1、B.1 三步法 急性毒性 (口飼) 急性毒性等級方法1. 方法1.1. 引言急性毒性分級方法給危險性評估和危險性分類提供信息。基于研究的結果,這種方法使用三份固定的劑量使一個化合物被足夠地分開以至能夠分類。 此外，在這一個測定方法中被描述的實驗步驟允許選擇使用三個附加的固定劑量。它們可以也被當作假設結論的選項，又可以用作更進一步的選項。在更進一步的改良值得去做或需要去做的情況下，我們將考慮附加藥劑的使用。方法使用定義了初始劑量，但這并不意味著計算精確可達到 LD50。相反，由于動物樣品的死亡是整個實驗的終點，當死亡可以預料時，超出一定范圍的劑量也是允許的。 實驗的結果應該允許根據附件 標準來分

2、類。依據這種方法持續性，測定的時間可以比B.1中描述的要長。這種方法的主要優點是，它所需的動物數量比急性毒性（口飼）（B.1）和選擇性固定劑量方法（B.1 兩步法）要少。也見一般引言 B部分 。1.2. 定義見一般引言B部份。1.3. 測定方法原理對一組實驗動物通常使用一種改良了的劑量，使用漸進的實驗步驟來測定實驗物質的性質。每一步使用同性別的三只動物。沒有必要進行實驗前的光照研究。關系到動物死亡率的物質缺少或存在的劑量使用取決于上一步的劑量，例如：- 沒有必要進行更深一步的測定- 下一步，藥劑的劑量沒有改變，但被用于另一種性別的動物- 下一步，將使用下一個更高或更低的劑量水平1.4. 測定方

3、法的描述1.4.1. 準備階段隨機選取健康年輕的動物，標上記號以示區別，為了讓它們熟悉環境，還得在測定前五天把它們關進籠子里。這些動物可以根據性別和劑量水平進行劃組歸籠，但每個籠子里面動物不能太多以至干擾了對每個個體的清晰觀察。測定物質以確定的劑量用胃管或插管強食地注入動物體內。如果需要，測定物質要被溶解或懸浮在合適的媒介物質中。建議只要可能的話，首先考慮用水，再考慮用油或其他媒介物。對于非水溶性測定物，在測定前必須知道或確定媒介物的毒性。動物在使用劑量前應該禁食；但水要保證供給。1.4.2. 測定條件1.4.2.1. 測定動物除非有禁忌癥，一般老鼠是常用的嚙齒動物。雌性必須是未生育的和沒有懷

4、孕的。在研究的開始階段，每種性別的體重差別不得超過平均水平的20%。1.4.2.2.數量和性別每一步驟用同性別的三只動物. 在開始，性別可以任選。1.4.2.3.劑量水平使用的初始劑量是從三個確定的水平里選擇的，如25, 200 和2000mg/kg .而且初始劑量應該有利于導致部分樣品的死亡。在附件里面描述的操作流程也可以依據初始劑量做相應的參考文獻。對于性別和初始劑量的選擇，應該利用所有可用的信息，包括組織活性相關的信息。當結果顯示死亡并不是出現在最大使用劑量時，就應該進行限制的測定。如果不了解被測定物質的情況，出于動物生存著想，建議使用200 mg/kg的初始劑量。有時，非常需要得到比確

5、定劑量水平更高的精度，在這種情況下，就需要考慮額外的劑量水平如5，50 或500 mg/kg等。由于腐蝕性或嚴重的刺激性反應能引起明顯的痛苦的劑量無需實施。處理組之間的時間間隔在毒性跡象的初始，中期和最嚴重時分別測定。其他性別的動物或下個劑量的處理要延遲直到我們相信前一個劑量下的動物能存活下來。1.4.2.4.極限測定在一個藥劑等級中，兩組異性動物（每組3只）需要消耗至少2000mg/kg的試劑。若出現與化合物有關的死亡，則需考慮進一步消耗200mg/kg的試劑來測定。1.4.2.5.觀察期觀察期需延續至少14天，除非動物已死或者需要中止研究并人道宰殺。當然，其長度并非嚴格規定的，需就實驗中毒

6、發反應、開始毒發的比率以及康復期的長度等具體情況作適當調整。毒發開始及結束、出現死亡的時刻十分重要，特別是當中毒反應的出現有延遲的跡象時。每一只動物樣品的觀察結果需獨立地、系統地記錄下來。1.4.3.實驗步驟在測定動物樣品的禁食期過后稱重，再使其與測定物質接觸，接觸過后，34小時內動物不得進食進水。如果藥劑是連續分批提供給動物樣品的，則視接觸期的長度以供給動物食物。一次提供給動物樣品的液態藥劑的最大量由動物樣品的體格大小決定。供給嚙齒類動物，用量通常不超過1ml/100g；如果是含水的溶液，則2ml/100g也可行。應通過調節藥劑濃度來將所需藥劑量的變化降至最低，以保證所有藥劑濃度等級的量恒定

7、。若不能一次性提供給動物以藥劑，則可以分批供給，但供給期不得超過24個小時。測定步驟的細節參看附錄1。1.4.3.1.總體觀察與藥劑接觸的當天至少需要對測定動物進行兩次詳細地臨床觀察，在動物有反應的當天需要進行更多次的臨床觀測，之后每天起碼一次。垂死的以及呈現出持續經歷劇痛的動物需被人道無痛宰殺。人道宰殺的動物也被視為測定致死。當動物死亡或被人道宰殺時，應盡量準確地把時間記錄下來。如果有動物持續顯示出中毒跡象，則需特別觀察。觀察應包括以下方面的變化情況：皮膚及毛發、眼睛、黏液膜、呼吸系統、循環系統、自主系統、中樞神經系統、肢體運動神經活動以及行為方式。特別需要對以下幾方面關注：呼吸行為、驚恐、

8、抽筋、唾液分泌、下痢腹瀉、無知覺無感覺、睡眠和昏迷。每一只動物樣品的所有觀察結果需獨立地、系統地記錄下來。1.4.3.2.體重在與測定物質接觸前，所有動物均需稱重，測定開始后，每周也至少稱重一次。需計算和記錄其體重變化情況。測定結束后，所有仍生還的動物需先稱重再人道宰殺。1.4.3.3.解剖所有被測定的動物（包括在測定過程中死亡或被中止測定的）均需被解剖。每只動物樣品的肢體病理學變化均應記錄下來。還應考慮對器官進行顯微鏡檢查所得到的肢體病變的信息（當動物存活了24小時或更長時間）。2.實驗數據應提供動物樣品的獨立實驗數據。另外，每個測定小組都應以表格形式對實驗數據進行總結。表格應表明以下幾個方

9、面：測定所使用的測定動物樣品的數目、呈現中毒跡象的動物樣品的數目、測定過程中死亡或人為處死的動物樣品的數目、每只動物樣品的死亡時間、中毒跡象出現以及消失的時間以及對此現象的描述以及解剖發現。有關對實驗結果進行評價討論的指導參看附錄 2。3.實驗結果報告實驗結果報告測定結果應包含以下幾方面信息：測定動物：- 測定動物種類、來源；- 測定動物樣品的已知的微生物狀況；- 測定動物樣品的數量、年齡及性別；- 動物來源、飼養環境、飲食情況等；- 每一只動物在以下幾個時刻的體重：測定開始時、開始后每周以及測定結束時。測定條件：- 如不用水，選用其他媒介物的理由；- 向測定動物提供測定物質的細節，包括藥劑的

10、量以及接觸時間；- 供給的水與食物質量的詳細情況，包括其來源和種類；- 選擇何種初始劑量的合理理由。實驗結果：- 某一性別、藥劑濃度等級的響應實驗數據制成表格形式（即測定動物所顯示的中毒跡象，包括：死亡率、類型、程度及持續時間）；- 每只動物從開始呈現中毒跡象到恢復（如果有恢復）所經歷的時間過程；- 每只動物樣品的解剖結果以及任何組織病理學上的發現。結果討論結論4.參考文獻此方法與OECD TG 423相類似。 附錄檢 測 步 驟1.按1.4.2.3.所示，起始劑量應在被測定動物之中造成一定的死亡率。以下是一些用以選擇起始劑量的憑據：物理化學性質數據；組織-行為關系；其他毒性測定實驗的實驗數據

11、；對測定物質的前期使用情況。2.在此附錄中，每一種起始劑量都有其獨立的測試步驟，測試程序隨后給出。根據人道宰殺的動物樣品或測試中死亡動物的數目依圖表箭頭來選擇測定步驟。3.當起始劑量為25或200mg/kg時，另一性別的動物死亡數目為一只時，通常來說，不要進行進一步的測定。然而，如果從另外五只動物身上無法觀察到中毒現象，分析時應考慮到死亡數與施以藥劑無關；這樣，則需提高藥劑的濃度等級繼續實驗。4.當藥劑量為2000mg/kg時兩個性別各有一只動物死亡，做LC50測定的結果應該會超過這個值。然而，由于這個結果是不定的，所以需要仔細觀察參考文獻兩性各剩余的兩只動物樣品的反應，這四只動物樣品的明顯的中毒跡象的出現可以很好地導致符合LC50值（2000mg/kg或更少）的種類的出現，并且為同濃度等級的藥劑的進一步的測定提供依據。5.這個過程允許檢測以三種附加的固