1、色譜分離法 色譜法（chromatography）：是一種分離和鑒定復雜混合物的有效方法。近來已被廣泛應用于天然產物有效成分的分離提純。對一些性質相近，結構類似化合物分離，采用經典的溶劑法和結晶法已不能達到分離的目的，使用色譜法往往可以收到很好的分離效果。 根據色譜分離原理不同，可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、大孔吸附樹脂法、凝膠色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等。 、吸附色譜法（adsorption chromatography）：是利用同一吸附劑對混合物中各種成分吸附能力的差異，而使各成分達到分離的目的的色譜方法。本方法特別適用于脂溶性中等分子量成分的分離。 各種吸附劑表面都存在

2、著吸附活性，對不同的有機化合物，在吸附劑表面都表現出不同的吸附能力，這就是吸附色譜能分離不同物質的基本原理之一。吸附力的強弱是由吸附劑和被吸附物的性質決定的。用一定的溶劑系統展開時，由于溶劑與混合物里 各組分爭奪吸附劑活性表面，因此，發生了吸附與解吸附的過程。解吸下來的組分與溶劑始終存在著競爭吸附作用，故隨即又被吸附劑所吸附，吸附與解吸附過程一旦開始，就必定貫穿于整個色譜過程，直至色譜結束為止。 不同的化合物由于結構性質上的差異，展開劑對它們的洗脫能力和在吸附劑上的吸附、解吸附性能也是不同的。因而在吸附劑上移動的距離就不會相同，形成各種組分彼此程度不同的被分離，性質差異越大，分離效果越好。 吸

3、附色譜法的分離效果如何，完全是由吸附劑和被分離物質的性質決定的。 通常所用的吸附劑有： 硅膠（silica）：為一多孔性物質，微顯酸性，其吸附能力稍弱于氧化鋁，可用通式SiO2XH2O來表示。 氧化鋁（aluminium oxide）：是常用的吸附劑之一，是由氫氧化鋁直接在高溫下（約600）脫水制得，由于制造關系常帶有微堿性，對于分離植物中的堿性成分如生物堿頗為理想，但不宜用于醛、酮、酯和內酯等類型化合物的分離，因為有時堿性氧化鋁可以與這些成分發生次級反應，如異構化、氧化和清除反應等。 聚酰胺（polyamide）：是一類由酰胺聚合而成的高分子化合物。商品名為綿綸、尼龍。對黃酮類、酚類、醌類、

4、有機酸及鞣質的分離效果極佳，可使性質極相近的類似物質得到分離。此外，在生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸衍生物及核苷類的分離上也取得了成功。 活性碳(activated carbon)：屬于非極性吸附劑，有著較強的吸附能力，特別適合于水溶性物質的分離。 吸附色譜法的操作方式通常有薄層色譜和柱色譜法。 薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)：是一種快速、簡便、靈敏的分離檢識方法。薄層色譜將吸附劑均勻地鋪在玻璃板上，把欲分析的樣品點加到薄層上，然后用合適的溶劑展開而達到分離、鑒定和定量的目的。該方法不僅對分離鑒定天然產物成分起到了獨特的作用，在分析化學、藥物化學、染

5、料、農藥等領域，均得到廣泛的應用。 薄層色譜的操作主要包括制板，點樣，展開和顯色四個方面。 柱色譜法（column chromatography）：也是天然產物成分研究中常用的色譜方法，實質上它是薄層色譜的另一種形式。其分離原理、吸附劑及洗脫劑的選擇均與薄層色譜法相同。不同點在于柱色譜法是將分離材料均勻的加入到一定規格的玻璃柱里，再以適當的洗脫劑洗脫，使結構性質不同的成分達到分離。柱色譜法分離樣品量大，故大多數情況下均為制備性分離。 、分配色譜法 ：是利用物質在互不相溶的兩相溶劑中分配系數不同，而達到分離的一種色譜方法。 基本原理：其基本原理來自兩相逆流萃取法。只不過是將互相飽和的一相溶液，設

6、法吸著在某種惰性固體粉末或濾紙上，這一相就稱為固定相，這種吸著了固定相的物質稱為支持劑（載體或擔體）。被分離物質置于固定相上，以另一相即移動相洗脫（或展開），樣品中的物質就在固定相與移動相之間分配而達到分離。因此，分配色譜法由載體，固定液相，移動液相，被分離物質四部分組成。 支持劑：作為分配色譜的支持劑均為中性多孔的粉末，無吸附作用，不溶于兩相溶劑中，不與被分離物質發生化學反應。并能吸附著一定量的固定相，移動相能自由通過而不改變其組成。常用的支持劑有硅膠、硅藻土、纖維素粉、濾紙等。 溶劑系統：分配色譜中的固定相和移動相統稱為溶劑系統。 操作方式：分配色譜法的操作方式有紙色譜，分配薄層色譜和分配

7、柱色譜等。 A、紙色譜(paper chromatography ，PC)是以濾紙作為支持劑，用一定量的溶劑系統展開而使樣品達到分離的一種平面色譜法。 B、分配薄層色譜：分配薄層色譜的原理與紙色譜相同，裝置及操作與吸附薄層色譜相同，只是鋪板用的不是吸附劑而是支持劑。 C、分配柱色譜：裝置同吸附柱色譜。將吸著固定相的支持劑裝于柱中，樣品溶于少量固定相加入柱上端，以移動相進行脫洗，分別收集。 、離子交換色譜法（ion exchange chromatography ，IEC）：是用離子交換劑代替吸附劑的一種色譜方法。該方法在工業上用途很廣，在天然產物有效成分的分離方面，特別對水溶性成分氨基酸、肽類

8、、生物堿、有機酸及酚類化合物的分離，比以前方便多了。 A、基本原理：離子交換樹脂是一些具有特殊性能的高分子化合物，它們不溶于水、酸、堿和有機溶劑，但是可在水中解離成離子，其解離的離子可與溶液中的其它離子產生可逆交換，而毫無影響本身的結構。由于它與多種離子的親合力不同，可借此使不同的離子獲得分離。根據所交換離子性質不同，將其分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。離子交換色譜的原理用下式表示： 陽離子交換樹脂：RSO3-H+ +Na+Cl- RSO3- Na+ + H+ Cl- 陰離子交換樹脂：RN+OH- + Na+Cl- RN+ Cl- + Na+ OH- 其中R為樹脂母體。 天然產物中有些成分

9、可以離子化，有些成分不能離子化。能離子化的成分在水溶液中可與離子交換樹脂反應而被吸附，不能離子化的成分在水溶液中不與離子交換樹脂反應，不被吸附，彼此達到分離。 B、操作方法：離子交換色譜法操作方法與柱色譜法基本相似。裝柱前樹脂要預先用蒸餾水充分溶脹，同時樹脂的粒度范圍要求窄些為好，否則柱內上下樹脂粒度不一，會影響分離效果。 用過的樹脂可以再生處理反復使用，一般采用酸堿再生處理法，將鹽型轉為游離型。 、大孔吸附樹脂法(macro-reticular resine)：廣泛用于天然產物的分離。并在抗生素及水溶性天然產物成分提純等方面顯示出獨特的作用。 A、性能及分離原理：常用的大孔吸附樹脂是一種不含

10、交換基團，具有大孔結構的高分子吸附劑。一般為白色顆粒狀，粒度多為2060目。理化性質穩定，不溶于酸、堿及有機溶劑，不受無機鹽類存在的影響。通常可分為非極性和中等極性兩類，在水溶液中吸附力較強且有良好的吸附選擇性。大孔吸附性樹脂為吸附性和篩選性原理相結合的分離材料，所以它既不同于離子交換 樹脂，又有別于凝膠分子篩。它所具有的吸附性是由于范德華引力或產生氫鍵吸附的結果，而篩選性分離則是它的多孔性網狀結構所決定的。欲分離的天然產物成分依其分子體積的大小及吸附力的強弱，在一定規格的大孔吸附樹脂上，以適當的溶劑洗脫而分開。 B、影響分離因素：有分子極性大小，分子體積，PH值等。 C、樹脂柱的清洗：化合物

11、經樹脂柱吸附后，在樹脂表面或內部殘留許多非吸附性成分或吸附性雜質，這些雜質必須在清洗過程中盡量洗除。非吸附性成分用水即可洗除，而吸附性雜質可根據實際情況，選用低濃度的醇溶液，如30%以下乙醇等洗除或進行小試來摸索適宜的洗滌溶劑。 D、洗脫液的選擇：洗脫液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，根據吸附力的強弱選用不同的洗脫劑。對非極性大孔吸附樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強。對中極性大孔吸附樹脂和極性較大的化合物，用極性較大的有機溶劑較合適。為達到滿意的效果，可設幾種不同濃度洗脫，以確定最佳洗脫液濃度。洗速控制在0.55ml/(cm2min)較為合適。洗脫時，根據實際情況，也可采用不同極性梯度的

12、洗脫液分別洗下不同組分。 、凝膠色譜法（gel filtration chromatography，GFC）：是60年代發展起來的一種分離分析技術。其設備簡單、操作方便，結果準確。本技術已發展成為天然產物化學和生物化學研究中的常規分離方法。 常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex G)，聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel P)及瓊酯糖凝膠(Sepharese，Bio-Gel A)等，其中應用最廣泛的當屬葡聚糖凝膠。 A、性能及分類：葡聚糖凝膠是由葡聚糖（右旋糖酐）和甘油，通過醚橋鍵相交而成的多孔性網狀結構物質。商品凝膠為干燥顆粒狀物質，在使用前必須使其充分溶脹。由于葡聚糖分子中含有大量羥基，而具

13、有一定極性，在水中膨脹為凝膠粒子。它不溶于水及鹽溶液，在堿性和弱酸性溶液中穩定，在強酸中，遇高溫時可使部分糖甙鍵水解。葡聚糖凝膠網眼的大小是影響分離效果的主要因素。在制備時可通過添加不同比例的交鏈劑，獲得交鏈度不同的凝膠。交鏈度越大，網狀結構越緊密，網孔越小，吸水膨脹越大，可用于小分子量物質的分離；反之，交鏈度小，網孔大，則可用于大分子量物質的分離。 商品凝膠的型號一般是按交鏈度的大小來分類的，并以每克干凝膠吸水量10倍的數值來表示。如G-25型凝膠表示為每克吸水2.5ml的葡聚糖凝膠。 葡聚糖凝膠LH-20(Sephadex LH-20)是在葡聚糖凝膠G-25的分子中，引入羥丙基以代替分子中

14、羥基上的氫而形成的新型凝膠。由于在其分子內引入了親脂性的基團，從而使它不僅具有親水性，而且也有一定程度的親脂性，這樣就大大擴展了凝膠色譜的應用范圍，既可用于強極性水溶性化合物的分離，也可用于一些難溶于水或有一定程度親脂性化合物的分離。 B、分離原理：葡聚糖凝膠吸水后形成凝膠粒子，在其交鏈鍵的骨架中存在許多網眼。網眼大的能使大分子量的化合物進入，網眼小的則只能使小分子量的化合物進入。這樣，超過一定限度的大分子物質，就被排阻在凝膠粒子的外部，難以進入網眼內部。這就使得能進入凝膠內部與不能進入凝膠內部的化合物分子，如同按照分子大小過篩一樣分開，故稱為“分子篩”。其基理如下圖所示： O：代表凝膠顆粒

15、o：代表大分子物質 ：代表小分子物質 1. 待分離物質在色譜床表面； 2 .樣品進入色譜床，小分子進入凝膠 顆粒內部，大分子隨溶液流動； 3. 大分子物質行程短，流出色譜床， 小分子物質仍然緩慢移動。 因此，在多種成分進行凝膠色譜分離時，從柱中流出的次序是按分子量遞減的順序排列的。但是，某些凝膠也不全是惰性的，在溶質與葡聚糖凝膠之間也會形成特殊的吸附作用。在用葡聚糖凝膠LH-20( Sepha-dex LH-20)分離游離態的黃酮類的化合物時，主要是靠吸附作用，酚羥基多的化合物吸附力大，難洗脫，酚羥基少的吸附力小，先出柱；而用同樣規格的凝膠來分離黃酮甙時，分子篩則起主導作用，黃酮甙類基本上是按

16、分子量由大到小的順序流出柱體。 C、應用：凝膠色譜法目前已被廣泛應用于天然產物有效成分的分離純化工作中，它是水溶性大分子化合物質分離上常用的方法之一，實踐證明它對小分子量物質的分離也是有效的。隨著新的凝膠材料的不斷問世，凝膠色譜法的應用范圍也在不斷擴大。 、高效液相色譜法（high performance liquid chroma-tography, HPLC）：是新發展起來的一種液相色譜方法。由于高效填充劑和各種靈敏檢測器的出現和發展，使該法在分離效率、分析速度、檢出靈敏度及自動化等方面均達到了新的境界，形成了獨特的體系。隨著計算機技術的迅猛發展，促進了新型高效液相色譜儀的問世，同時，使高

17、效液相色譜與質、核磁、紅外等波譜技術的聯用也有很大的進展，這對復雜混合物的分離和分析是一種十會有用的方法。 近年來，高效液相色譜在天然產物成分研究、有機化工、環境化學及高分子工業等方面已經得到了廣泛的應用。尤其在天然產物成分鑒定、含量測定及結構類似組分的分離上越來越顯示出它的重要性。 喜樹堿（Camptothecine）中抗癌活性成分的分離：喜樹為珙桐科喬木，從該植物中分離得到的一類含內酯環結構的生物堿，是抗腫瘤的活性成分。下圖為使用高效液相色譜儀從喜樹中分離得到的四種喜樹堿的類似物。采用的是薄殼多層小球ODS柱作為固定相，以55%甲醇-水為移動相所組成的反相系統。在這種情況下，極性大的試樣組

18、分（羥基喜樹堿）保留時間短， 先被洗脫出來，極性小的試樣 組分（脫氧喜樹堿）保留時 間長，最后被洗脫出柱。 、氣相色譜法（gas chromatography，GC）：是現代分離、分析天然產物的一種重要手段。隨其分離檢測技術的日益完善，已成為石油化工、藥物代謝、毒藥分析及環保監測必不可少的測試工具，在天然藥物研究上也有著廣泛的前景。揮發油是一類具有較強生理活性的天然產物，因具有沸點低、易揮發的特性，故氣相色譜法特別適宜對其分離分析。中成藥制劑大多是復方制劑，長期以來缺乏明確的標準來控制其內在質量，近年來用氣相色譜法定性，定量地測定中成藥中的主要成分，控制內在質量，方法簡單可靠。氣相色譜技術對鑒

19、別生藥的真偽優劣，對臨床血藥濃度的監測，對藥代動力學及藥效學等方面的研究，均起到了促進作用。 近幾年來，隨著氣相色譜技術作為分離手段，用質譜儀充當分析工具，大型GC-MS聯用儀還配有計算機微處理系統，使數據處理自動化，既迅速又準確。 天然藥物化學成分結構測定 天然產物化學成分經過提取、分離、精制成單體化合物后，必須進行鑒定，確定其化學結構，才有可能為人工合成，結構改造和藥物設計提供可靠的依據。 一、鑒定天然產物化學成分的一般步驟 鑒定天然產物化學成分的基本步驟有：物理常數的測定；分子式的測定；化合物功能基和分子骨架的推定；化合物結構式的確定。 A、物理常數：確定物理常數之前首先要確定化合物的純

20、度，如是固體測定熔點、熔距、比旋度、比重，如是液體還需要測定沸點、冰點等。 B、分子式的測定：對單體進行元素分析，然后再確定各種元素在化合物中所占的百分含量，從而求出化合物的實驗式，并依據測出的分子量，計算出該化合物的分子式，該法測定分子量的方法比較經典，但是精確度不高，因為，單體純度不高時，誤差越大，所以測出來的分子式只能是近似式，有時，還需做較大幅度的調整。對分子量的測定，過去常用冰點降低法，衍生物推導法，酸堿測定法，現在通常是用質譜法。 C、化合物功能基和分子骨架的推定：通常決定該化合物的缺氫因素，準確計算出結構中含有的雙鍵數或環數，并結合所測的物理常數，化學定性試驗、化學降解等反應，以

21、及所測的UV、IR、NMR和MS等波譜數據，綜合分析，以確定化合物含哪些功能基，具何種母體，屬于哪類化合物。 D、化合物結構式的確定：根據UV、IR、NMR和MS及X單晶衍射等許多新的物理分析手段，并借用化學方法進一步確定化合物的具體結構式。現在，由于現代化儀器的出現，使測定天然產物成分結構鑒定工作也進入了一個新的階段。以前用純粹的化學方法測定一種新的化合物的結構需要20年、30年甚至100年、200年等，而現在只需要5年、3年甚至1年或半年即可。 但是不管怎么樣，確定一種新的天然化學成分的分子結構式，是一個系統工程，是一項較復雜的工作，涉及面廣，很難有一個嚴格的研究程序。往往是化學工作、儀器

22、分析、植物化學分類學及文獻工作的相互配合，綜合分析而獲得的結果。 結構測定中常用的波譜簡介 化學物質結構測定中常用的波譜有：紫外吸收光譜（UV）、紅外吸收光譜（IR）、質譜（MS）和核磁共振譜（NMR）等。這些波譜技術是測定天然產物成分結構的重要手段。它具有微量、快速、準確等特點，波譜技術已經成為廣大藥學工作者必須掌握的一門技術。 A、紫外吸收光譜（ultraviolet absorption spectrum，UV）,是用不同波長的紫外光為光源（常用波長范圍為200400nm），依次照射一定濃度的樣品溶液，分別測量其吸收度，并用波長對吸收度或摩爾吸收系數作圖而得的吸收光譜圖。 天然產物成分吸

23、收了紫外光，引起分子價電子的躍遷，即由基態吸收一定能量后被激發到高能階的激發態。所吸收能量的大小（E）與化合鍵的類型有關，也就是與化合物質結構有關。 鍵、鍵和獨立電子n(p)的E可用下圖表示： 只有在分子結構中具有共軛雙鍵，發色團和共軛體系的助色團，即在分子中具有產生 *、n *躍遷和某些 n * 躍遷的化合物才能在紫外光區產生紫外吸收光譜。 如果化合物具有紫外吸收光譜，則可根據紫外吸收光譜曲線最大吸收峰位置及吸收峰的數目和摩爾吸收系數來確定化合物的基本母核，或是確定化合物的部分結構。 紫外光譜從一個側面反映了分子結構的內在聯系，它可以提供許多有關結構推測的線索。如誘導效應、共軛效應及同分異構

24、、順反異構、空間位阻等現象，紫外光譜均可給出衡量的依據，這對天然產物成分結構的研究有重要的價值。 帶有發色基團的天然產物成分，其紫外吸收峰的位置及相對強度，已經作為一般物理常數，用于結構鑒定工作。當有標準品時，可將檢品與標準品的紫外光譜進行對照，若兩個化合物相同，其紫外光譜就完全相同。但是，由于紫外光譜是分子價鍵電子躍遷所產生的，所以，UV中出現的吸收峰只能顯示分子中部分結構的特征而不能顯示整個分子的細微結構。因此，紫外光譜相同也不一定為相同的分子。如果無標準品作為對照，則可查找有關光譜文獻及卡片進行核對。 紫外光譜是研究不飽和有機化合物結構常用的方法之一。對于確定分子中是否含有某種發色團（即

25、不飽和部分的結構骨架）是很有幫助的。 天然產物成分構型不同，其紫外光譜的max 也不同。由于立體障礙的原因，通常反式（trans）異構體的共軛效應較完善，吸收峰的max及max值均 較相應的順式（cis）異構 體大，如下圖所示，所以 據此即可判斷化合物是順 式或反式構型。 由于紫外吸收光譜圖 形比較簡單，而且不同的 化合物也可能具有相同的 紫外吸收光譜圖形，因此， 不能只根據紫外吸收光譜 來判定是不是同一化合物， 但是同一化合物必定具有 相同的紫外吸收光譜。 B、紅外吸收光譜(infrared absorption spectrum，IR)通常是采用2.515m(4000667cm-1)范圍內

26、的不同波長的光波為光源，依次照射樣品，經自動描繪所得的吸收光譜曲線。其橫坐標是波數（cm-1）或波長（m），縱坐標是百分透光度。由于縱坐標是百分透光度而不是吸收度，故紅外吸收光譜曲線和紫外吸收光譜曲線的峰是相反的，即紅外吸收光譜中的吸收峰，實際是向下的“谷”。 紅外光譜是化合物分子結構的客觀反映。某個化合物的紅外光譜圖同它的熔點、沸點等物理常數一樣，是該化合物的特征，尤其是有機化合物的紅外吸收峰多達幾十個。如同人的指紋一樣彼此各不相同，因此用它來研究天然產物成分的結構，既簡便迅速又可靠，應用十分廣泛。在實際結構鑒定工作中，往往并不要求測全未知成分的結構，而僅僅要求弄清楚樣品是否為某已知成分，在

27、這種情況下，應當用已知的標準圖譜或用已知標準品在同一條件下測出的吸收圖譜進行核對，若完全相同，通常可以作出最后的決定。若有微小的差別，應當進一步將樣品進行精制，然后再進行核對。 應用紅外光譜測定分子中的基團，是利用各基團的特征吸收峰所出現的波長，強度和形狀來判斷的，具有不同的功能團和化學鍵的化合物的IR吸收特征是不同的，這對未知成分化學結構的推測與確定，提供了極有價值的資料。此外，IR還可提供化合物分子的幾何構型與立體構象的研究信息。對于結構簡單的未知成分測定，可依靠IR提供的圖譜，結合其它數據推測其結構；對結構比較復雜的未知成分，尚須配合UV、NMR、MS和經典的化學方法綜合判斷，方可初步確定其結構。 C、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)是有磁距原子核（如H、13C），在磁場作用下，以射頻進行照射，產生能級躍遷