1、分子標(biāo)記術(shù)之RAPD標(biāo)記目錄RAPD標(biāo)記的原理與特點RAPD標(biāo)記的技術(shù)操作RAPD標(biāo)記應(yīng)用舉例一、RAPD的原理與特點 PCR標(biāo)記（PCR markers）是隨著PCR技術(shù)誕生和發(fā)展而產(chǎn)生的第二代分子標(biāo)記技術(shù)。PCR技術(shù)是一種體外快速擴增特異基因或DNA序列的方法。該技術(shù)在試管中建立反應(yīng)體系，經(jīng)數(shù)小時后，就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍。 根據(jù)PCR引物的不同，可將PCR標(biāo)記分成兩種類型：PCR反應(yīng)中采用隨機單引物擴增，如RAPD通過克隆和測序而構(gòu)建特異雙引物，然后對基因組DNA進行擴增，包括SSR、STS等。（一）RAPD 的原理 RAPD（random amplif

2、ied polymorphism DNA, 隨機擴增多態(tài)性DNA）標(biāo)記技術(shù)是利用人工合成的約10bp的隨機序列寡核苷酸作引物，以生物的基因組DNA為模版，進行PCR擴增，該單引物可能和基因組DNA有許多個結(jié)合位點，當(dāng)兩個結(jié)合位點之間的DNA片段長度符合PCR反應(yīng)條件時即可被擴增。產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA 序列的多樣性。不同來源的DNA，具有不同的DNA引物結(jié)合位點從而RAPD反應(yīng)中獲得不同的擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物再經(jīng)凝膠電泳分離，圖一、圖一、RAPD的原理及示意圖的原理及示意圖溴化乙錠（EB）染色后即可觀察分析。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片

3、段插入、缺失和堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。（二）RAPD的特點 RAPD技術(shù)與PCR技術(shù)相比較，RAPD需要一個10bp寡核苷酸隨機引物，而常規(guī)PCR需要2個20bp左右的特定設(shè)計引物；RAPD退火溫度一般是36左右，一方面保證引物與模版DNA的穩(wěn)定配對，同時允許適當(dāng)錯誤配對，提高多態(tài)性檢出率，常規(guī)PCR為特異擴增，而RAPD產(chǎn)物為隨機擴增。與其他分子標(biāo)記相比，RAPD標(biāo)記具有許多優(yōu)越之處：試驗步驟少，省力省工、進度快，沒有物種特異性，不需要預(yù)先知道基因組的任何分子信息，同一套引物

4、可用于任何植物的研究，具有廣泛性和通用性；不需要DNA探針，設(shè)計引物也無需知道序列信息，可用于任何 生物基因組的分析；技術(shù)簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；DNA樣品需要量少，這對于生物早期取樣的情況大有益處；引物價格便宜，成本較低；RAPD易發(fā)生多態(tài)性，廣泛用于物種分類鑒定、遺傳連鎖圖譜的建立、基因定位、雜種優(yōu)勢分析和標(biāo)記輔助選擇等。RAPD標(biāo)記也具有許多不足：RAPD一般為顯性標(biāo)記，無法區(qū)分從一個位點擴增的DNA片段是純和的還是雜合的，無法進行等位基因分析；RAPD分析中存在的最大問題是重復(fù)性不太高；存在共遷移問題，在膠上看到的一條帶有可能包含了非同源的擴增產(chǎn)物，因為所用的凝膠電泳

5、類型（一般是瓊脂糖凝膠電泳）只能分開大小不同的片段，而不能分開有不同堿基序列的片段，引物的篩選費時費力，染色劑溴化乙錠是一種強誘變劑，對人體有毒；目前該法在引物長度和序列及應(yīng)用的引物數(shù)目、擴增反應(yīng)條件等實驗技術(shù)方面未標(biāo)準(zhǔn)化，影響了不同條件下結(jié)果的可比性；每個標(biāo)記含有的信息量少；有假陽性和假陰性結(jié)果；用在種以上類群間的比較時無法得到可靠的遺傳距離等。二、RAPD技術(shù)的操作1.技術(shù)路線RAPD的技術(shù)路線圖如圖RAPD標(biāo)記技術(shù)的操作過程選擇隨機引物選擇隨機引物DNA的提取PCR反應(yīng)凝膠電泳圖譜分析2.儀器設(shè)備和消耗品電泳槽DNA擴增儀電泳儀離心管移液器吸頭紫外線觀察裝置移液器照相設(shè)備3.試劑隨機引物

6、（10bp）(5umol/L)5TBE緩沖液500mmol/L KCl25mmol/LMgCl2Taq酶（附帶10PCR緩沖液）100mmol/LTris.Hcl ph8.31.4瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠0.5ug/uL）dNTPs(2.5mmol/L)DNA分子量標(biāo)記（DNA/EcoR I Hind雙酶切）4.操作步驟超凈臺上，依次在冰上向無菌的0.5mLEppendorf離心管中加入在加熱至90的PCR儀中預(yù)變性94 2min，然后循環(huán)：94 1min，36 1min，72 1min，共40輪循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，72 10min，4保存。取PCR產(chǎn)物15uL加3uL上樣緩沖液（6） 于2瓊脂糖

7、膠上電泳，穩(wěn)壓50100V（電壓地帶型整齊，分辨率高）。模版DNA 1uL（50ng）,隨機引物1uL(約5pmol),10PCR Buffer 2.5uL，MgCl2 2uL，dNTPs2uL，Taq酶一單元（U），加ddH2O至25uL，混勻稍離心加一滴礦物油。電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察擴增的DNA條帶，拍照記錄。5.注意事項PCR的反應(yīng)液應(yīng)在冰上調(diào)制，然后置于PCR儀上進行擴增反應(yīng)。（可增強PCR擴增的特異性）12在提取中DNA應(yīng)純化，并特別注意防止氧化，同一DNA樣品可用不同的隨機引物進行擴增。3由于RAPD比較靈敏，所以要注意防止污染，排除假陽性，所用水用超純水，儀器要嚴(yán)格消毒。4為提

8、高檢測靈敏度，一味增加循環(huán)數(shù)或PCR產(chǎn)物是不可取的，因為這回增加非特異性。5若產(chǎn)物特異性較低，可以在反應(yīng)混合液中加入5的二甲基亞楓（DMSO）或2.5的甲醛或50umol/L的氯化四甲氨（TMAG）以提高擴增產(chǎn)物的特異性6電泳時一般RAPD帶有515條，大小0.12.0kb。若擴增產(chǎn) 物在瓊脂糖凝膠上的分辨率較低，可通過一下措施提高分辨率向瓊脂凝膠糖中添加交聯(lián)劑使用5聚丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)凝膠用變性梯度凝膠采用銀染發(fā)7特異性的DNA帶可以克隆，作為一個新的分子標(biāo)記應(yīng)用。三、DNA分子標(biāo)記應(yīng)用舉例1.RAPD的應(yīng)用標(biāo)記輔助選擇等等遺傳連鎖圖譜的建立基因定位物種分類鑒定 雜種優(yōu)勢分析RAPD標(biāo)記2.RAPD標(biāo)記的應(yīng)用舉例RAPD標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用利用RAPD 技術(shù)鑒定中藥材的實際應(yīng)用利用RAPD進行西瓜雜交利用RAPD技術(shù)進行樹木遺傳變異利用RAPD技術(shù)檢測肺巨細(xì)胞癌轉(zhuǎn)3.RAPD標(biāo)記具體實例以桃品種“京玉（有毛）”與“美味（無毛）”兩個品種雜交的69株F1代正反交群體，以及京玉的自交F2代群體中的42株為試材。以親本京玉和美味基因組總DNA為模版，在520個10bp的隨機引物中篩選出158個在兩個親本間具多態(tài)性的引物用果皮有毛和果皮無毛的雜交后代各2、4、8株反復(fù)篩選多態(tài)性引物最終發(fā)現(xiàn)隨機引物