1、會計學1微生物生長及其控制微生物生長及其控制微生物純培養的分離方法之一微生物純培養的分離方法之一稀釋倒平板法分離微生物稀釋倒平板法分離微生物n微生物純培養的分離方法之二微生物純培養的分離方法之二n稀釋涂布法分離微生物稀釋涂布法分離微生物微生物純培養的分離方法之三微生物純培養的分離方法之三平板劃線法分離微生物平板劃線法分離微生物微生物純培養的分離方法之四微生物純培養的分離方法之四微生物純培養的分離方法之五微生物純培養的分離方法之五 是采用物理、化學因子使微生物細胞生是采用物理、化學因子使微生物細胞生長進行到某個階段而停下來，使先期到達該長進行到某個階段而停下來，使先期到達該階段的微生物細胞不能進

2、入下一生長階段，階段的微生物細胞不能進入下一生長階段，待全部群體細胞都到達該生長階段后，再除待全部群體細胞都到達該生長階段后，再除去該因子，使全部群體細胞同時進入下一個去該因子，使全部群體細胞同時進入下一個生長階段，以達到誘導微生物細胞同步生長生長階段，以達到誘導微生物細胞同步生長的目的。的目的。三、微生物群體生長的測定方法三、微生物群體生長的測定方法將微生物菌體或離心得到將微生物菌體或離心得到的細胞沉淀物置的細胞沉淀物置100105的烘箱中干的烘箱中干燥至水份去除，直至恒重。燥至水份去除，直至恒重。00.511.522.500.20.40.60.81OD值活菌數（億個/毫升）圖示 假單胞菌O

3、D值和活菌數的關系（二）微生物細胞數目（二）微生物細胞數目 的檢測方法的檢測方法 微生物生長測定方法比較微生物生長測定方法比較總細胞數總細胞數血球計數板法血球計數板法 較簡便，但較費時較簡便，但較費時薄膜過濾染色法薄膜過濾染色法 快速簡便，快速簡便，適于含菌數很低的空氣、水等中的總菌計數適于含菌數很低的空氣、水等中的總菌計數活細胞數活細胞數 平皿菌落計數法平皿菌落計數法 簡易價廉，但花費時間較長，不能立刻知道結果簡易價廉，但花費時間較長，不能立刻知道結果薄膜過濾平皿法薄膜過濾平皿法 靈敏度高靈敏度高, 不用于高密度培養物，不能立刻知道結果不用于高密度培養物，不能立刻知道結果細胞濕重法細胞濕重法

4、 較為簡便，但含水量不定，準確度差較為簡便，但含水量不定，準確度差細胞成分含量法細胞成分含量法 如測定蛋白質、核酸、還原糖的含量等如測定蛋白質、核酸、還原糖的含量等細胞干重法細胞干重法 較為費時，較準確，但易受顆粒雜質干擾較為費時，較準確，但易受顆粒雜質干擾 比濁法比濁法 快速簡便，敏感度低，適于發酵液或液體中的快速快速簡便，敏感度低，適于發酵液或液體中的快速 總細胞計數，但需事先標定總細胞計數，但需事先標定測定細胞數目測定細胞數目測定物質量測定物質量分批培養（分批培養（batch culture）就是指將微生物置于一定就是指將微生物置于一定容積的培養液中，經過培養生長，最后一次收獲的培養容積

5、的培養液中，經過培養生長，最后一次收獲的培養方式。方式。2.連續培養連續培養(continuous culture) 基本上說來就是在一個恒基本上說來就是在一個恒定容積的流動系統中培養微生物，一方面以一定速率不定容積的流動系統中培養微生物，一方面以一定速率不斷地加入新的培養液，另一方面又以相同的速率流出培斷地加入新的培養液，另一方面又以相同的速率流出培養物（菌體和代謝產物），以使培養系統中的細胞數量養物（菌體和代謝產物），以使培養系統中的細胞數量和營養狀態保持恒定，即處于穩態。和營養狀態保持恒定，即處于穩態。（二）連續培養類型（二）連續培養類型連續培養類型連續培養類型n1.指數生長公式：指數生

6、長公式：Nt= N02n lgNt=lgN0+nlg2n = lgNt-lgN0 = lgNt-lgN0 lg2 0.301式中式中N0為起始細胞數目，為起始細胞數目，Nt為指數生長某個時刻為指數生長某個時刻t時時的細胞數目，的細胞數目，n為世代數。為世代數。N0、Nt和和t可由實驗獲得可由實驗獲得，n可通過上式計算得出可通過上式計算得出。n世代世代：由：由1個細胞分裂成為個細胞分裂成為2個細胞個細胞的時間間隔被稱為世代。的時間間隔被稱為世代。n代時代時：細胞每分裂一次所需的時間，：細胞每分裂一次所需的時間，也稱世代時間或者增代時間。也稱世代時間或者增代時間。2.微生物生長曲線微生物生長曲線

7、濁度 （光密度） 活菌計數 光密度 遲緩期 細菌停止生長 消亡期 無增長 對數增長期 穩定期 細菌分裂速率最高 活菌數減少 時間 單位體積活細胞數對數 濁度 （光密度） 活菌計數 光密度 遲緩期 細菌停止生長 消亡期 無增長 對數增長期 穩定期 細菌分裂速率最高 活菌數減少 時間 單位體積活細胞數對數 1）延滯期（）延滯期（lag phase）n延滯期延滯期特點特點: a生長速率等于零生長速率等于零 b細胞合成新的成分，代謝活躍細胞合成新的成分，代謝活躍 c細胞形態變大或變長細胞形態變大或變長 d對外界不良環境敏感對外界不良環境敏感影響延滯期長短的因素與實踐意義影響延滯期長短的因素與實踐意義n

8、接種齡接種齡: 對數期的對數期的“種子種子” ，延滯期較短；，延滯期較短； 延滯期或衰亡期的延滯期或衰亡期的“種子種子”，延滯期較長，延滯期較長n接種量接種量： 接種量大，延滯期較短；接種量大，延滯期較短； 接種量小，延滯期較長接種量小，延滯期較長n培養基成分培養基成分: 培養基成分豐富的，培養基成分豐富的， 延滯期較短延滯期較短 培養基成分與種子培養基一致，延滯期較短培養基成分與種子培養基一致，延滯期較短2）指數期）指數期(log phase)n指數期特點指數期特點 a a生長速率最快，細胞呈指數增長生長速率最快，細胞呈指數增長 b b生長速率恒定生長速率恒定 c c代謝旺盛，酶系活躍代謝旺

9、盛，酶系活躍 d d群體的生理特性較一致群體的生理特性較一致影響指數期的因素影響指數期的因素菌種菌種：不同菌種的代時差異極大；：不同菌種的代時差異極大； 選擇對數期菌種、大量接種，選擇對數期菌種、大量接種， 代時短代時短 b營養成分營養成分：營養越豐富，代時越短：營養越豐富，代時越短 c營養物濃度營養物濃度：影響微生物的生長速率：影響微生物的生長速率和總生長量和總生長量 d培養溫度培養溫度：影響微生物的生長速率：影響微生物的生長速率指數期的實踐意義指數期的實踐意義n是代謝、生理等是代謝、生理等科研的良好材料科研的良好材料n是發酵生產中用作是發酵生產中用作“種子種子”的最佳種的最佳種齡齡n是增殖

10、噬菌體的是增殖噬菌體的最適宿主菌齡最適宿主菌齡nG+染色鑒定染色鑒定時采用此期微生物時采用此期微生物3）穩定期）穩定期(stationary phase)n特點：特點： n活細胞總數維持不變，細胞活細胞總數維持不變，細胞生長速率為零生長速率為零，即新繁殖的細胞數與衰亡的細胞數相等即新繁殖的細胞數與衰亡的細胞數相等n菌體菌體總數達到最高點總數達到最高點n芽孢桿菌芽孢桿菌此時此時開始形成芽開始形成芽孢，孢，G+染色發生染色發生變化。變化。n初級代謝產物大量積累初級代謝產物大量積累為什么細胞總數不再增加？為什么細胞總數不再增加？n 營養物質被消耗不能滿足生長需要營養物質被消耗不能滿足生長需要n 代謝

11、廢物或有害物質積累到抑制生長水平代謝廢物或有害物質積累到抑制生長水平n pH、氧化還原勢等物化條件越來越不適應、氧化還原勢等物化條件越來越不適應穩定期的實踐意義穩定期的實踐意義n是發酵生產中以菌體為終產品的是發酵生產中以菌體為終產品的最佳收獲最佳收獲期；期；n某些代謝產物特別是某些代謝產物特別是次生代謝產物發生在次生代謝產物發生在此階段此階段，某些細菌的芽孢也發生在此階段，某些細菌的芽孢也發生在此階段，故又稱作代謝產物合成期；故又稱作代謝產物合成期；n導致了連續培養原理的提出和工藝技術的導致了連續培養原理的提出和工藝技術的改進。改進。4）衰亡期）衰亡期(decline phase,death

12、phase)n特點特點： n細胞以細胞以指數速率死亡指數速率死亡， 細胞死亡速率超過細胞死亡速率超過新生速率，群體新生速率，群體呈負增長呈負增長n細胞變形退化，有的細胞變形退化，有的發生自溶發生自溶n芽孢桿菌此期芽孢桿菌此期開始釋放芽孢開始釋放芽孢n合成或釋放抗生素等次生代謝產物合成或釋放抗生素等次生代謝產物影響衰亡期的因素及實踐意義影響衰亡期的因素及實踐意義n與菌種的與菌種的遺傳特性遺傳特性有關有關: 有些細菌的培養經歷所有有些細菌的培養經歷所有的各個生長時期，幾天以后死亡的各個生長時期，幾天以后死亡, 有些細菌培養幾有些細菌培養幾個月乃至幾年以后仍然有一些活的細胞；個月乃至幾年以后仍然有一

13、些活的細胞；n與與是否產芽孢是否產芽孢有關：產芽孢的細菌更易于幸存下有關：產芽孢的細菌更易于幸存下來；來；n與與營養物質和有毒物質營養物質和有毒物質有關：補充營養和能源，有關：補充營養和能源，以及中和環境毒性，可以減緩死亡期細胞的死亡以及中和環境毒性，可以減緩死亡期細胞的死亡速率，延長細菌培養物的存活時間。速率，延長細菌培養物的存活時間。n根據控制作用的效果分類根據控制作用的效果分類n滅菌滅菌（sterilization）: 凡是能夠凡是能夠殺死或消除殺死或消除材料或材料或物體上物體上全部微生物全部微生物的方法；的方法；n消毒消毒(disinfection): 能夠能夠殺死、消除殺死、消除或降

14、低材料或或降低材料或物體上的物體上的病原微生物病原微生物，使之不致引起疾病的方法；，使之不致引起疾病的方法；n防腐防腐(antisepsis): 能夠能夠防止或抑制霉腐微生物生長防止或抑制霉腐微生物生長，但但不能殺死微生物群體不能殺死微生物群體的方法?？傻姆椒ā？煞乐故称访垢乐故称访垢?。一、一、 溫度溫度最高溫度 最低溫度 最適溫度 1 1、干熱滅菌法干熱滅菌法v 干熱滅菌干熱滅菌：1500C1700C下處理下處理1-2小小時。適用于玻璃器皿、金屬用具等耐熱時。適用于玻璃器皿、金屬用具等耐熱物品的滅菌。優點：可保持物品的干燥物品的滅菌。優點：可保持物品的干燥n1.火焰滅菌（灼燒滅菌）：火焰

15、滅菌（灼燒滅菌）：常用于金屬常用于金屬性接種工具、性接種工具、 污染物品及實驗材料等污染物品及實驗材料等廢棄物的處理。廢棄物的處理。馬釜爐馬釜爐n2.烘箱內熱空氣滅菌法烘箱內熱空氣滅菌法：干燥箱干燥箱。2.濕熱滅菌濕熱滅菌在相同溫度下，濕熱的效力比干熱在相同溫度下，濕熱的效力比干熱滅菌好的原因：滅菌好的原因：熱蒸汽熱蒸汽對細胞成分的對細胞成分的破壞作用更強破壞作用更強熱蒸汽比熱空氣熱蒸汽比熱空氣穿透力穿透力強強蒸汽蒸汽潛熱大潛熱大，當，當氣體轉變為液體時可放出大氣體轉變為液體時可放出大量熱量量熱量，故，故可迅速提高可迅速提高滅菌物體的滅菌物體的溫度溫度。2、濕熱滅菌濕熱滅菌n（1）煮沸消毒）煮

16、沸消毒：水，：水，100處理處理15min以上。以上。n（2）高壓蒸汽滅菌）高壓蒸汽滅菌(autoclave): n 121，壓力為，壓力為1kg/cm2或或15b/in2）或）或0.1Mpa, 時間維持時間維持20min，n 或或113,壓力為壓力為0.6kg/cm2或或8b/in2）或）或0.06Mpa,維持維持30min的方法。的方法。n 適用于一切微生物學實驗適用于一切微生物學實驗，醫療結構或發酵工，醫療結構或發酵工廠中對培養基等多種器材、物料的滅菌。廠中對培養基等多種器材、物料的滅菌。該法不是利用高壓來殺死微生物該法不是利用高壓來殺死微生物，而是利用提高壓，而是利用提高壓力使水的沸點

17、升高，以力使水的沸點升高，以提高水蒸汽的溫度提高水蒸汽的溫度，更加有，更加有效地殺滅微生物。效地殺滅微生物。n121，壓力為，壓力為1kg/cm2或或15b /in2）, 時間維持時間維持2030min，n113，壓力為，壓力為0.6kg/cm2或或8b/in2 ）, 時間維持時間維持3040min，（3）間隙滅菌法）間隙滅菌法(fractional sterilization or tyndallization) 用用80-100蒸汽或蒸煮蒸汽或蒸煮15-60min，殺滅殺滅微生物的營養體，再置于適溫（微生物的營養體，再置于適溫（37）培養，誘培養，誘使其中殘存的使其中殘存的芽孢發芽芽孢發芽

18、，次，次日日再以同法蒸煮和保溫培養，如此重再以同法蒸煮和保溫培養，如此重復復3 3次次。（適于芽孢菌及硫細菌）。（適于芽孢菌及硫細菌）（4）巴氏消毒法）巴氏消毒法(pasteurization):v低溫消毒法低溫消毒法，一般在，一般在 63 ,30min或或 72 ,15s。用于牛奶，啤酒，果酒，醬油等。用于牛奶，啤酒，果酒，醬油等不能進行高溫滅菌的液體。不能進行高溫滅菌的液體。 可殺死其中的可殺死其中的病原菌如結核桿菌、傷寒桿菌等，同時又病原菌如結核桿菌、傷寒桿菌等，同時又不不 損害營養與風味。損害營養與風味。63 ,30min。 72 ,15s ，n有四種類型的輻射作用有四種類型的輻射作用

19、: 紫外光、電離輻射、某種紫外光、電離輻射、某種條件下的強可見光、微波等，可用作控制微生物條件下的強可見光、微波等，可用作控制微生物的生長和保存食品。的生長和保存食品。1.紫外光紫外光n200300nm范圍的紫外光殺菌作用最好。范圍的紫外光殺菌作用最好。n殺菌作用機制殺菌作用機制：使：使蛋白質（約蛋白質（約280nm）和核酸）和核酸（約（約260nm）吸收）吸收變性失活變性失活；也；也可產生有毒可產生有毒的光的光化學產物化學產物-自由基自由基，結合到，結合到DNA 、RNA和蛋白質和蛋白質分子上，分子上，干擾細胞的代謝干擾細胞的代謝過程。過程。形成形成T=T,抑制抑制DNA的的解鏈和復制解鏈和

20、復制n紫外光穿透能力很差，不能穿過玻璃、衣物、紙紫外光穿透能力很差，不能穿過玻璃、衣物、紙張或大多數其他物體，但能夠在空氣中傳播，因張或大多數其他物體，但能夠在空氣中傳播，因而而常用于消毒而不是滅菌。常用于消毒而不是滅菌。n主要用作物體表面或室內空氣的殺菌主要用作物體表面或室內空氣的殺菌。也有采用。也有采用特殊的紫外光輻射裝置替代加熱或漂白粉處理方特殊的紫外光輻射裝置替代加熱或漂白粉處理方法消毒像飲用水等液體。法消毒像飲用水等液體。2.電離輻射電離輻射n主要使用主要使用X射線和射線和射線。當射線。當X射線或射線或射線射線撞擊分子時，撞擊分子時，形成離子和自由基形成離子和自由基分子，故分子，故可

21、稱電離輻射。可稱電離輻射。使使DNA鏈斷裂鏈斷裂，電離輻射，電離輻射產生產生H2O2，使使蛋白質發生變化，細胞受到蛋白質發生變化，細胞受到損傷或死亡損傷或死亡。n電離輻射主要用于其他方法所不能解決的電離輻射主要用于其他方法所不能解決的塑料制品、醫療設備、藥品和食品的滅菌。塑料制品、醫療設備、藥品和食品的滅菌。3.強可見光強可見光400700nm波長波長范圍的強可見光也具范圍的強可見光也具有直接的殺菌有直接的殺菌效應，它們能夠效應，它們能夠氧化細菌細胞內的光敏感分子氧化細菌細胞內的光敏感分子，如核，如核黃素和卟啉環（構成氧化酶的成分）。黃素和卟啉環（構成氧化酶的成分）。實驗室應注意避免將細菌培養

22、物暴露于強光下。此外實驗室應注意避免將細菌培養物暴露于強光下。此外，曙紅和四甲基藍能夠吸收強可見光使蛋白質和核酸，曙紅和四甲基藍能夠吸收強可見光使蛋白質和核酸氧化，因此常將兩者結合用作滅活病毒和細菌。氧化，因此常將兩者結合用作滅活病毒和細菌。4.微波微波微波是一種紅外線。微波并不直接影響微生物微波是一種紅外線。微波并不直接影響微生物,但可但可通過被輻照物體通過被輻照物體產熱而殺死微生物產熱而殺死微生物。然而由于微波加。然而由于微波加熱食品通常存在不均勻問題熱食品通常存在不均勻問題,微生物逃逸微波加熱現象微生物逃逸微波加熱現象常會發生。常會發生?；瘜W治療劑化學治療劑是指那些是指那些能夠特異性地作

23、用能夠特異性地作用于某些微生物于某些微生物并具并具有選擇性的化學藥有選擇性的化學藥劑劑，它們與非特異性的化學藥劑相比，它們與非特異性的化學藥劑相比對人體幾乎沒有什么毒性對人體幾乎沒有什么毒性或毒性很小或毒性很小，可用作治療微生物引起的疾病。，可用作治療微生物引起的疾病。1、抗代謝藥物、抗代謝藥物 定義定義：是指一類：是指一類在化學結構上與細胞內必在化學結構上與細胞內必要代謝物的結構相似要代謝物的結構相似，并可干擾正常代謝并可干擾正常代謝活動活動的的化學物質化學物質。最常用的是磺胺類藥物最常用的是磺胺類藥物?；前坊前放c葉酸合成前體與葉酸合成前體對氨基苯甲酸（對氨基苯甲酸（PABA）的）的結結構類

24、似構類似。葉酸是輔酶葉酸是輔酶，在氨基酸、維生素、核酸，在氨基酸、維生素、核酸和蛋白質合成中起重要作用，很多細菌需要自己和蛋白質合成中起重要作用，很多細菌需要自己合成葉酸才能生長。合成葉酸才能生長。為什么磺胺對人體細胞無毒性？為什么磺胺對人體細胞無毒性？n 因為人因為人缺乏缺乏從對氨基苯甲酸合成葉從對氨基苯甲酸合成葉酸的相關酶酸的相關酶二氫蝶酸合成酶、二氫葉二氫蝶酸合成酶、二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶酸合成酶和二氫葉酸還原酶，故不能，故不能用外界提供的對氨基苯甲酸自行合成用外界提供的對氨基苯甲酸自行合成葉酸，而必須直接利用營養物中的葉葉酸，而必須直接利用營養物中的葉酸做為生長因子。酸做為生長

25、因子。2、抗生素、抗生素 抗生素抗生素是一類是一類由微生物或其它生物由微生物或其它生物生生命活動過程中合成的命活動過程中合成的次生代謝產物次生代謝產物或或其其人工衍生物人工衍生物，它們，它們在很低濃度時就在很低濃度時就能抑制或干擾它種生物（包括病原菌能抑制或干擾它種生物（包括病原菌、癌細胞等）的生命活動、癌細胞等）的生命活動，因而可用，因而可用作優良的化學治療劑。作優良的化學治療劑?？股刈畛跏怯捎茖W家弗來明抗生素最初是由英國科學家弗來明 （A.Fleming）在）在20年代末期偶然發現年代末期偶然發現的，的，40年代初才作為化學治療劑生產問年代初才作為化學治療劑生產問世。世。 青霉素抑制

26、藤黃微球菌的生長青霉素抑制藤黃微球菌的生長 抗生素的抗菌譜：抗生素的抗菌譜：抗生素的作用對象的范圍。通?？股氐淖饔脤ο蟮姆秶?。通常將對將對多種類群的細菌有作用多種類群的細菌有作用的抗生素稱為的抗生素稱為廣譜抗生素廣譜抗生素，如四，如四環素和土霉素既對環素和土霉素既對G又對又對G細菌有作用；而細菌有作用；而只對少數只對少數幾種細菌有作用的抗生素幾種細菌有作用的抗生素則稱為則稱為狹譜抗生素狹譜抗生素，如青霉素，如青霉素只對只對G菌有效。菌有效?？股氐男r單位抗生素的效價單位n就是指衡量抗生素有效成分多少的一種計量單位就是指衡量抗生素有效成分多少的一種計量單位。n 有的是以抗生素的相當生物活性單

27、位的有的是以抗生素的相當生物活性單位的重量作重量作為單位為單位，如如1g=1單位單位(U)，鏈霉素鹽酸鹽就是以，鏈霉素鹽酸鹽就是以此來表示的；此來表示的；n 有的則是有的則是以純抗生素的活性單位相當的實際重以純抗生素的活性單位相當的實際重量為量為1單位而加以折算的，如青霉素單單位而加以折算的，如青霉素單位最初是以位最初是以能在能在50ml肉湯培養基內完全抑制金黃色葡萄球菌肉湯培養基內完全抑制金黃色葡萄球菌的最小青霉素的量作為一個單位，以后青霉素純的最小青霉素的量作為一個單位，以后青霉素純化后確定這一量相當于青霉素鈉鹽化后確定這一量相當于青霉素鈉鹽0.5988g，因，因而定而定0.5988g青霉

28、素鈉鹽為一個青霉素單位。青霉素鈉鹽為一個青霉素單位?？股刈饔脵C制抗生素作用機制二、微生物的抗藥性二、微生物的抗藥性n微生物產生抗藥性的機制有微生物產生抗藥性的機制有6種：種：n結構發生改變導致某類藥物作用的結構缺失結構發生改變導致某類藥物作用的結構缺失，如某些細菌在青霉素存在時轉變成細胞壁缺失的如某些細菌在青霉素存在時轉變成細胞壁缺失的L型，使青霉素無法發揮作用；型，使青霉素無法發揮作用；n細胞膜對藥物的通透性和吸收能力降低細胞膜對藥物的通透性和吸收能力降低, 如委內如委內瑞拉鏈霉菌細胞通過膜透性發生改變瑞拉鏈霉菌細胞通過膜透性發生改變, 阻止四環素阻止四環素進入細胞；進入細胞；n激活膜上抗藥泵蛋白將