1、會計學1蛋白質和多肽的氨基酸序列測定蛋白質和多肽的氨基酸序列測定 蛋白質和多肽是由蛋白質和多肽是由20種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接成一長種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接成一長鏈，然后通過鏈內、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進行折疊、鏈，然后通過鏈內、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進行折疊、卷曲形成一定的構象并發揮其獨特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質的卷曲形成一定的構象并發揮其獨特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質的一級結構決定了蛋白質的高級結構及功能。因此，測定蛋白質的氨基酸一級結構決定了蛋白質的高級結構及功能。因此，測定蛋白質的氨基酸序列是進行蛋白質結構功能研究中不可缺少的部分。

2、另外，蛋白質一級序列是進行蛋白質結構功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白質一級結構的信息也有助于對其基因結構的研究。結構的信息也有助于對其基因結構的研究。 目前，進行蛋白質序列測定有兩個關鍵步驟，即：目前，進行蛋白質序列測定有兩個關鍵步驟，即：氨基酸殘基一個一個依次從蛋白質和多肽的末端切割下來；氨基酸殘基一個一個依次從蛋白質和多肽的末端切割下來；正確鑒定每次切割下來的氨基酸殘基。正確鑒定每次切割下來的氨基酸殘基。 其中第一步可采用化學法或酶法進行裂解。由于化學法較之酶法具有其中第一步可采用化學法或酶法進行裂解。由于化學法較之酶法具有裂解率高、易于自動化、耗費少等諸多優點，被蛋白質化學實驗室普遍

3、裂解率高、易于自動化、耗費少等諸多優點，被蛋白質化學實驗室普遍采用，可以從蛋白質和多肽的采用，可以從蛋白質和多肽的N端進行裂解，也可以從端進行裂解，也可以從C端進行分析。端進行分析。 第二步通常是在氨基酸殘基上衍生了一個生色基團，通過高效液相色第二步通常是在氨基酸殘基上衍生了一個生色基團，通過高效液相色譜進行分離分析。譜進行分離分析。 本章將就蛋白質和多肽的本章將就蛋白質和多肽的N端、端、C端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析的原理和方法、進行序列分析前蛋白質和多肽樣品的準備作一介紹。的原理和方法、進行序列分析前蛋白質和多肽樣品的準備作一介紹。第一節第一節 N端分析原理端分析原理一、耦一、耦 聯聯

4、 蛋白質和多肽的自由蛋白質和多肽的自由氨基經與異硫氰酸苯酯氨基經與異硫氰酸苯酯(PITC)試試劑耦聯后，與其緊鄰的第二個殘基的鍵合力大大減弱，很容劑耦聯后，與其緊鄰的第二個殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。易斷裂。二、裂二、裂 解解 在無水條件下酸裂解，僅僅切下反應的那個殘基。緊挨的在無水條件下酸裂解，僅僅切下反應的那個殘基。緊挨的第二個氨基酸殘基暴露出自由的第二個氨基酸殘基暴露出自由的氨基，又可與氨基，又可與PITC進行進行耦聯反應。耦聯反應。三、轉三、轉 化化 ATZ氨基酸不穩定，在三氟乙酸水溶液氨基酸不穩定，在三氟乙酸水溶液(25)中可轉化中可轉化成穩定的成穩定的PTH氨基酸。氨基酸。第

5、二節第二節 N端蛋白質序列儀端蛋白質序列儀三、氣相序列儀三、氣相序列儀 自動化蛋白質序列儀剛問世時，需要樣品量為自動化蛋白質序列儀剛問世時，需要樣品量為12mg。1978年年Tarr等將一種四級銨鹽聚合物等將一種四級銨鹽聚合物“polybrene”引入了蛋白質、多肽的序列測引入了蛋白質、多肽的序列測定，它能和肽鏈中的極性基團作用定，它能和肽鏈中的極性基團作用(非共價鍵合非共價鍵合)而將蛋白質和多肽有效而將蛋白質和多肽有效地固定在玻璃纖維支持膜上，防止了萃取時樣品的損失。為了適應分子地固定在玻璃纖維支持膜上，防止了萃取時樣品的損失。為了適應分子生物學對蛋白質微量分析的要求，生物學對蛋白質微量分析

6、的要求，20世紀世紀80年代初，年代初，Hewick及及Hunkpillar等人改進了自動化蛋白質序列儀中的儀器結構，它用彈筒型等人改進了自動化蛋白質序列儀中的儀器結構，它用彈筒型玻璃反應室玻璃反應室(內部體積約內部體積約0.05m1)代替了液相序列儀中的旋轉玻璃杯，用代替了液相序列儀中的旋轉玻璃杯，用polybrene固定樣品，固定樣品，Edamn降解反應中有的試劑如三甲胺以氣體方式降解反應中有的試劑如三甲胺以氣體方式輸送，其他試劑以流動或液相脈沖方式輸送。此儀器較之以前幾種序列輸送，其他試劑以流動或液相脈沖方式輸送。此儀器較之以前幾種序列儀具有以下明顯優點：儀具有以下明顯優點：靈敏度高，耗

7、費樣品量少，通常僅需靈敏度高，耗費樣品量少，通常僅需50100pmol；試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的l10，降低了費用；，降低了費用；縮短了每步降解循環時間，提高了分析效率。縮短了每步降解循環時間，提高了分析效率。 20世紀世紀80年代末又對氣相序列儀進行了部分改進，即將原來三氟乙酸年代末又對氣相序列儀進行了部分改進，即將原來三氟乙酸以氣體方式輸送改為液相脈沖方式，稱為脈沖液相序列儀，以適應不同以氣體方式輸送改為液相脈沖方式，稱為脈沖液相序列儀，以適應不同樣品的分析需要。另外，由于載有活性基團的功能性樣品的分析需要。另外，由于載有活性基團的功能性PV

8、DF膜的問世，膜的問世，蛋白質和多肽可以共價固定在此類膜上，直接在上述兩種序列儀上進行蛋白質和多肽可以共價固定在此類膜上，直接在上述兩種序列儀上進行固相序列分析。固相序列分析。 在這兩種序列儀中，在這兩種序列儀中，Edman降解后的降解后的PTH氨基酸衍生物可及時直接氨基酸衍生物可及時直接從轉化腔中自動輸入高效液相色譜儀中進行從轉化腔中自動輸入高效液相色譜儀中進行PTH氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及定量分析，這樣不僅快速可靠，而且防止了樣品的損失。這兩臺儀器統一定量分析，這樣不僅快速可靠，而且防止了樣品的損失。這兩臺儀器統一用電腦控制，包括化學反應和分析鑒定以及數據的自動記錄和處理。

9、圖用電腦控制，包括化學反應和分析鑒定以及數據的自動記錄和處理。圖4.2為標準為標準PTH氨基酸的色譜分離圖。由圖可見，欲在氨基酸的色譜分離圖。由圖可見，欲在20min內將各組分內將各組分較好分離，需選擇合適的色譜條件，表較好分離，需選擇合適的色譜條件，表4.1列出了各種條件的改變導致個列出了各種條件的改變導致個別組分位置的遷移及圖譜的改善。別組分位置的遷移及圖譜的改善。第三節第三節 影響影響N端端Edman反應裂解率的因素反應裂解率的因素 在測序中往往可以發現，即使在測序中往往可以發現，即使N端很均一的蛋白質端很均一的蛋白質(第一個循環出現單第一個循環出現單個氨基酸殘基個氨基酸殘基)，經過十幾

10、個循環后背景明顯不及第一個殘基清晰。這是，經過十幾個循環后背景明顯不及第一個殘基清晰。這是由于由于Edman反應是一個化學過程，在其耦聯、裂解、轉化等步驟都有可反應是一個化學過程，在其耦聯、裂解、轉化等步驟都有可能發生一些副反應，從而影響最終裂解效率。目前最佳產率為能發生一些副反應，從而影響最終裂解效率。目前最佳產率為9598。因此，經過。因此，經過50次循環后，次循環后，PTH氨基酸分析譜中將出現較多雜峰，氨基酸分析譜中將出現較多雜峰，影響正確辨認，也就是說對于一般蛋白質最多能分析至影響正確辨認，也就是說對于一般蛋白質最多能分析至N端第端第50個氨基個氨基酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質降解

11、成一系列肽段分析后再拼接。酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質降解成一系列肽段分析后再拼接。對于有些蛋白質由于含有較多的對對于有些蛋白質由于含有較多的對Edman反應敏感的殘基或肽鍵，裂反應敏感的殘基或肽鍵，裂解效率將更低。解效率將更低。循環至循環至Ser和和Thr時產率突然降低，這是因為在進行這兩個氨基酸殘基時產率突然降低，這是因為在進行這兩個氨基酸殘基分析前一個循環中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與分析前一個循環中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與Ser和和Thr上的羥上的羥基反應，繼而部分封閉基反應，繼而部分封閉Ser和和Thr的的N端端氨基。氨基。另外，絲氨酸和蘇氨酸的另外，絲氨酸和蘇氨酸的

12、PTI-汀生物也會部分轉化成其他產物，造汀生物也會部分轉化成其他產物，造成產率的降低。成產率的降低。 耦聯試劑耦聯試劑PITC本身也將發生下列副反應，形成一些本身也將發生下列副反應，形成一些“雜質雜質”。測序完。測序完成成后，電腦將每個循環的產率處理，得出起始產率后，電腦將每個循環的產率處理，得出起始產率(initial yield)和重復產和重復產率率 (repetitive yield)，其中通過起始產率可以估計蛋白質的真實含量，其中通過起始產率可以估計蛋白質的真實含量，有時可以推測有時可以推測N端是否封閉端是否封閉(和氨基酸組成分析測得的含量相差甚遠和氨基酸組成分析測得的含量相差甚遠)，

13、而而重復產率則表明機器是否正常運轉。另外，如果蛋白質或多肽中含有重復產率則表明機器是否正常運轉。另外，如果蛋白質或多肽中含有過多的過多的Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸殘基，也將降低這兩個數值。等氨基酸殘基，也將降低這兩個數值。第六節第六節 C端序列分析端序列分析 雖然建立在雖然建立在Edman化學法上的自動化化學法上的自動化N端測序技術日趨成熟，但仍端測序技術日趨成熟，但仍有不少問題需借助有不少問題需借助C端序列分析來解決。端序列分析來解決。C端測序尤其適合于基因重組蛋端測序尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達的鑒定和大規模生產時的質量控制、白是否正確表達的鑒定和大規模生產時的質量控制、

14、N端封閉蛋白的分端封閉蛋白的分析以及析以及DNA探針的設計。探針的設計。 由于選擇性對由于選擇性對C端羧基進行耦聯修飾并從端羧基進行耦聯修飾并從C端逐一將氨基酸殘基切下端逐一將氨基酸殘基切下較較N端測序困難，在過去的近端測序困難，在過去的近20年里，雖然為數不少的蛋白質化學家致年里，雖然為數不少的蛋白質化學家致力于力于C端測序研究，但目前仍不能和端測序研究，但目前仍不能和N端測序技術程度媲美。蛋白質化學端測序技術程度媲美。蛋白質化學工作者曾利用羧肽酶分析工作者曾利用羧肽酶分析C端氨基酸殘基，但是由于不同的羧肽酶對個端氨基酸殘基，但是由于不同的羧肽酶對個別氨基酸殘基有選擇性，使用時仍有一定困難。

15、別氨基酸殘基有選擇性，使用時仍有一定困難。 最近，由于對化學法測定最近，由于對化學法測定C端技術進行了一系列改進，已有了自動化端技術進行了一系列改進，已有了自動化C端序列儀問世。所以介紹一種自動化端序列儀問世。所以介紹一種自動化C端測序方法的原理及應用。端測序方法的原理及應用。一、一、C端分析原理端分析原理 基于與基于與N端端Edman降解類似的原理，降解類似的原理，C端分析采用化學試端分析采用化學試劑與蛋白質和多肽的劑與蛋白質和多肽的羧基反應，反應后的羧基反應，反應后的C端衍生物被端衍生物被切割下來，通過切割下來，通過HPLC系統進行分離分析。系統進行分離分析。一個完整的一個完整的C端序列分

16、析包括以下幾個步驟：端序列分析包括以下幾個步驟： (1)活化活化 蛋白質和多肽蛋白質和多肽C端的自由羧基與乙酸酐反應生成混合酸酐，并進一步端的自由羧基與乙酸酐反應生成混合酸酐，并進一步環化成嗯唑酮，而側鏈上的羧基形成的混合酸酐難以成環。環化成嗯唑酮，而側鏈上的羧基形成的混合酸酐難以成環。C端的嗯唑端的嗯唑酮在硫氰四丁銨的作用下，轉化為乙內酰硫脲酮在硫氰四丁銨的作用下，轉化為乙內酰硫脲(thiohydantoin，TH)。(2)酰胺化保護側鏈羧基酰胺化保護側鏈羧基 側鏈羧基形成混合酸酐后，與硫氰哌啶進一步作用形成酰側鏈羧基形成混合酸酐后，與硫氰哌啶進一步作用形成酰胺，以保護側鏈。胺，以保護側鏈。

17、(3)烷基化烷基化 由于由于C端環化形成的端環化形成的TH衍生物較為穩定而不易被切割，因衍生物較為穩定而不易被切割，因此產率不高。用溴甲基萘選擇性地烷基化修飾硫原子，形成此產率不高。用溴甲基萘選擇性地烷基化修飾硫原子，形成Alkylated-TH(ATH)衍生物，裂解產率將大大提高。衍生物，裂解產率將大大提高。(4)修飾修飾Thr和和Ser的羥基的羥基 蛋白質和多肽中的羥基會干擾測序，因此需要修飾。在活蛋白質和多肽中的羥基會干擾測序，因此需要修飾。在活化過程中，乙酸酐也會與羥基反應將其乙酰化，但反應不完化過程中，乙酸酐也會與羥基反應將其乙酰化，但反應不完全，在全，在N甲基咪唑甲基咪唑(NMl)

18、和乙酸酐的共同作用下，和乙酸酐的共同作用下，Thr和和Ser上的羥基基本被乙酰化。上的羥基基本被乙酰化。(5)裂解和衍生裂解和衍生 C端的端的ATH衍生物在酸性條件下與衍生物在酸性條件下與NCS反應而被反應而被裂解生成裂解生成ATH氨基酸，新的氨基酸，新的C端自動形成端自動形成TH，而不必重，而不必重新新活化。活化。 因此，整個測序過程只需在開始時對因此，整個測序過程只需在開始時對C端進行一次性活端進行一次性活化，并修飾化，并修飾Asp和和Glu側鏈羧基以及側鏈羧基以及The和和Ser的羥基。實的羥基。實際上，循環反應的只有烷基化和裂解兩步，其全過程圖解如際上，循環反應的只有烷基化和裂解兩步，

19、其全過程圖解如下圖。下圖。二、二、C端蛋白質序列儀端蛋白質序列儀 近年來，已有商品化的近年來，已有商品化的C端序列儀問世。端序列儀問世。C端序列儀一般端序列儀一般由由N端序列儀改裝而成，其基本結構與后者相似，兩者的不端序列儀改裝而成，其基本結構與后者相似，兩者的不同之處主要在于：同之處主要在于： 反應所用的試劑不同，因此兩者不可兼容，否則極易堵反應所用的試劑不同，因此兩者不可兼容，否則極易堵塞管道；塞管道； 在在C端序列儀中，所有的化學反應均在彈筒型反應室中端序列儀中，所有的化學反應均在彈筒型反應室中進行，切割下來的進行，切割下來的ATHAA僅在轉化腔內干燥和溶解后即僅在轉化腔內干燥和溶解后即

20、進入進入HPLC系統分離分析；而在系統分離分析；而在N端測序儀中，端測序儀中，ATZ AA需需在轉化腔中轉化為在轉化腔中轉化為PTH-AA。四、影響四、影響C端測序反應產率的因素端測序反應產率的因素 C端測序副反應較多，最高初始產率僅為端測序副反應較多，最高初始產率僅為20，而對于，而對于Glu，Asp，Ser，Thr等氨基酸，其產率將更低。如等氨基酸，其產率將更低。如C端富含上述幾種氨基酸，測序端富含上述幾種氨基酸，測序將十分困難。另外，一旦遇到將十分困難。另外，一旦遇到Pro，由于吡咯環的存在而不能與乙酸酐，由于吡咯環的存在而不能與乙酸酐反應成環，整個測序過程將終止。反應成環，整個測序過程

21、將終止。 到目前為止，到目前為止，C端測序可測端測序可測110個殘基，一次測序需要的量比個殘基，一次測序需要的量比N端測端測序要大得多，至少需序要大得多，至少需1nmol。 此外，因為不同的氨基酸反應產率不同，所以，對圖譜的分析也比此外，因為不同的氨基酸反應產率不同，所以，對圖譜的分析也比N端測序復雜，需要較多的經驗。目前端測序復雜，需要較多的經驗。目前C端測序結果最好的一個樣品是馬端測序結果最好的一個樣品是馬肌紅蛋白原，可測肌紅蛋白原，可測C端端10個以上殘基，通常將其作為標準樣品來判斷儀個以上殘基，通常將其作為標準樣品來判斷儀器的穩定性。器的穩定性。 另外，由于副反應的存在，有的氨基酸將生

22、成不止一種另外，由于副反應的存在，有的氨基酸將生成不止一種ATH衍生物。衍生物。如如Arg的的ATH衍生物可能被乙酰化或烷化；衍生物可能被乙酰化或烷化；Tyr-ATH可被乙酰化；可被乙酰化；Cys被修飾后將形成丙烯酰胺化的被修飾后將形成丙烯酰胺化的Cys-ATH以及脫氫以及脫氫Ala-ATH；脫水；脫水Thr-ATH將產生兩個非對映異構體。將產生兩個非對映異構體。 五、結語和展望五、結語和展望 目前，目前，C端序列測序技術已初步成熟，并開始發揮作用。但其反應的端序列測序技術已初步成熟，并開始發揮作用。但其反應的效率與效率與N端端Edman降解測序法有一定的差距。降解測序法有一定的差距。 因此，

23、目前的主要問題是如何提高反應的產率，特別是如何改善因此，目前的主要問題是如何提高反應的產率，特別是如何改善T，S，D，E幾種氨基酸的測定，以及如何解決幾種氨基酸的測定，以及如何解決P終止測序的問題。如果在終止測序的問題。如果在上述幾方面取得進展，將使上述幾方面取得進展，將使C端可測殘基數大大增加，并減少樣品所需端可測殘基數大大增加，并減少樣品所需量。另外，近年來發現，很多活性多肽的量。另外，近年來發現，很多活性多肽的C端是酰胺化的，如果能檢測端是酰胺化的，如果能檢測酰胺化的酰胺化的C端殘基，將對活性多肽的研究有很大的幫助。端殘基，將對活性多肽的研究有很大的幫助。 C端測序技術仍處于研究和發展階

24、段，雖然該技術還不盡完善，但對端測序技術仍處于研究和發展階段，雖然該技術還不盡完善，但對于確認表達蛋白的于確認表達蛋白的C端是否正確，以及判斷在表達、純化過程中是否發端是否正確，以及判斷在表達、純化過程中是否發生了不必要的加工大有幫助。生了不必要的加工大有幫助。二、裂二、裂 解解 在無水條件下酸裂解，僅僅切下反應的那個殘基。緊挨的在無水條件下酸裂解，僅僅切下反應的那個殘基。緊挨的第二個氨基酸殘基暴露出自由的第二個氨基酸殘基暴露出自由的氨基，又可與氨基，又可與PITC進行進行耦聯反應。耦聯反應。 在這兩種序列儀中，在這兩種序列儀中，Edman降解后的降解后的PTH氨基酸衍生物可及時直接氨基酸衍生

25、物可及時直接從轉化腔中自動輸入高效液相色譜儀中進行從轉化腔中自動輸入高效液相色譜儀中進行PTH氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及定量分析，這樣不僅快速可靠，而且防止了樣品的損失。這兩臺儀器統一定量分析，這樣不僅快速可靠，而且防止了樣品的損失。這兩臺儀器統一用電腦控制，包括化學反應和分析鑒定以及數據的自動記錄和處理。圖用電腦控制，包括化學反應和分析鑒定以及數據的自動記錄和處理。圖4.2為標準為標準PTH氨基酸的色譜分離圖。由圖可見，欲在氨基酸的色譜分離圖。由圖可見，欲在20min內將各組分內將各組分較好分離，需選擇合適的色譜條件，表較好分離，需選擇合適的色譜條件，表4.1列出了各種條件的改

26、變導致個列出了各種條件的改變導致個別組分位置的遷移及圖譜的改善。別組分位置的遷移及圖譜的改善。第三節第三節 影響影響N端端Edman反應裂解率的因素反應裂解率的因素 在測序中往往可以發現，即使在測序中往往可以發現，即使N端很均一的蛋白質端很均一的蛋白質(第一個循環出現單第一個循環出現單個氨基酸殘基個氨基酸殘基)，經過十幾個循環后背景明顯不及第一個殘基清晰。這是，經過十幾個循環后背景明顯不及第一個殘基清晰。這是由于由于Edman反應是一個化學過程，在其耦聯、裂解、轉化等步驟都有可反應是一個化學過程，在其耦聯、裂解、轉化等步驟都有可能發生一些副反應，從而影響最終裂解效率。目前最佳產率為能發生一些副

27、反應，從而影響最終裂解效率。目前最佳產率為9598。因此，經過。因此，經過50次循環后，次循環后，PTH氨基酸分析譜中將出現較多雜峰，氨基酸分析譜中將出現較多雜峰，影響正確辨認，也就是說對于一般蛋白質最多能分析至影響正確辨認，也就是說對于一般蛋白質最多能分析至N端第端第50個氨基個氨基酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質降解成一系列肽段分析后再拼接。酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質降解成一系列肽段分析后再拼接。對于有些蛋白質由于含有較多的對對于有些蛋白質由于含有較多的對Edman反應敏感的殘基或肽鍵，裂反應敏感的殘基或肽鍵，裂解效率將更低。解效率將更低。循環至循環至Ser和和Thr時產率突然降低，這是因為在進行這兩個氨基酸殘基時產率突然降低，這是因為在進行這兩個氨基酸殘基分析前一個循環中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與分析前一個循環中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與Ser和和Thr上的羥上的羥基反應，繼而部分封閉基反應，繼而部分封閉Ser和和Thr的的N端端氨基。氨基。另外，絲氨酸和蘇氨酸的另外，絲氨酸和蘇氨酸的PTI-汀生物也會部分轉化成其他產物，造汀生物也會部分轉化成其他產物，造成產率的降低。成產率的降低。 耦聯試劑耦聯試劑PITC本身也將發生下列副反應，形成一些本身也將發生下列副反應，形成一些“雜質雜質”。測序完。測序完