1、第2節植物體細胞胚發生體細胞胚（體細胞胚（somatic embryosomatic embryo）又叫胚狀體，是指離體培）又叫胚狀體，是指離體培養條件下沒有經過受精過程而形成的胚胎類似物。養條件下沒有經過受精過程而形成的胚胎類似物。胚的發育圖胚的發育圖 (A) 伸長期合子；(B) 合子經過第一次分裂, 產生1 個頂細胞(綠色)和一個基細胞(粉紅色)；(C) 四分體胚: 頂細胞經歷2 次縱向分裂，產生含有4 個細胞的胚體和2 個細胞的胚柄；(D) 16 細胞球形胚: 8 細胞胚的所有細胞經過1 次平周分裂, 產生包含8 個細胞的表皮原和8 個細胞的內部組織；(E) 早期心形胚；(F) 心形胚:

2、 子葉和胚根原基已經出現；(G) 成熟胚胎。 1: 頂細胞; 2 : 基細胞; 3: 胚根原細胞, 形成未來的ROC 和根冠中央區; RM: 根尖生長點; SM: 莖尖生長點 雙子葉植物的胚胎發育過程雙子葉植物的胚胎發育過程花粉培養單細胞懸浮培養原生質體培養組織器官培養體細胞胚花粉胚非合子胚非合子細胞合子胚無融合生殖胚*大量研究表明，大多數植物組織培養，單細胞懸浮培養、原生質體培養和花粉培養中都觀察到體細胞胚胎發生或花粉胚胎發生（pollen embryogenesis） *前者為二倍體的體細胞產生的胚狀結構 *后者是由小孢子或其分裂產物等單倍體細胞產生的體細胞胚，通常稱花粉胚（pollen

3、embryos），可發育成單倍體植株。*體細胞胚或花粉胚都是指在植物組織培養中起源于一個非合子細胞，經過胚胎發生和胚胎發育過程形成的胚狀結構，包括以下幾點含義： 1 1、體細胞胚是組織培養的產物，區別于無融合生殖的胚，只限于在組織培養范圍使用； 2 2、體細胞胚起源于非合子細胞，區別于合子胚； 3 3、體體細胞胚細胞胚的形成經歷胚胎發育過程，區別于組織培養的器官發生中芽與根的分化。胚胎發生過程：原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉形胚期植物體細胞胚胎發生和誘導器官發生相比具有明顯的特點： 1、具有兩極性 2、存在生理隔離 3、遺傳性相對穩定 4、重演受精卵形態發生的特性 二優點數量多速

4、度快結構完整三、體細胞胚胎發生的方式 *植物組織培養過程中植物體細胞胚胎途徑可歸納為兩類：直接途徑和間接途徑。 *直接途徑是直接從原外植體不經愈傷組織階段發育而成 *間接方式是體胚從愈傷組織或懸浮細胞、有時也從已形成的體胚的一組細胞中發育而成，如香雪蘭（Freesia refracta）花序外植體經直接體細胞胚胎發生途徑形成再生植株。 *外植體形態學極性決定體細胞胚胎發生，所有體細胞胚都出現在花序軸切段的原形態學下端。1 直接途徑 直接發生體胚的來源細胞可以是外植體表皮、亞表皮、幼胚、懸浮培養的細胞和原生質體。 一般認為直接方式發生體胚是由原先就存在于外植體中的胚性細胞預胚胎決定細胞（PEDC

5、s）培養后直接進入胚胎發生而形成體胚，如柑桔屬的珠心組織（在體內或離體情況）通過預胚胎決定細胞直接進行體胚發生的最好例子. 2 間接途徑 間接體細胞胚胎發生中，外植體已分化的細胞先脫分化，并對其發育命運重決定而誘導出胚性細胞誘導胚胎決定細胞（IEDCs），進而形成體細胞胚。 石龍芮下胚軸培養產生胚狀體過程石龍芮下胚軸培養產生胚狀體過程1 莖尖培養誘導形成胚性愈傷組織 MS培養基附加2.0mg/L 2,4-D2 胚性愈傷組織懸浮培養增殖 MS培養基附加2.0mg/L 2,4-D3 由細胞集合體形成體細胞胚 MS培養基附加2.0mg/L 2,4-D 4 體細胞胚萌發并形成小植株 MS培養基附加1.

6、0mg/L ABA 圖 甘薯品種栗子香胚性愈傷組織誘導體細胞胚和再生小植株 胚性愈傷組織胚性愈傷組織非胚性愈傷組織非胚性愈傷組織顏色顏色淡黃淡黃白色白色表面表面光滑光滑粗糙粗糙質地質地堅硬但易碎堅硬但易碎松散，水漬狀松散，水漬狀胚性細胞的多少胚性細胞的多少大量大量極少或無極少或無細胞形態細胞形態小，圓球形小，圓球形管狀或不規則形管狀或不規則形細胞質細胞質濃厚，染色深濃厚，染色深稀薄，染色淺稀薄，染色淺內含物內含物多多少少細胞核及核仁細胞核及核仁核明顯，大，核仁核明顯，大，核仁多多核小，核仁少，或核小，核仁少，或無核無核胚性細胞團特征：成簇、成團，體積小，細胞質致密四四. .體細胞胚的結構與發育

7、特點體細胞胚的結構與發育特點體細胞胚多起源于體細胞胚多起源于一個胚性細胞一個胚性細胞, ,胚性細胞胚性細胞經過首次分裂形成二細胞原胚經過首次分裂形成二細胞原胚, ,以后經過細以后經過細胞分裂形成多細胞原胚胞分裂形成多細胞原胚. .在多數情況下在多數情況下, ,胚胚性細胞的第一次分裂為平周分裂性細胞的第一次分裂為平周分裂, ,形成的形成的2 2個子細胞個子細胞, ,處于上部的頂細胞繼續進行細胞處于上部的頂細胞繼續進行細胞分裂形成分裂形成多細胞原胚多細胞原胚, ,而下部的基細胞成為而下部的基細胞成為胚柄類似物胚柄類似物. .四、體細胞胚的起源 *體細胞胚胎發生途徑有直接途徑和間接途徑，但無論哪一種

8、發生途徑，絕大多數研究報道認為體細胞胚胎起源于單細胞,從多種植物中都觀察到單個胚性細胞，有不均等分裂的二細胞原胚和均等分裂的二細胞原胚、多細胞原胚、球形胚直到成熟胚。也有研究認為起源于多細胞。 *在同一塊愈傷組織或一個胚性細胞復合體上可以觀察到多個不同發育時期的體細胞胚，從單個原始細胞到多細胞的原胚、球形胚、魚雷胚直至具子葉的胚狀體，這是由體細胞胚發生和分裂的不同步所致。 香蕉心形體細胞胚 可可心形胚A和球形胚B A AB B1 1 體細胞胚的單細胞起源體細胞胚的單細胞起源野胡蘿卜的胚狀體 A. 心形期胚狀體 B. 成熟胚狀體 C. 早心形期胚狀體 D. 兩個成熟胚狀體共一個胚柄 a) 胚性細

9、胞第一次分裂； b-d) 原胚第一次細胞分裂，鱷梨樹形胚柄細胞仍保持單個細胞； e) 胚柄細胞開始增殖；f-k) 原胚和胚柄發育的不同時期； l)球形體細胞胚。 (ep)=原胚； (s)=胚柄圖 仙人掌科體細胞胚胎早期發育（由單細胞形成球形胚時期）a 胚性葉片愈傷組織；b 球形細胞；c 伸長細胞；d 兩個細胞時期； e 四個細胞時期； f 原胚； g 球形胚；h 心形胚；i 早期魚雷胚； j 成熟魚雷胚； k 不同時期的體細胞胚；l 體細胞胚的萌發； m 再生小植株。圖 木豆幼苗葉片愈傷組織懸浮培養體細胞胚發育過程 *有的學者觀察到體細胞胚來源于多細胞組成的胚性細胞復合體，王亞馥等人也觀察到這

10、種胚性細胞團，但用同位素脈沖標記實驗即可證明這些細胞團也是由一個單細胞連續分裂而形成，經進一步分化和分裂形成不同發育時期的體細胞胚，因而這些體細胞胚實質也可能是起源于單細胞。當然也不排除有些植物的體細胞胚的確是起源于多細胞，仍有待深入研究。 *總之，體細胞胚胎的發生是一個非常復雜的生理過程，仍有許多問題尚需進一步研究。2 2 體細胞胚的多細胞起源體細胞胚的多細胞起源 大多數大多數體細胞胚體細胞胚起源于起源于單細胞單細胞, ,通過體細胞胚胎通過體細胞胚胎形成的形成的再生植株再生植株, ,其其遺傳特性相對穩定遺傳特性相對穩定. .而而器官器官發生途徑發生途徑的再生植株的再生植株來源復雜來源復雜,

11、,形成的個體常為形成的個體常為嵌合植株嵌合植株; ;從體細胞胚形成的過程可知從體細胞胚形成的過程可知, ,體細胞胚的發育過體細胞胚的發育過程與程與合子胚合子胚基本相同基本相同. .但在但在形態結構形態結構和和生理特性生理特性與合子胚有一定的區別與合子胚有一定的區別. .1.1.合子胚合子胚在發育初期具有明顯的胚柄在發育初期具有明顯的胚柄, , 而而體體細胞胚細胞胚一般沒有真正的胚柄一般沒有真正的胚柄, ,只有類似胚柄只有類似胚柄的結構的結構. .特別是那些發育初期類似于動物胚特別是那些發育初期類似于動物胚胎發育途徑的體細胞胚胎發育途徑的體細胞胚, ,這一點更為明顯這一點更為明顯. .2 2.

12、.合子胚合子胚的子葉相當規范的子葉相當規范, ,可以作為分類的可以作為分類的依據依據, ,如單子葉植物只有一片子葉如單子葉植物只有一片子葉, ,雙子葉植雙子葉植物有兩片子葉物有兩片子葉. .而而體細胞胚的子葉不規范體細胞胚的子葉不規范, ,有有時具有兩片以上的子葉時具有兩片以上的子葉. . 3. 3. 體細胞胚的體細胞胚的體積明顯小于體積明顯小于合子合子胚胚. .在一些貯藏物質的含量上也存在一些貯藏物質的含量上也存在較大差異在較大差異. .如體細胞的如體細胞的干物質干物質如如蛋白質蛋白質, ,多糖等顯著多糖等顯著低于合子胚低于合子胚. . 4. 4. 體細胞不能有明顯的脫水干燥體細胞不能有明顯

13、的脫水干燥過程過程, ,因此體細胞胚的因此體細胞胚的含水量含水量比合比合子胚要高得多子胚要高得多5. 5. 體細胞胚還有一個明顯的特點體細胞胚還有一個明顯的特點就是就是沒有休眠沒有休眠. . 合子胚在胚胎發育合子胚在胚胎發育完全進入子葉期后完全進入子葉期后, ,經過一系列物經過一系列物質積累和脫水進入休眠質積累和脫水進入休眠, ,而體細胞而體細胞胚則胚則直接形成植株直接形成植株. .五、影響體細胞胚發生的因素 w 1、基因型與體細胞胚發生 w 基因型是影響體細胞胚發生的重要因素，體細胞胚的誘導率和每個胚性外植體上體細胞胚的發生率因基因型而異。 （a）不同基因型體細胞胚誘導率； （b）不同基因型

14、每個胚性外植體上體細胞胚的數目 圖6.7 在相同培養基上Feijoa sellowiana Berg不同基因型體細胞胚誘導 （引自Miguel等，2001）w2、植物激素與體細胞胚發生 w*離體植物細胞在開始往往缺乏合成生長素和細胞分裂素的能力，但是在大多數情況下，這些細胞的分裂和分化以及形態建成過程中又必需生長素和細胞分裂素兩種激素的共同作用。 w*在培養介質中添加不同種類或不同濃度的外源激素誘導形態發生已受到廣泛的重視。 w*但最關鍵的是組織內部和體細胞胚發生部位的內源激素代謝動態和平衡。w（1）內源激素與體細胞胚發生 w早在胡蘿卜細胞懸浮培養體細胞胚發生中發現，2，4-D在誘導胚性細胞早

15、期是必需的，而且2，4-D是通過影響IAA結合蛋白起作用，其實質是促進IAA結合蛋白的形成，提高細胞對IAA的敏感性從而誘導胚性細胞的形成。w水稻細胞培養中也發現，由于2,4-D促進細胞內源IAA含量提高進而誘導胚性細胞的形成，并認為內源IAA含量上升或維持在較高水平，是胚性細胞出現的一個共同標志。 w一些研究表明，ABA對植物體細胞胚的發生與發育具有重要作用。 w外源ABA與內源ABA對體細胞胚發生起到相互調節和促進的作用，而且通過補充提高外源ABA，可以明顯提高體細胞胚發生的頻率與質量。w荔枝體細胞胚胎發生早期的內源激素ABA與IAA和ABA與CTK（細胞分裂素）的質量比增大，將有利于荔枝

16、體細胞球形胚的形成。w（2）外源激素與體細胞胚發生 w 2，4-D與體細胞胚發生 w2，4-D是誘導多種植物離體培養體細胞轉變為胚性細胞的重要激素。 w單子葉植物和雙子葉植物誘導體細胞胚胎發生時，所要求的2,4-D的濃度不同，對單子葉植物而言，一般要求較高濃度的2,4-D，其濃度范圍為0.5-5mg/L，通常使用濃度為2mg/L； w而對雙子葉植物而言，一般要求較低濃度的2,4-D，其濃度范圍為0.02-1mg/L，通常使用的濃度為0.1mg/L。 w在體細胞胚胎發生的誘導階段，培養基中必需添加2,4-D，而在體細胞胚胎形成階段，要降低培養基中2,4-D的濃度或去除2,4-D，以保證體細胞胚的

17、正常生長。 w在胡蘿卜細胞培養中，加入2，4-D后誘導一些特異性多肽或蛋白質形成，當去除生長素后，這些多肽和蛋白質也隨之消失。但在誘導出胚性細胞后，及時除去培養基中的2，4-D，胚性細胞在進一步分化和發育的同時釋放糖蛋白GP65（65kDa）表 在MS固體培養基上不同濃度2,4-D對木豆幼苗葉片外植體誘導和原胚細胞形成的影響2,4-D(M) Callus induction(%) Proembryonic cell*(%) 0.00 0.0 0.0 2.26 3.2d 3.4d 4.52 7.4c 10.2c 6.78 38.6a 37.4a 9.04 18.2b 12.8b 11.30 3.

18、6c 2.2c 表 在具有不同濃度2,4-D的MS液體培養基上木豆不同時期體細胞胚誘導率2,4-D(M) 收集細胞的體積 (10th day) 體細胞胚發育時期 球形胚(%) 心形胚(%) 魚雷胚(%) 0.00 0 0 0 0 1.12 2.8e 2.4e 1.8e 1.2e 2.26 3.2d 7.6d 2.4d 1.6d 3.38 4.6c 20.2b 8.2b 5.2b 4.52 5.2b 36.2a 20.4a 16.4a 5.64 5.6b 18.6c 6.6c 3.6c 6.78 6.2a 7.4d 1.6e 1.2e Origin of embryoids in embryo-

19、derived callus culture. (a) Single cells (arrow) and two-celled stage (double arrows). x137. (b)Four-celled stage (arrowhead). x137. (c) Multicelled proembryo containing eight to ten cells. x137 (d) Epidermized lobular stage. x34. (e) Heart shape embryoid that remain in the callus. X34. (f) Several

20、compact embryoids in different stages of formation. x14.A,C,E為離體培養6周后的體細胞胚；B,D,F為離體培養5個月后形成的體細胞胚 A:品種GK7 ，在添加83.0 mM centrophenoxine培養基上; B: 品種AT120，在添加124.4 mM centrophenoxine培養基上; C: 品種59-4144，在添加12.4 mM dicamba培養基上; D:品種AT120，在添加83.0 mM dicamba培養基上; E: 品種VC1，在添加83.0 mM picloram培養基上; and F:品種VC1，在

21、添加124.4 mM picloram培養基上. 圖 含不同種類和不同濃度生長素固體培養基上成熟花生胚軸體細胞胚誘導 w 其它生長激素與體細胞胚發生 w除2,4-D外，ABA對植物體細胞胚的發生也起到重要的調控作用。 w研究表明，ABA具有促進藶蒿體細胞胚結構正?；娘@著效應。 w在濃度適宜時，ABA能抑制多種異常體細胞胚的發生，而且ABA加入培養基的時間愈早其效應也越明顯。 w較低濃度的ABA對保持秈稻愈傷組織的胚性結構具有重要意義，可明顯提高這種胚性愈傷組織分化出苗率。 w在拐芹中ABA與NAA共同作用可誘導一些游離氨基酸含量的變化和特異蛋白的形成。 wABA和PEG對胡蘿卜(Daucus

22、 carota L.)體細胞胚發生具有調控作用 w大量的研究表明，ABA對某些植物體細胞胚胎發生特異性基因的表達起調控作用，激活相關基因的表達，合成貯藏蛋白、晚期胚胎發生豐富蛋白和胚胎發生的特異性蛋白。3 多胺（腐胺、尸胺、亞精胺、高亞精胺、精胺等）和乙烯與體細胞胚發生 *外源多胺對體胚發生的作用除了取決于植物種類及其內源多胺的狀況之外，還關系到它們如何被吸收、運輸及降解等問題。多胺與體細胞胚發生的關系在胡蘿卜的研究中較多。舉例說明： *已發現胡蘿卜的胚性細胞中腐胺、精胺含量比非胚性的高，在胡蘿卜體細胞胚發生的前胚時期多胺含量一般較低，從球形胚、心形胚到魚雷胚時期，精胺和亞精胺逐漸升高，心形胚

23、時期以腐胺為主，魚雷胚時期則富含亞精胺。 *在胡蘿卜愈傷組織的體細胞胚發生中發現乙烯抑制體細胞胚的發生，而乙烯形成酶抑制劑Ni2+、Co2+可以促進其體細胞胚發生。 *有研究表明，只在胚細胞分化早期才與多胺生物合成關系較密切。4 糖類和金屬離子與體細胞胚發生 糖類 *糖類對誘導植物體細胞胚發生也是不可缺少的重要成分。 *研究表明，小麥的愈傷組織一旦分化為胚性細胞后就有淀粉粒的積累，在胚性細胞分化與發育的整個過程中，淀粉的兩次合成高峰均在發育的重要轉折期，為體細胞胚的進一步發育和分化提供必要物質和能量基礎。淀粉的積累與胚性細胞分化能力和體細胞胚發育時期的轉折密切有關。 *在茴香的胚性細胞中也富含

24、淀粉粒，在體細胞胚發育中同樣出現兩次峰值，同時認為淀粉出現的峰值與核酸和蛋白質合成密切相關，因此，表明淀粉為蛋白質和核酸的合成奠定了物質基礎。 碳水化合物 濃度（mM） 胚胎發育時期 球形胚（） 心形胚（） 魚雷胚（） 葡萄糖 Glucose 55.49 2.4f 1.2h 1.2g 110.99 6.8f 2.6h 2.4f 166.48 10.2e 5.0f 4.2e 221.98 13.6c 7.2d 6.4d 果糖 Fructose 55.49 6.2f 2.8g 2.4f 110.99 12.4c 5.2f 4.6c 166.48 6.4f 5.0f 4.2e 221.98 2.4h 1.2h 1.2g 蔗糖 Sucrose 29.21 12.4c 6.8c 6.2d 58.43 20.2b 16.2b 14.6b 87.64 36.2a 20.4a 16.4a 116.86 12.6d 10.2c 8.4c 麥芽糖 Maltose 27.75 2.4h 1.2h n.d 55.51 5.4g 2.6