1、熱痹清顆粒的質量標準提升研究孫曉靜楊柳李力解小霞李婷武漢市中醫醫院國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室摘要：目的:建立熱痹清顆粒的質量標準。方法:采用薄層色譜法(tlc)對熱痹清顆粒 中知母、赤芍、忍冬藤、車前草進行定性鑒別;采用反向高效液相色譜法對熱痹 清顆粒中馬錢苗、3藥苗進行含量測定，色譜枯為wondasil c18 (4. 6111111x2sonini,5 pm),流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，流速為l.omlinin1，檢測 波長為236nni (馬錢苻)、230nm (芍藥苷)，柱溫為30°c。結果:tlc斑點清晰， 分離度良好，陰性對照無干擾;馬錢苷、芍藥苻

2、分別在各自進樣量范圍內與峰面 積呈良好線性關系，相關系數均在0.999 9以上，平均加樣回收率分別為 100.04%、98.35%, rsd分別為1.46、1.64 (n=6) 0結論：該方法快速、準確、 專屬性強，可作為熱痹清顆粒質量控制的方法。關鍵詞：熱痹清顆粒;質量標準;馬錢苷;芍藥苷;芒果苷;大車前苷;作者簡介：孫曉靜，女，碩士研允生，主管中藥師，主要從事中藥制劑研允工作; 電話e-mail: jing_228sina. com作者簡介：楊柳，女，碩士研究生，主管中藥師，主要從事中藥制劑研究工作； 電話e-mail:4895425

3、3qq. com收稿日期：2017-07-18基金：基金項目：武漢市中青年醫學骨干人才培養工程(武衛生計生通20159 號)improvement of quality standard of rebiqing granulessun xiao-jing yang liu li li xie xiao-xia li tingwuhanho suit al o ftrad i t i onal ch ines e medicine,traditional chinese medicine pharmaceuticallaboratory of state administration oftra

4、ditional chinese medicine;abstract：objective to establish the quality standard for rcbiqing granules. methods tlc was adopted to identify rhizoma anemarrhenae, red peony, honeysuckle and plantain. contents of loganin, paeoniflorin in rebiqing granules were determined by rp-hplc. wondasil c18 (4. 6 m

5、mx 250 mm, 5 u m) was the analytical column. the mobile phase was acetonitri 1e"0. 2% phosphoric acid aqueous solution for gradient elution, at a flow rate of 1. 0 ml min'1, detection wavelengths of 236 nm (loganin) and 230 nm (paeoniflorin) . the column temperature was 30 °c. results

6、tlc spots were clear and well separated without negative interference. the calibration curves of loganin and paeoniflorin were in good linearity. the average recovery rates were 100. 04% and 98. 35%, rsd 1. 46 and 1. 64 (n=6). conclusion the method is fast, accurate and has good specificity and can

7、be used for quality control of rebiqing granules.keyword：rebiqing granules; quality standard; loganin; paeoniflorin; mangiferin; plantamajoside;received： 2017-07-18熱痹清顆粒（鄂藥制字z20112095）為武漢市中咲咲院現有咲院制劑，由生石 膏、知母、赤芍、全蝎、忍冬藤、車前草、土茯苓、薏苡仁、甘草九味中藥組成。 該方經過臨床驗證，療效確切，質量穩定，口碑較好。其具冇清熱利濕，通絡止 痛的功效，臨床上主要用于類風濕性關節炎、骨關節炎

8、、痛風性關節炎所引起的 關節紅腫疼痛、屈仲不利等癥。知母清熱瀉火，滋陰潤燥，具有抗腫瘤、改善老 年性癡呆癥狀、降糖、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗凝血、抗炎、改善骨質疏松癥 狀等作用；赤芍清熱涼血，活血祛瘀，具有保肝、抗腫瘤、祌經保護、心臟保護、 抗血栓、抗氧化等多種藥理作用；忍冬藤具有清熱解毒，疏風通絡的功效，臨床 用于抗病毒、抗炎解熱、抗腫瘤及提高機體免疫力;車前草具有淸熱利鉍通淋、 祛痰、涼血、解毒的功效，用于熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕池瀉、痰熱咳嗽、吐 血衄血、癰腫瘡毒。芒果苷、芍藥苷、馬錢苷、大車前苷分別為知母、赤芍、忍 冬藤和車前草中主要的活性成分。目前該制劑的現有標準只有相關鑒別項，較為

9、 簡單，為了更有效的控制本品的質量，本實驗采用薄層色譜法對方中知母、赤芍、忍冬藤和車前草進行定性鑒別，同時采用反向高效液和色譜法，建立熱痹清 顆粒中主要活性成分馬錢苷、芍藥苷的含量測定方法，為熱痹清的質量控制提供 科學依據。1.材料1.1儀器島津lc-20a高效液和色譜儀（日本島津）、lc solution色譜工作站;kq3200b 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；tlc scanner4薄層掃描儀（camag 瑞士卡瑪）；al104梅特勒-托利多電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公 司）；島津auw-120d電子天平（日本島津）。1.2試藥芒果苷（中國藥品生物制品檢定研宄所,批號：

10、111607-201503，98.4%）,芍藥 苷（中國藥品生物制品檢定研究所,批號：110736-201438, 96.4%）,馬錢苷 （中國藥品生物制品檢定研究所，批號：111640-201005, 99.2%）,大車前苷（中 國藥品生物制品檢定研究所，批號：111914-201102，85.9%），知母對照藥材 （中國藥品生物制品檢定研宄所，yj-121070）,忍冬藤對照藥材（中國藥品生物 制品檢定研宄所，yj-121069），甲醇、乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑 均為分析純。熱痹清顆粒（由武漢市中醫藥學基地制劑中心提供，批號 為:20160512、20160808、2017022

11、3,規格：10gx 10 袋/盒）2.方法與結果2. 1 tlc鑒別2.1.1知母鑒別15取本品粉末3 g,加稀乙醇10 m l,超聲（功率150 w,頻率40 k hz）處理20 min,過濾，濾液置水浴上蒸干，殘渣加稀乙醇1 m l使溶解，作為供試品溶液。取知母對照藥材1 g,同法制成對照藥材溶液。再取芒果苷對照品，加稀乙醇 制成每iml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典 2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述三種溶液各4 ul,分別點于同一聚酰 胺薄膜上，以乙醇-水（1:1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜屮，在與對

12、照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同 顏色的熒光斑點，陰性無干擾，結果見圖1。圖 1 知母的鑒別 fig 1 identification of anemarrhena 下載原圖2.1.2赤芍鑒別15取本品3g,研細，加乙醚50 m l,置水浴上加熱回流lh,濾過，藥渣加甲醇 50 m l,加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 m l使溶解，用水飽和 的正丁醇提取3次，每次20 m l，合并正丁醇液，用水洗滌3次，蒸干，殘渣 加甲醇lml使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每lm l含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四 部通則050

13、2)試驗，吸取上述兩種溶液各10此，分別點于同一硅膠g薄層板上， 以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8:1:2:0.04)為展開劑，展開，取出，晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色 譜相應的位置上，顯相同顏色的藍紫色斑點，陰性無干擾，結果見圖2。圖 2 赤勺的鑒別 fig 2 identification of radix paeoniae rubra 下載原 圖2. 1.3忍冬藤鑒別15取本品粉末1 g，加50%甲醇10 m l,超聲（功率150 w,頻率40 k hz）處理 30 min,濾過，濾液蒸干，殘渣加50%甲醇1 m l,作為供試品溶液。另

14、取忍冬 藤對照藥材1 g,同法制成對照藥材溶液。再取馬錢苷對照品，加50%甲醇制成 每1 m l含lmg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015 年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各10 pl、對照品溶 液5pl,分別點于同一硅膠g薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（65:35:10）10°c以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°c加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品 色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾，結果見圖3。圖 3 忍冬藤的鑒別 fig 3 identific

15、ation of cau 1 is lonicerae下載原圖2.1.4車前草鑒別15取本品粉末2 g,加甲醇10 m l，超聲（功率150 w,頻率40 k hz）處理30 min, 濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇iml使溶解，作為供試品溶液。另取大 車前苷對照品，加甲醇制成每1 m l含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層 色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各 10 ul,分別點于同一硅膠g薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水 （18:3:1.5:1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 rnn）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜和應的位

16、罝上，顯和同顏色的斑點，陰性無干 擾，結果見圖4。圖4車前草的鑒別fig. 4 identification of plantain 下載原圖2.2含量測定 2. 2.1色譜條件色譜柱:wondasil ci8 （4.6 mmx 250 mm, 5 pm）;柱溫：30°c ;流動相：乙腈（a） -0.2%磷酸（b）梯度洗脫（表1）;檢測波長:236 nm （cf25 min,馬錢苷）、230 nm （2535 min,茍藥苷）;流速:1.0 m l min;進樣量:10 u l。下載表 1 梯度洗脫順序 tab 1 gradient elution mode of mobile ph

17、ase 原表時間/min表 1 梯度洗脫順序 tab 1 gradient elution mode of mobile phase下載原表5772525352. 2.2溶液的制備2.2.2. 1混合對照品分別精密稱取馬錢苷、芍藥苷對照品1.2, 3. 19 mg,置10 m l量瓶中，加甲醇 超聲（功率150 w，頻率40 khz）溶解并稀釋至刻度，即得混合對照品溶液。2.2.2. 2供試品溶液的制備取熱痹清顆粒樣品lg，精密稱定，罝具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 m l， 超聲（功率150 w,頻率40 khz）提取20 min,放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣 用甲醇溶解，轉移至5 m

18、l量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 phi微孔濾膜 過濾，取續濾液，作為供試品溶液。2.2.2. 3陰性樣品溶液的制備按熱痹清顆粒生產工藝制備缺忍冬藤、赤芍的陰性制劑，并按供試品溶液制備方 法制備陰性供試品溶液。2. 2.3專屬性試驗精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜 條件進樣，記錄色譜圖。結果表明，供試品色譜中，在與對照品色譜相砬的出峰 時間出相同的峰，且陰性制劑對所測組分無干擾。（見圖5）102030 t/min2in圖 5 熱痹清顆粒 hplcfig 5 hplc chromatograms of rebiqing granule 下 載原圖

19、a.對照品;b.熱痹清顆粒樣品;c.缺忍冬藤陰性;d.缺赤芍陰性；1-馬錢苻;2-芍藥 什 a.reference product;b. rebiqing granules;c. negative sample without caul is loniccrac;d. negative sample without radix paconiac rubra;1-1oganin;2-paeoniflorin2.2.4線性關系的考察分別精密吸取“2.2.2. 1”項下混合對照品溶液2, 4, 8，12, 16, 20ul注入高 效液相色譜儀，在“2.2. 1”條件下測定峰面積。以進樣量（x，ug）

20、為橫坐標， 峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得馬錢苷和芍藥苷的回歸方差分別為 y=1479872. 40x+2963. 23 （r=0. 999 9） , y=1 178 698. 45x-79 483. 32 （r=0. 999 9）;線性范圍分別為0.2402. 400，0. 6386. 380 u g。2. 2.5精密度試驗精密吸取同一混合對照品溶液10 ul，按“2. 2.1”項不條件重復進樣6次，記 錄峰面積。按峰面積計算，結果馬錢苷、芍藥苷的rsd值分別為0.78%、1.20% （n=6）,表明儀器精密度良好。2.2.6重復性試驗取同一批號的熱痹清顆粒樣品6份（批號:20170

21、223）,按“2. 2. 2. 2”項下方法 平行制備6份供試品溶液，各吸取10ul進樣，記錄峰面積，結果馬錢苷、芍藥 苷的rsd值分別為2. 00%、2. 06% （n=6），表明本方法重復性良好。2. 2.7穩定性試驗取同一供試品（批號:20170223）溶液，按“2.2.1”項下條件分別在0, 2, 4, 6 8, 24 h進行測定，記錄峰面積，結果馬錢苷、芍藥苷的rsd值分別為1.68%、 0.65% （n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。2.2.8加樣回收率試驗稱取同一批號供試品（批號20170223） 6份，每份約0. 5 g,精密稱定，分別加 入馬錢苷、芍藥苷對照品適量，按

22、“2. 2. 2. 2”項下方法制備供試品溶液，按 “2.2. 1”項下色譜條件進行測定，計算冋收率。馬錢苷和芍藥苷的平均加樣冋 收率分別為100. 04%、98.35%，rsd分別為1.46, 1.64 06），本方法回收率 良好。結果見表23。表2馬錢苷加樣回收率試騎結果tab 2 spiked recovery rate of 1 ogan in下載原表0. 5131i 1 hh j1-1王/ r 亡282. 87228.60. 5169284. 97227.60. 5084280. 28280. 30. 5086280. 39280.60. 5686313.47376. 10. 567

23、6312.89375.9表3茍藥苷加樣回收率實驗結果tab 3 spiked recovery rate ofpaeon i florin下載原表稱樣量/g樣品芍藥苷含量/ug加入量/0. 5131883. 17708. 70. 5169889. 71709.60. 5084875. 16876.00. 5086875. 51875.60. 5686978.791176j0. 5676976. 981173.2.2.9樣品測定取3批樣品（批號為:20160512、20160808、20170223),每批 3 份，按“2. 2. 2. 2”項下方法制備供試品溶液，按“2. 2. 1”項下色譜條

24、件進行測定，記錄峰面積，測定含量。結果見表4表 4 樣品含量測定(n=3) tab 4 content determination of samples (n=3)下載原表批號馬錢苷/mg *201605120. 370201608080. 550'201702230. 551；3討論3.1屮藥復方制劑化學成分復雜，采用色譜法對其質量進行控制干擾因素較多。 本實驗采用薄層色譜法對熱痹清顆粒中知母、赤芍、忍冬藤、車前草進行了定性 鑒別，其結果分離度較好，專屬性強。同時本實驗通過高效液和色譜法建立了熱 痹清顆粒中馬錢苷、芍藥苷的含量測定方法，經過方法學考察和含量測定，該方 法準確、可靠，操

25、作簡單，專屬性強，可作為熱痹清顆粒中馬錢昔、芍藥苷的含 量測定方法。3.2結合紫外吸收光譜閣以及中國藥典2015年版中記錄的檢測波長，忍冬藤 中馬錢苷的含量測定檢測波長為236 nm，赤芍中芍藥苷的檢測波長為230 nm， 利用二極管陣列檢測器波長切換的功能，結合這兩種成分的出峰保留時間和最 大吸收波長，設定025 nrin檢測波長為236 rnn測定馬錢苷，2535 min檢測波 長為230 測定芍藥苷，在此條件下兩種對照品溶液及供試品溶液均有較好的 吸收。3. 3本實驗曾以甲醇-0.05 mol l磷酸二氫鉀溶液15、乙腈-0. 01%甲酸16、 乙腈-0. 05%磷酸17、乙腈-0. 2

26、%磷酸進行流動相考察，結果甲醇-0.05 mol - l 磷酸二氫鉀溶液、乙腈-0. 01%甲酸為流動相洗脫吋，供試品中各色譜峰分離度較 低，采用乙腈-0.05%磷酸為流動相時，色譜峰分離度有所提高，但是拖尾明顯， 在詳細考察了熱痹清顆粒中九種中藥的主成份、樣品處理方法、液相條件及含量 后設定乙腈-0.2%磷酸為流動相，色譜峰的拖尾現象明顯好轉，故最終采用乙腈 -0. 2%磷酸系統作為流動相。綜上所述，本實驗采用薄層色譜法和高效液相色譜法對熱痹清顆粒分別進行了 定性和定量鑒別，本方法專屬性強，結果準確，可用于熱痹清顆粒的質量控制， 為臨床安全科學用藥提供了指導。參考文獻1 sun xinghu

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