1、大鼠Nogo基因片段的克隆及與GST融合蛋白的表達和純化 作者：張萍 程希平 費玲玲 王春婷 楊浩 陳鑌復 鞠躬 【關鍵詞】 Nogo基因Cloning of adult rat Nogo gene segments and expression and purification of their coding protein fused with GST【Abstract】 AIM: To obtain rat Nogo gene segments, express efficiently in E. coli and purify the target proteins. METHODS:

2、 Nogo gene segments were amplified by RTPCR from normal adult SD rat spinal cord total RNA. After sequenced, the reconstructed expression vectors were constructed by enzyme digestion and subcloned into expression vector pGEX4T1. Then the vectors were transformed into E. coli DH5. Recombinant GST fus

3、ion proteins were expressed via the induction of IPTG and purified through glutathione agarose column. RESULTS: The sequences of cloned adult rat Nogo gene segments (570-691 and 1028-1089 amine acid residues) were identical with those earlier reported. Two protein bands of Mr39 000 and 32 000 appear

4、ed on SDSPAGE gel after the expressed GST fusion proteins were separated by SDSPAGE. Then the expressed fusion proteins were purified to high purity. CONCLUSION: The adult rat Nogo gene segments have been successfully cloned and efficiently expressed in E. coli, and the GST fused target proteins hav

5、e been purified to high purity.2 / 16【Keywords】 Nogo gene；cloning；expression；purification【摘要】 目的: 獲取大鼠Nogo基因片段并高效表達純化. 方法: 用RTPCR技術，從成年SD大鼠脊髓的總RNA中，獲得編碼Nogo基因功能片段的DNA. 測序后，通過酶切亞克隆至表達載體pGEX4T1，構建重組表達載體，并導入E. coli DH5中，IPTG誘導表達重組的GST融合蛋白. 對重組融合蛋白過谷胱甘肽瓊脂糖柱進行純化. 結果: 獲得成年SD大鼠Nogo(570691和10281089氨基酸殘基)的基因

6、，測序結果與已發表的基因序列相一致. 重組GST融合蛋白經SDSPAGE分析，在相對分子質量（Mr） 39 000和32 000處，有特異的蛋白條帶. 重組蛋白經谷胱甘肽瓊脂糖柱進行純化后，得到了高純度的融合蛋白. 結論: 成功克隆成年大鼠Nogo基因片段，并在E. coli DH5中高效表達，親和層析后獲得高純度GST融合蛋白.【關鍵詞】 Nogo基因；克隆；表達；純化0引言哺乳類動物中樞神經損傷后再生困難, 是由于各種營養因子嚴重匱乏；又存在抑制軸突再生的分子1. 牛神經突起生長抑制因子bNI220 2，以及大鼠和人的bNI220同族體Nogo分子的純化和鑒定3，4，是中樞神經再生抑制因子

7、研究的重大突破. Nogo被認為是重要的神經突起生長抑制因子5. 為進一步研究Nogo的功能及尋找針對Nogo可能的功能抑制劑，我們嘗試克隆表達Nogo片段.1材料和方法1.1材料寡聚核苷酸引物由北京賽百盛公司合成；RNA提取試劑Trizol購自美國Gibco公司；pGEX4T1質粒購自瑞典Pharmacia公司；pGEMT easy載體、RTPCR試劑盒及Tvector試劑盒、各種限制性內切酶、連接酶及Taq DNA聚合酶均為美國Promega公司產品；DNA酶和高純質粒提取試劑盒為德國Boehringer Mannheim公司產品；IPTG, DTT, DTE, 胱胺、谷胱甘肽瓊脂糖及還原

8、性谷胱甘肽，均為Sigma公司產品；其余一般化學試劑均為國產分析純. 成年SD大鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供.1.2方法1.2.1Nogo片段的擴增取成年SD大鼠的脊髓，按照Trizol操作指南提取總RNA，并以此為模板進行RTPCR，擴增Nogo氮端623640氨基酸殘基及胞外段的10241089氨基酸殘基的cDNA片段，分別命名為NogoN和Nogo66. NogoN的引物序列如下：5端引物：5GGAATTCACAGCACAGCTTTGC CCAT3，3端引物：5GCGTCGACTTAATCTGGACTTGGCTCAGTGGA3；Nogo66的引物序列如下：5端引物：5GGAATTCT

9、ATAAGGGCGTGATCCAG G3，3端引物：5AACTGAGGCGGCTTTTCTTATAAGTCGACGC3. 48 45 min反轉錄，94 變性，55 復性1 min 5個循環，60 復性1 min 30個循環.1.2.2RTPCR產物的克隆與鑒定回收RTPCR產物， 與質粒pGEMT Easy進行連接反應，轉化感受態DH5. 挑取白色菌落進行酶切鑒定，所獲陽性克隆命名為pGEMNogoN和pGEMNogo66，送至上海申友公司進行測序. 經EcoR，Sal雙酶切后與經同樣酶切的pGEX4T1進行連接反應，挑選的陽性克隆子命名為pGEXNogoN和pGEXNogo66.1.2.3

10、目的蛋白的誘導表達和純化工程菌在含氨芐青霉素（100 mg・L-1）的LB培養基中過夜培養，按10%的接種量進行轉接，250 r・min-1, 37搖菌至A600=1，加入異丙基D硫代半乳糖苷至終濃度為0.5 mmol・L-1，37繼續通氣培養45 h. 取1.5 mL菌液，7734 g離心30 s收集菌體，菌體加入H2O 60 L，劇烈振蕩混勻，再加入4×樣品緩沖液20 L，100，5 min；7734 g離心5 min；100 g・L-1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，預計相對分子質量（Mr）

11、 32和39×103處有明顯的蛋白表達. 大規模培養細菌，誘導表達目的蛋白，收集菌體，超聲破菌. 離心后將上清和沉淀分別制樣，進行SDSPAGE. 可溶的目的蛋白直接應用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱進行親和層析純化. 以包涵體形式存在的表達產物. 用N十二烷基肌氨酸鈉將沉淀蛋白質變性過夜，經緩慢透析去除N十二烷基肌氨酸鈉，令蛋白復性后，用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱對目的蛋白進行親和層析純化.2結果2.1Nogo片段的擴增及序列測定RTPCR擴增Nogo66和NogoN的部分cDNA，分別得到182 bp和384 bp的片段（Fig 1）. 挑取含插入片段的陽性克隆pGEMNogoN和pGE

12、MNogo66，用高純質粒提取試劑圖1NogoN和Nogo66 RTPCR擴增結果(略)盒提取質粒，測序結果表明所擴增的NogoN和Nogo66與GeneBank公布的序列相符.2.2表達載體的構建pGEMNogoN和pGEMNogo66經EcoR，Sal雙酶切后與經同樣酶切的pGEX4T1進行連接反應后，轉化感受態細胞5，挑選的克隆子進行酶切鑒定，切出約182 bp或384 bp大小片段的為陽性克隆子（Fig 2），命名為pGEXNogoN和pGEXNogo66.圖2pGEXNogoN和pGEXNogo66重組質粒酶切鑒定圖譜(略)2.3重組蛋白在大腸桿菌中的表達與純化將pGEXNogoN和

13、pGEXNogo66轉化入E.coli DH5，IPTG誘導，SDSPAGE電泳表明工程菌表達了相應分子質量的GST融合蛋白(Fig 3). 對菌體總蛋白上清和沉淀蛋白分別進行電泳分析，發現GSTNogoN融合蛋白90位于菌體蛋白的可溶性上清中，上清直接經谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化，得到Mr約39×圖3GSTNogoN融合蛋白的表達及純化(略)103的目的蛋白. 而GSTNogo66融合蛋白主要位于不溶的包涵體中，對包涵體蛋白用N十二烷基肌氨酸鈉變性處理過夜，經緩慢透析除去N十二烷基肌氨酸鈉，蛋白復性后，過谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化，得到Mr約39×103的目的蛋白(Fig

14、 4).圖4GSTNogo66融合蛋白的表達及純化(略)3討論近年來對中樞神經系統(CNS)纖維再生的認識已發生了根本性改變6，7. 目前的共識是，成年CNS神經元再生能力弱、中樞環境對再生不利1. 在中樞環境眾多不利因素中，近年來發現主要為與髓鞘相關的蛋白，其中尤以Nogo最為重要8. Nogo對神經突起的生長具有很強的抑制作用. 而mAb IN1的在體應用大大促進了中樞神經損傷后功能的恢復9. Nogo功能位點可能位于其氮端623640的氨基酸殘基3及胞外段的10241089氨基酸殘基4. 這樣，制備含Nogo功能區段的重組蛋白對于進一步研究Nogo的功能及制備其功能抑制性抗體將十分重要.

15、 為此，我們克隆表達了Nogo的570691和10281089的氨基酸殘基兩個區段，為研究Nogo的中樞神經再生抑制功能和制備其功能封閉性抗體提供有利的保障.我們成功地表達了GSTNogoN和GSTNogo66. GSTNogoN位于細菌誘導表達產物的上清中，直接應用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化. 而GSTNogo66位于包涵體中，工程菌經超聲破菌，離心后用N十二烷基肌氨酸鈉對包涵體蛋白變性. N十二烷基肌氨酸鈉是一種溫和的陰離子去垢劑，可溶解許多包涵體蛋白. 當用透析或層析將它從蛋白質中去除時，即可使蛋白質復性. N十二烷基肌氨酸鈉處理變性的GSTNogo66包涵體蛋白,經緩慢透析降低N十二烷

16、基肌氨酸鈉濃度后，蛋白得到很好的復性，過谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化后，得到Mr 32×103的目的蛋白. 實驗證明N十二烷基肌氨酸鈉可以將包涵體蛋白變性，而緩慢透析降低N十二烷基肌氨酸鈉濃度可使包涵體復性，是一種有效地純化包涵體蛋白的方法.【參考文獻】1 Dumont AS, Dumont RJ, Oskouian R J. Will improved understanding of the pathophysiological mechanisms involved in acute spinal cord injury improve the potential for the

17、rapeutic intervention J? Curr Opin Neurol, 2002; 15(6):713-720.2 Spillmamm AA, Bandtlow CE, Lottspeich F, Keller F, Schwab ME. Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI220)J. J Biol Chem, 1998; 273(30): 19283-19293.3 Chen MS, Huber AB, Haar ME, Frank M, Schnell L,

18、 Spillmann AA, Christ F，Schwab ME. NogoA is a myelinassociated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN1J. Nature, 2000; 403(6768): 434-439.4 Grandpre T, Nalamura F, Vartanian T, Strittmatter SM. Identification of the Nogo inhibitor of axon regeneration as a Reticulon proteinJ. Nature, 2000; 403(6768): 439-444.5 Grandpre T, Strittmatter S. Nogo: A molecular determinant of axonal growth and regeneration J. Neuroscientist,