驗檢查。3毒種的外源因子檢查應用證明為SARSW毒感染的單人份病人血清中和本病毒。完全中和病毒后（如不能一 次中和，可用另一病人血清再一次中和

9、后）按下列方法進行動物和細胞檢查。（ 1）動物試驗法 小鼠取 15-20g 小鼠至少 10 只，用經中和后的病毒懸液，每只腦內接種 0 03ml ，腹腔接 種0. 5ml。至少觀察21天。解剖所有在試驗24小時后死亡或有患病體征的小鼠，為了檢查病毒感染的證據，直接肉眼觀察其病理改變，并將有病變的相應的組織懸液通過腦內和 腹腔接種另外至少5 只小鼠并觀察21 天。如果沒有小鼠表現出病毒感染現象，則病毒種子符合要求。在觀察期內至少有80%最初接種的小鼠存活試驗才有效。乳鼠出生后 24 小時以內的乳鼠，至少10 只，用經中和后的病毒懸液，腦內接種0. 01ml,腹腔接種至少 0. 1ml。每天觀察，

10、至少 14天。解剖所有在試驗24小時后死亡或有患病體征的小鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并取有病變的相應的組織和腦、脾制備成懸液腦內和腹腔接種另外至少5 只小鼠并每天觀察，觀察14 天。如果沒有小鼠表現出有病毒感染現象，該病毒種子通過試驗。在觀察期內至少有80%最初接種的小鼠存活試驗才有效。（ 2）細胞培養法 非血吸附病毒檢查中和后的病毒懸液，還應分別接種于人源、猴源和生產用的同種不同批的細胞。如果是利用人二倍體細胞生產的，還應接種另外一株人二倍體細胞。每種細胞最少接種 6 瓶，每瓶病毒懸液接種量不少于培養液總量的25%。于36± 1培養，觀察二周，或最后一次收獲病毒液時間本查是否有C

11、PE出現。未見CPE為陰性。 血吸附病毒檢查于第 6-8 天和第 14 天，每種細胞分別各取出 2 瓶進行血吸附，一瓶放置2-8 ，一瓶放置 20-25 ， 30 分鐘后顯微鏡下觀察，未見血球吸附現象為陰性。特別注意：鑒于我國實驗室條件和所用細胞的不確定因素，用于分離病毒的細胞常常污染支原體，而細胞和病毒一旦污染支原體很難清除，為此，提醒對使用的毒種須高度重視，徹底查清毒種是否確已污染支原體，以免所選毒種不符合生產疫苗用毒種，浪費人力、物力、時間和資源。4毒種的病毒滴度鑒于目前的研究資料顯示，SARSW毒在Vero細胞中的復制滴度一般可達108,在二倍體細胞中為 106 左右，用于疫苗研究的毒

12、種應分別達到上述要求。5毒種免疫原性檢查鑒于目前尚無測定疫苗免疫原性的有效方法和標準，建議以實驗性滅活疫苗（即用已建立的毒種庫制備的滅活病毒液）單次或多次免疫動物后采血清測定中和抗體滴度，測定方法應為蝕斑形成減少法或細胞病變抑制法，可能時應對所測抗體的種類進行分析。用于中和抗體測定的病毒株應為非同源株，免疫用動物可考慮家兔、小鼠、豚鼠或其他敏感動物。如有條件時也可測定疫苗的 ED506疫苗候選株病毒的純化問題新分離的病毒往往是群體病毒毒種，難免存在不同特性的病毒，如毒種病毒滴度和免疫原性未達要求，必要時可考慮用終末稀釋法或蝕斑形成法挑斑反復多次純化。滅活疫苗的研制，如毒種病毒滴度和免疫原性能達

13、到基本要求，可用現有毒種直接制備實驗性疫苗，無須純化。7毒種的其他檢定按中國生物制品規程疫苗生產用毒種的要求進行二、疫苗生產用細胞鑒于目前SARSW毒對各種細胞的敏感性研究，以VeroE6細胞最好，Vero細胞和二倍體細胞次之。但Vero E6 細胞不能用于生產，可選擇Vero 細胞、和 / 或二倍體細胞進行研究。Vero 細胞、二倍體細胞均為傳代細胞，因此須建立三級細胞庫。這兩種細胞建立細胞庫和各細胞庫的各項檢定應按中國生物制品規程“生物制品生產用動物細胞制備及檢 定規程”項下的相應要求進行。Vero 細胞是由非洲綠猴腎建立的傳代細胞系，至170 代以后已有明顯的致瘤性，一般使用的疫苗生產終

14、末安全代次為 160 代以前，建議使用 Vero 細胞研制疫苗的機構應注意該 細胞的資料。 三、生產工藝研究 （一）疫苗原液生產工藝的研究1生產工藝的主要技術參數（ 1）病毒與細胞的接種比例， MOI 的最佳參數。（ 2）細胞培養和病毒培養的最佳溫度、培養時間和收獲時間。（ 3）病毒液的收獲鑒于Vero作培養基質時，后續純化工藝去除細胞DNA寸的困難，因此建議不作細胞凍化以提高病毒收獲的做法。（ 4）滅活或裂解條件及滅活效果的驗證鑒于SARSW毒的強感染和強傳播特性，滅活劑的選擇和滅活效果的驗證尤為重要，建 議如下： 滅活劑根據其他疫苗的滅活經驗，一般情況下可采用甲醛、3-丙內酯或其他有效的滅

15、活劑，如選擇甲醛，其濃度、滅活的作用時間、作用溫度、pH等條件對疫苗的抗原的活性具有較大的影響，在研究中應引起注意；如用3-丙內酯應使用95%A上濃度的新試劑，3-丙內酯保存時間過長引起自身聚合，影響滅活效果。3-丙內酯由于能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，因此可考慮在純化前低劑量預滅活一次，提高生產工序時的安全性，在純化后再滅活 一次以確保完全滅活。 滅活效果的驗證提供病毒滅活驗證的詳細資料?？刹捎妹舾屑毎?Vero E6 盲傳 3 代，每代用直接免疫 熒光驗證無活病毒。（ 5）病毒液的濃縮和/ 或活性抗原的提取純化，可考慮用膜過濾法濃縮和柱層析法或區帶離心法純化或其他有效

16、方法。建議參照其他純化疫苗的要求，對疫苗的總蛋白含量進 行控制。（ 6）佐劑目前能用于疫苗的佐劑僅為鋁佐劑，而鋁佐劑通常使疫苗產生的抗體滯后，且增加注射局部的副反應機率。如疫苗的抗原量能滿足免疫的需要，建議不加佐劑。2滅活疫苗的安全性（免疫感染增強作用）鑒于呼吸道病毒感染的疫苗預防（麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等）易產生滅活疫苗導致免疫感染增強的病理反應，因此，本滅活疫苗須排除免疫感染增強作用的潛在危險，為本滅活疫苗的研究、實驗和今后的安全使用提供依據。但是目前沒有明確的實驗動物模型可以驗證有無免疫感染增強作用，為此建議： 可用猴體接種滅活疫苗后再攻擊SARSW毒，一定時間后測定猴體是否產生病毒血

17、癥、臟器是否減少或無病毒抗原、以及作組織病理學和免疫病理學等檢查，可以得到初步的證據。另外也可考慮用家兔、小鼠等別的動物進行免疫感染增強作用的初步驗證。四、生產的安全性問題鑒于SARSW毒的強傳播和強感染性的生物學特性，生產工藝應嚴格按活病毒和滅活后兩部分分開進行，活病毒操作區必須在P3 以上生物安全條件下進行，嚴格執行國家的有關規定。五、其他1按我國 藥品注冊管理辦法 中預防用生物制品的技術要求完成相關的研究。2.本技術要點將根據對SARSW究的進展情況適時進行修訂。附件 2：細胞模型篩選抗SARSW毒藥物試驗技術要求新近發現的非典型肺炎的病原SARSW毒，目前尚沒有理想的動物模型可用于對抗

18、SARSW毒藥物的篩選。為此用細胞模型篩選研究抗SARSW毒的藥物，對評價藥物抗病毒活性或效果具有重要提示價值。為規范細胞模型抗SARSW毒藥物的篩選研究，制定本技術要求。本技術要求適用于化藥、中藥、生物制品等擬用于SARS臺療或預防藥物（不包括預防用疫苗），并將根據 SARSW毒學研究的進展適時修訂。一、試驗材料要求（一）病毒1.毒株：應采用 SAR時行期臨床分離且經相關部門確證的SARSW毒毒株（建議選用2-3 株）。2毒種庫：試驗前將病毒先在敏感細胞上傳數代，增加毒力，待毒力穩定后，收獲病毒分裝一定數量的小管，在-80 低溫冰箱或液氮冷凍保存備用。3檢定：毒種庫毒種須經外源因子檢測合格后

19、方可用于篩選試驗，每次試驗取一支，不得回凍再用于篩選。（二）細胞1.細胞株：選用對 SARSW毒敏感的傳代細胞株，如 VeroE& 2BS細胞等。2細胞庫：收集大量培養的細胞分管液氮凍存以保留足夠的傳代細胞。試驗前先復蘇細胞傳數代，使培養細胞生長旺盛穩定后，開始接種細胞培 養板進行試驗。3檢定：細胞庫細胞須經外源因子檢測合格后方可用于篩選試驗，每次試驗取一支， 不得回凍再用于篩選。（三）待測藥物試驗前編號登記、標明藥名、來源、批號、重量或體積、溶媒、溶解度、穩定性和保 存條件等。（四）其他本試驗研究必須在生物安全 3 級試驗室進行，毒種的管理使用必須符合國家的有關規 定。二、篩選試驗（

20、一）預備試驗1病毒毒力測定選擇敏感細胞用于病毒培養，加入 10 倍系列稀釋的 5-7 個濃度的病毒培養液。適宜條件下培養后每天用倒置顯微鏡觀察細胞病變（CPE或用MT珠色法觀察細胞存活狀態，用Reed-Muench法計算病毒半數感染劑量（TCID50）,每濃度設4個復孔，重復實驗確定毒 力。2藥物對細胞毒性的測定以細胞病變或 MT咪色法為觀察指標，前法可觀察3-5天，每個藥物至少設 4個濃度進行測定，用 Reed-Muench法求出對細胞無毒的最大濃度（TD0）和半數中毒濃度（TD50）。每濃度藥液至少3管，重復試驗3次。（二）篩選試驗經預試驗求出病毒的TCID50和藥物的TD0后，在SARS

21、lf毒的敏感細胞模型上進行抗病毒活性篩選，適宜的培養液及培養條件培養。96孔板，細胞長成單層后，每孔加 100 dl （100 TCID50左右）病毒感染，吸附 2小時后，傾出病毒。然后加入待測藥物，只做 一個最大無毒濃度（ TD0），4 個孔。試驗設病毒對照、細胞對照及陽性藥物對照。以病毒對照孔出現病變達75%以上（即 4+ 時），可終止試驗。倒置顯微鏡觀察對細胞的致病變作用（CPE）,將給藥孔與病毒對照孔進行比較，如最大無毒濃度藥物無抑制病毒CPE作用則不繼續做，如有抑制作用須進行補充試驗。（三）補充試驗最大無毒濃度（TD0）的藥物如有抗病毒作用，應進行補充篩選試驗。模型和培養條件 同上。

22、試驗設藥物試驗組、病毒對照組及細胞對照組。每孔加入100TCID50左右病毒感染，吸附2小時，傾出病毒。選用最大無毒濃度（TD0）鄭夜,2倍或者10倍系列稀釋的5-7個濃度，每濃度4孔，每孔100,分別加入未感染或感染的細胞培養孔內，每天用倒置顯微鏡觀察，記錄細胞病變程度。當病毒對照病孔病變達4+時可終止試驗，判定藥物的效果。試驗須重復3 次。用CPE法，對各組進行比較。用 Reed-Muench 法計算半數有效濃度（ IC50 ）及治療指數（ TI ）。TI = 半數中毒濃度（TD50） / 半數有效濃度（ IC50 ）以上初篩及進一步藥效評價方法一般是針對治療性給藥（病毒感染細胞后給藥）的

23、藥物；若為預防性藥物，則建議相應調整給藥與感染的順序（病毒感染前給藥，病毒感染時及感染后均應洗去藥物），以考察其預防效果。四、結果評價鑒于目前SAR聯病的理想動物模型尚未建立，且體內外藥效學結果的相關性尚不明確，體外藥效學的試驗結果僅是評價藥物療效重要參考指標。在這種情況下, 盡量提供更多的反映藥物體內外相關性的研究資料將有助于進一步的評價; 如在可能的情況下, 進行藥代動力學研究, 考察體內藥物濃度能否達到 IC50 及維持時間等。另外，還應結合受試藥物的安全性，對其有效性進行綜合評價。附件 3：SAR膝斷試劑生產研制技術要求由于對引發嚴重急性呼吸道綜合癥（簡稱SARS的病原-新型冠狀病毒的

24、研究尚有待進一步深入，診斷試劑的研究仍存在很多不確定因素。為規范SAR淤斷試劑的研究，特制訂本技術要求。一、基本要求（一）從事SARS外生物診斷試劑研發的機構應當具有與試驗研究項目相適應的人 員、場地及設施等條件。（二）SARSW毒的分離、管理、使用及其保藏、運輸、處理等必須按照國家有關規定 執行。（三）臨床研究必須符合GCP勺原則及相關的技術要求。二、原材料（一）抗體檢測試劑1抗原：由于對新型冠狀病毒的基礎研究尚有待深入，為此所用抗原應盡可能選擇檢測譜廣的抗原，如純化的全病毒抗原。2抗原來源明確，質量指標必須達到診斷試劑研制用的要求。3病毒株須經鑒定并確證。4其他輔助材料必須符合相關的技術要求。5包被用全病