1、第4課時 分解纖維素的微生物的分離目標導讀1.掌握纖維素酶的種類和作用及纖維素分解菌的篩選方法。2. 理解并掌握纖維素分解菌的篩選過程及剛果紅染色法的原理。3. 掌握纖維素酶的測定方法。重難點擊1.簡述纖維素酶的種類及作用。2.學握從土壤中分離某種特定微生物的操作技術。3.分 析分離分解纖維素的微生物的實驗流程，弄懂實驗操作的原理。d知識梳理一纖維素分解菌的篩選的原理夯實基礎突破要點1. 纖維素與纖維素酶(1) 纖維素據圖，纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物,是地球上含量最豐富的多糖類物質。 輕是自然界中纖維素含量最高的天然產物。纖維素能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它 們能

2、夠產生纖維素酶。碳k(2) 纖維素酶 組成：一種復合酶，它至少包括三種組分，即q酶、q酶和葡萄糖莉酶° 作用麗烈空維二糖|葡胡帕叭|葡萄糖(3) 實驗驗證試管濾紙條緩沖溶液纖維素酶(7080 u/ml)條件結果11 x6 cmph=4.8 的 0.1 mol/l醋酸醋酸鈉緩沖溶液 10 ml1 ml兩試管固定在50 ml錐形瓶中，在搖時間足夠 長，濾紙被完全分解ph=4.8 的 0.1 mol/l床上以14021 x 6 cm醋酸一醋酸鈉緩沖溶r/min的轉速基本無變化液uml振蕩反應1h 1個酶活力單位是指在溫度為25 °c,英他反應條件最適宜情況下，在丄min內轉化l_

3、mmol的底 物所需要的酶量。 實驗是如何構成對照的？答案在一支試管中添加纖維素酶，另一支試管不添加纖維素酶；盡管醋酸一醋酸鈉緩沖液用量不 同，但都能維持相同的ph。2. 纖維素分解菌的篩選(1) 方法：剛果紅染色法。常用的有兩種方法，-種是先培養微生物,再加入剛果紅進行顏色反應; 另一種是在倒平板吋就加入剛果紅。(2) 原理：剛果紅+纖維素-紅色復合物纖細叔譏纖維素被分解,出現以纖維素分解菌為中心的透明 圈，我們可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。【歸納提煉】兩種剛果紅染色法的比較頁目內方法一方法二過程培養基上長出菌落-覆蓋質量濃度為1 mg/ml的cr溶液:倒去cr熔液加入nacl溶

4、液倒掉nacl溶液一出現透明圈配制cr溶液一滅菌一按照1 ml cr/200 ml培養基比例混勻一倒平板一培養一出現 透明圈優點顯示出顏色反應基本上是纖維素分 解菌的作用操作簡便，不存在菌落混雜問題缺點制作繁瑣，加入剛果紅會使菌落之間 發生混雜由于瓊脂、土豆汁中均含有淀粉類物質， 可能使產生淀粉酶的微生物也形成透明圈， 即假陽性反應；有些微生物具有降解色素 的能力，它們會降解剛果紅形成透明圈，與 纖維素分解菌不易區分b活學活用即時訓練鞏固提升1. 微生物體內能夠使纖維素分解成纖維二糖的酶是()a. ci酶和cx酶b.ci酶和葡萄糖昔酶問題導析纖維素是在c,酶和cx酶的作用下被分解為纖維二糖，葡

5、萄糖營酶可以將纖維二糖分解 為葡萄糖。解析 纖維素酶屬于復合酶，至少包含c酶、cx酶和葡萄糖昔酶三種組分。其中c酶和cx酶使 纖維素分解成纖維二糖。2. 鑒定纖維素分解菌時，可以使用剛果紅對其染色，剛果紅染色法有兩種常用方法，兩種剛果紅染 色法的結果是（）a. 均會出現透明圈b.方法一出現，方法二不出現c.均不會出現透明圈d.方法一不出現，方法二出現問題導析剛果紅可以跟纖維素結合形成紅色復合物，加入纖維素酶后纖維素被分解,不能形成紅魚復合物，從而出現透明圈。兩種方法都能使纖維素分解，都能形成透明圈。解析 兩種剛果紅染色法染色的時間不同，但結果一樣，均出現透明圈。二實驗設計與操作提示n知識梳理夯

6、實基礎突破要點結合實驗原理和教材給出的資料，完成下面的實驗方案流程圖。1. 實驗過程分析土壤収樣：選擇富含纖維素的環境,如樹林屮多年形成的腐殖土廠目的：增加纖維素分解菌的濃度,確保能夠從 樣品中分離到所需要的微生物操作方法：將20克土樣，在無菌條件下加入 選擇培養（可省祁 裝有30 ml選擇培養基的錐形瓶中，將瓶 固定在搖床上,在一定溫度下振蕩培養】2d,直至培養液變混濁,也可重復選擇培養'1 ml培養液+ 9ml蒸憎水 混勻成p倍稀釋液梯度稀釋r匕昆勻成10&倍稀釋液涂布培養：將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養呈上篩選菌株:剛果紅染色法,挑選產牛透明圈的菌落純化培養2. 兩種

7、培養基纖維素分解菌的選擇培養基配方1纖維素粉5gnano31 gna2hpo4-7h2ol2gkh2po40.9 gmgso4-7h2o0.5 gkc10.5 g酵母膏0.5 g水解酪素0.5 g將上述物質溶解后，用蒸憎水定容到1 000 h1l鑒別纖維素分解菌的培養基配方2cmc-na5 10g酵母膏1 gkh2po40.25 g瓊脂15 g土豆汁100 ml將上述物質溶解后，用蒸錮水定容到1 000 ml(1) 從功能上來看，培養基配方1為纖維素分解菌的選擇培養基,該培養基中的唯一碳源是纖維素粉, 只有能利用它的纖維素分解菌才能生存；培養基配方2為纖維素分解菌的鑒別培養基。在該培養基 中加

8、入剛果紅溶液,當培養基中長出菌落后，由于在該培養基上生長的只能是纖維素分解菌,能分 泌纖維素酶,因此菌落周圍會形成透明圈。(2) 從物理性質上來看，培養基配方1為纖維素分解菌的邂培養基，利用這種培養基可以增加纖維 素分解菌的濃度；培養基配方2為纖維素分解菌的固佐培養基，原因是添加了瓊脂成分,需要在培 養基上形成我們肉眼可見的菌落。(3) 若設置一個對照實驗說明選擇培養的作用，應控制的變量是將纖維素粉改為葡萄糖。3. 結果分析與評價(1) 培養基的制作是否合格：對照的培養基在培養過程中沒直菌落生長，則說明培養基制作合格°(2) 選擇培養基是否篩選出菌落：如果觀察到產生透明圈的菌落,則說

9、明可能獲得了分解纖維素的微 生物。(3) 分解的結果是否一致：由于在土壤中細菌的數量遠遠高于真菌和放線菌的數量，因此最容易得到 的是細菌。但由于所取土樣的環境不同，學生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結果。4. 課題延伸(1) 為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行發酵產纖維素酶的實驗,纖維素酶的發酵方法 有液體發酵和固體發酵兩種。(2) 纖維素酶的測定方法：一般是采用對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產生的苞飆含量進行定量 測定。【歸納提煉】纖維素分解菌的選擇培養基和鑒別培養基的區別(1) 纖維素分解菌的選擇培養基為液體培養基，因培養基中無凝固劑，利用液體選擇培養基以增加纖 維素分解菌的

10、濃度。(2) 能產生纖維素酶的微生物能以纖維素作為碳源和能源，在培養基中正常生長，其他絕大多數生物 不能正常生長。(3) 鑒別培養基中含有瓊脂，為固體培養基，剛果紅染色法應用的就是此培養基。活學活用即時訓練鞏固提升1. 下列關于分離纖維素分解菌的實驗的敘述，錯誤的是()a. 經選擇培養后將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上b. 選擇培養這一步可省略，但培養纖維素分解菌少c. 經稀釋培養后，用剛果紅染色d. 對照組可用同樣量的培養液涂布到不含纖維素的培養基上問題導析經選擇培養后的樣品需經梯度稀釋后,才能涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上。解析 經選擇培泰后，再經稀釋，才能將樣品涂布到鑒別纖維素分

11、解菌的培養基上；選擇培養可省 略；經橋釋培養后，用剛果紅染色；設置對照能證明經選擇培養的確得到了欲分離的微生物。2. 鑒別培養基是根據微生物的代謝特點在培養基中加入一些物質配制而成的，這些物質是()a. 指示劑或化學藥品 b.青霉素或瓊脂c.高濃度食鹽d.維生素或指示劑問題導析鑒別培養基是在培養基中加入某種試劑或化學藥品,使培養后會發生某種變化，從而區 別不同類型的微生物；培養基中加入青霉素或高濃度食鹽的目的是抑制某些微生物的生長；瓊脂為 凝固劑。解析 在培養基中加入青霉素或高濃度食鹽的目的是抑制某些微生物的生長，而加維生素一般是為 微生物提供生長因子，起不到選擇或鑒別作用，只有在加入某種指示

12、劑或化學藥品后，某些微生物 會與特定的化學物質發生特定的化學反應，而表現出特有的菌落特征，我們可以根據這些特征去判 斷屬于哪種微生物。分一纖維索酶-種類作用最適ph、催化活力解llif w 譏#纖篩選廉艸剛果紅染色維l'山怪染色法索實驗設計*土壤取樣*富含纖維素十.壤的選擇培斥增大分解歯介於生物的梯度稀釋分'典i涂布培養篩選菌株純化培養f分離出分解菌 ,1. 在加入剛果紅的培養基屮出現透明圈的菌落是（）a. 分解尿素的細菌b.硝化細菌c.分解纖維素的細菌d.乳酸菌解析分解纖維素的細菌能將纖維素分解，剛果紅一纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現 以纖維素分解菌為中心的透明圈。

13、2. 不能夠與剛果紅反應生成紅色復合物的是（）a. 纖維二糖b.纖維素c.cmc-nad.淀粉解析剛果紅可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但不與纖維二糖、葡萄糖、麥芽糖 等發生反應。3. 下列對剛果紅染色法的敘述，不正確的是（）a. 可以先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應b. 可以在倒平板時就加入剛果紅c. 既可以先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，也可以在倒平板時就加入剛果紅d. 可以將剛果紅與培養基中其他物質一起放入培養基后再滅菌倒平板解析 剛果紅染色法一般有兩種：一種是先培養微生物長出菌落后，再加入剛果紅進行顏色反應， 然后加入一定濃度的nacl溶液將多余的剛果紅帶走；

14、一種是配制好培養基滅菌后，倒平板時加入滅 菌處理的剛果紅，再接種微生物培養直至產生透明圈。4. 植物秸稈中的纖維素可被某些微生物分解。回答下列相關問題：(1) 分解秸稈中纖維素的微生物能分泌纖維素酶，該酶是至少由3種組分形成的復合酶，其中的葡萄糖甘酶可將分解成o(2) 在含纖維素的培養基屮加入剛果紅(cr)染料時，cr可與纖維素形成色復合物。用含有cr的該種培養基培養纖維素分解菌時，培養基上會出現以該菌的菌落為中心的o(3) 為從富含纖維素的土壤中分離獲得纖維素分解菌的單菌落并加以鑒定，某同學設計了甲、乙兩種 培養基：酵母膏無機鹽淀粉纖維素粉瓊脂cr溶液水培養基甲+培養基乙+注：“ + ”表示

15、“有”，“一”表示“無”。據表判斷，培養基甲(填“能”或“不能”)用于分離纖維素分解菌，原因是；培養基乙(填“能”或“不能”)用于鑒定纖維素分解菌，原因是o答案(1)纖維二糖制萄糖(2)紅透明圈(3)不能液體培養基不能分離單菌落不能培養 基中沒有纖維素解析(1)纖維素酶中的葡萄糖昔酶能將纖維二糖分解成葡萄糖。(2) 在含纖維素的培養基中加入剛果紅(cr)染料吋，cr可與纖維素形成紅色復合物，并不與水解后 的纖維二糖和葡萄糖發生這種反應，所以用含有cr的培養基進行培養時，會出現以纖維素分解菌 為中心的透明圈。(3) 根據表格中的相關信息甲不能做為分離纖維素分解菌，因為其中沒有瓊脂，液體培養基是不

16、能分 離單菌落的。培養基乙不能用于分離纖維素分解菌，因為培養基中沒有纖維素，無法形成紅色復合 物，無法篩選。40分鐘課時作業強化訓練拓馬據升基礎過關知識點一 纖維素分解菌的篩選的原理1. 纖維素酶可以將下列哪種物質分解()a. 牛肉片b.魚片c.濾紙條d.塑料條解析 纖維素酶只能使纖維素分解，本題中只有c項濾紙條的主要成分是纖維素，所以可以將濾紙 條分解。2. 選擇培養基是根據某一種或某一類微生物的特殊營養要求或對一些物理、化學抗性而設計的培養 基。利用這種培養基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。為選擇酵母菌和硝化細菌, 應選用的培養基分別為（）a. 伊紅美藍培養基、含青霉素培養基

17、b. 含青霉素培養基、含氨的無機培養基c. 含氨的無機培養基、含青霍素培養基d. 含青霉素培養基、伊紅美藍培養基解析 酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培養基進行選擇培養，因為青霉素抑制細菌生長，但 不抑制真菌生長。硝化細菌為自養型生物，能夠利用氨轉變為亞硝酸和硝酸所釋放的能量，把無機 物轉變為有機物以維持自身生命活動，利用含氨的無機培養基可進行選擇培養。3. 剛杲紅是一種酸性染料，能將下列哪些物質染色（）纖維二糖葡萄糖纖維素蘇木精彈性纖維a. b.c.d.解析 剛果紅是一種酸性染料，可與纖維素反應形成紅色復合物，在動物組織制片中用來染神經軸、 彈性纖維、胚胎材料等，在植物制片中可以跟蘇木精作

18、二重染色。4. 要將能分解纖維素的細菌從土壤中分離出來，應將它們接種在（）a. 加入伊紅美藍的鑒別培養基上b. 含有蛋白豚的固體培養基上c. 只含纖維素粉而無其他碳源的選擇培養基上d. 含四大營養要素的培養基上解析 要把纖維素分解菌從土壤中分離出來，就要選擇能使纖維素分解菌生存，但其他微生物不能 生存的選擇培養基進行培養，其選擇條件是以纖維素粉作為唯一碳源。在該培養基上，只有能分解 纖維素的細菌能夠生存，其他微生物因不能利用纖維素而不能生存。知識點二實驗設計與操作提示5. 從土壤中篩選纖維素分解菌的實驗設計，正確的是（）a. 土壤取樣一梯度稀釋”稀釋涂布平板-> 挑選菌落b. 土壤取樣一

19、選擇培養一稀釋涂布平板一挑選菌落c. 土壤取樣一梯度稀釋一選擇培養一挑選菌落d. 土壤取樣一梯度稀釋”稀釋涂布平板一選擇培養一挑選菌落正確的流程是“土壤取樣一選擇培養一稀釋涂布平板一挑選菌落”，其中選擇培養的目的是增加纖 維素分解菌的濃度，因此需要在稀釋涂布平板之前進行，最后根據菌落的特征挑選纖維素分解菌。6. 在加入剛果紅的培養基中會出現透明圈，產生的透明圈是（）a. 剛果紅與纖維素形成的復合物b. 剛果紅與纖維二糖形成的復合物c. 纖維素分解后形成的葡萄糠導致的d. 以纖維素分解菌為中心形成的解析 剛果紅可以與纖維素結合形成紅色復合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發生這種反 應。當纖維

20、素被纖維素酶分解后，剛果紅一纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素 分解菌為中心的透明圈。7. 在將樣品稀釋涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上之前一般先進行選擇培養，其主要h的是（）a. 完全除去其他微主物b. 沒有意義，去掉這一步更好c. 增加纖維索分解菌的濃度d. 使纖維素分解菌充分長人解析 纖維素分解菌如果在所采集的土樣中含量少，稀釋涂布到鑒別培養基上后形成的菌落數少， 不利于挑選所需菌落，通過選擇培養可以增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所 需要的微生物。&通過分離分解纖維素的微生物實驗，對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選，這只是分離提純 的第一步，還需

21、要進行（）a. 發酵產纖維素酶的實驗b. 提取纖維二糖的實驗c. 濃縮纖維素分解菌的實驗d. 提取葡萄糖的實驗解析 對纖維素分解菌的鑒定，常用的方法是對分離的菌種進行發酵產纖維素酶的實驗。能力提升9. 使用剛果紅染色時，加入剛果紅可以在（）制備培養基時梯度稀釋時倒平板時涂布時長岀菌落后a.b.c.d.解析 常用的剛果紅染邑法有兩種，一種是先培養微生物，長岀菌落后再加入剛果紅進行顏色反應； 另一種是倒平板時就加入剛果紅。最終，兩種染邑法都可以在培養基上觀察到以纖維素分解菌為中 心的透明圈。10. 下列生物能分解纖維素的是（）人兔牛蘑姑纖維桿菌a.b.c.d.解析 兔、牛為食草動物，其腸道內有分解

22、纖維素的微生物，蘑菇、纖維桿菌能分泌纖維素酶分解 纖維素；而人不能消化纖維素。11. 下列有關剛果紅染色法的敘述，不正確的是（）a. 剛果紅可以在細菌菌落形成前倒平板吋加入b. 剛果紅可以在菌落形成后加入c. 剛果紅在菌落形成前倒平板時加入，加入的剛果紅不需要滅菌d. 在菌落形成后加入剛果紅時，剛果紅不需要滅菌解析 剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，當纖維素被纖維素酶分解后，紅色復合物無法形成， 出現以纖維素分解菌為中心的透明圈，我們可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。剛果紅 可以在細菌菌落形成前倒平板時加入，也可以在菌落形成后加入。若在細菌菌落形成前倒平板時加 入剛果紅，則所加剛果紅要

23、進行滅菌，以防雜菌的侵入，影響纖維素分解菌菌落的形成；若在菌落 形成后加入剛果紅，則不需要滅菌。12. 在對纖維素分解菌進行選擇培養時，用液體培養基的目的是（）a. 可獲得大量菌體b. 纖維素分解菌適宜在液體培養基上生長c. 可以充分利用培養基中的營養物質d. 可獲得高純度的纖維素分解菌解析 不同物理形態的培養基其作用不一樣，固體培養基用于菌種的分離、鑒定、菌落計數、菌種 保藏等；液體培養基可用于獲得大量菌體。13. 下列有關纖維素分解菌的分離的敘述，不正確的是（）a. 纖維素酶的發酵方法有液體發酵和固體發酵b. 對纖維素分解菌進行初步篩選后，無需再進行其他實驗c. 纖維素酶的測定方法，一般是

24、對所產生的葡萄糖進行定量的測定d. 纖維素酶是一種復合酶解析 初步篩選只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發酵產生纖維 素酶的實驗。14. 下圖為分離并統計分解纖維素的微生物的實驗流程，據此回答有關問題：土壤取樣梯度稀釋|將樣品接種到鑒別纖維素分解菌的培養基上|（1）要從富含纖維素的環境中分離纖維素分解菌，從髙溫熱泉中尋找耐熱菌，這說明(2) 在將樣品接種到鑒別纖維素分解菌的培養基上之前，可通過選擇培養增加纖維素分解菌的濃度， 某同學根據需要配制了纖維素分解菌的培養基如下表。整個實驗過程嚴格無菌操作，如果將其中的 纖維素粉換成，菌落數，即可說明選擇培養基的作用。成分含量

25、纖維素粉5.0 gnano3l.ogna2hpo4-7h2o1.2 gkh2po40.9 gmgso4-7h2o0.5 gkc10.5 g酵母膏0.5 g水解酪素0.5 g蒸憎水定容至1 000 ml(3) 接種微生物最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法，本實驗宜采用法，原因是o 解析 在尋找目的微生物時要根據目的菌株對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找；微生物的 選擇培養就是根據微生物的不同特點，在培養基中加入某些物質，允許一部分微生物的生存，而抑 制另一部分微生物的生長。在本實驗中，由于只有纖維素分解菌才能利用培養基中的纖維素，因此 只含有纖維素粉的培養基為選擇培養基，而葡萄糖是許多微生

26、物都能利用的碳源，因此通常用葡萄 糖來配制完全培養基，在選擇培養基上生長的微生物種類少，菌落數就少；微生物的分離的接種方 法有平板劃線法和稀釋涂布平板法，因為這兩種方法都能使菌體分散到培養基的表面，但是平板劃 線法不能確定接種量，而稀釋涂布平板法可以確定接種量，因此平板劃線法不能根據稀釋液體積計 算每克樣品中的菌株數。15. 雖然現在大力提倡無紙化辦公，但是每年仍然不可避免地要產生大量的廢紙，其主要成分是木質 纖維，人類正努力將其轉化為一種新的資源乙醇。如圖是工業上利用微生物由纖維素生產乙醇 的基本工作流程，請回答相關問題：(1)自然界中環節需要的微生物大多分布在的環境中。將從土壤中獲得的微生物培養在以為唯一碳源、并加入的培養基上篩選周圍有的菌落。（2）如上所述的篩選中獲得了三個菌落，對它們分別培養，并完成環節，且三種等