1、 烏雞和家雞的血清成分分析作者：葉子琦 指導老師：吳明江 學號：11112314134（溫州大學生命與環境學院 11生本）【摘要】：實驗通過鄰苯二甲醛法測定血清總膽固醇的含量進行定量測定，通過鹽析、透析、醋酸纖維素薄膜電泳法將血清清蛋白與-球蛋白進行分離與鑒定，可知血清中有清蛋白、1、2、五種蛋白質，同時我們還對血清中的谷丙轉氨酶活性進行鑒定及其活力單位的測定。【關鍵詞】：血清 膽固醇 清蛋白與-球蛋白 谷丙轉氨酶 生化分析Black-bone chicken and chicken serum component analysisAuthor: Ye Ziqi Instructs teach

2、er: Wu Mingjiang Student ID:11112314134（School of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University） 【Abstract】: The experiment carries on the quantitative determination through the neighbouring phenyl dimethanal law determination blood serum total cholesterol to the cholesterol content, through t

3、he salting out, the dialysis acetyl cellulose thin film electrophoresis carries on the blood serum albumen with gamma - the globulin the separation and the appraisal, may know in the blood serum to have the albumen, 1, 2, beta, gamma five kind of protein, simultaneously we also carry on the appraisa

4、l and the vigor unit's determination to in the blood serum valley third transaminase activeness. 【Key words】 ：Blood serum cholesterol albumen and gamma - globulin valley third transaminase biochemistry analysis【前言】：血清，指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白已被除去的血漿。其主要作用是提供基本營養物質、提供激素和各種生長因子、提供結合蛋白、提供

5、促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養中的細胞起到某些保護作用。血清清蛋白與-球蛋白是血清的重要成分，通過實驗掌握鹽析法分離提純蛋白質的原理和方法；掌握透析法脫鹽與蛋白質濃縮的方法； 掌握凝膠過濾層析的技術方法；掌握利用醋酸纖維素薄膜電泳法分離與鑒定血清清蛋白的原理和方法。谷丙轉氨酶是肝功能檢查項目中一項比較靈敏的指標，實驗用紙層折法觀察肝臟谷丙轉氨酶（ALT）的轉氨基作用；用分光光度法測定血清谷丙轉氨酶的活力。膽固醇廣泛存在于動物體內，尤以腦及神經組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量也高。其溶解性與脂肪類似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶劑。膽固醇是動物組織細胞所不可缺少的

6、重要物質，它不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸，維生素D以及甾體激素的原料。血清膽固醇是測定血脂的常規項目，試驗用鄰苯二甲醛法測定血清總膽固醇，來比較家雞與烏雞血清的區別。1、 實際材料、試劑和器材（一）材料分析烏雞血清、家雞血清、動物肝臟（二）試劑1、 血清膽固醇的定量測定（鄰苯二甲醛法）（1）鄰苯二甲醛試劑：稱取鄰苯二甲醛（A.R.）50mg，以無水乙醇（A.R.）溶解并稀釋到50mL，冷藏，有效期1個半月。（2）90%醋酸（3）標準膽固醇應用液（0.1mg/mL）（4）混合酸：取 試劑2加等體積濃硫酸混勻即成。 （5）標準膽固醇貯液（1mg/mL）：準確稱取膽固醇（A. R.）100m

7、g以醋酸定容至100mL。2、血清清蛋白與-球蛋白的分離與鑒定（1）血清 （2）PBS（3）（NH4）2SO4溶液 （4）雙縮脲試劑（5）酪蛋白（6）蔗糖（7）BaCl2溶液3、凝膠層析（1）Sephandex 4B 凝膠（2）生理鹽水（3）5%重鉻酸鉀（4）5%藍葡聚糖4、谷丙轉氨酶活性的鑒定及活力單位的測定（1）0.9% NaCl溶液 (2)海砂 （3）1% 谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和） （4）1% 丙酮酸鈉溶液（用1%KOH溶液中和） （5）0.1% KHCO3溶液 （6）0.025% 溴乙酸溶液（用1%KOH中和） （7）2% 乙酸溶液 （8） 、苯酚的飽和水溶液：將2份酚和2份水

8、（按重量計算）混合后，放入分液 漏斗中，振蕩。靜止24h后分層，將下部酚層放入瓶中備用。新配制的酚展層劑可以反復使用1周。 （9）0.1% 水合茚三酮的正丁醇溶液 (10)0.1% 標準谷氨酸溶液 (11)0.1% 標準丙氨酸溶液 (12)1% KOH溶液 （9） （13）1/15 mol/L pH=7.4的磷酸緩沖液:取1/15 mol/L磷酸氫二鈉（稱取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO4·12H2O23.87g，溶于蒸餾水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L磷酸二氫鉀（稱取KH2PO4 9.078g溶于蒸餾水中定容1000mL）175mL混合。（14）G

9、PT基質液（谷丙轉氨酶底物）:取分析純-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78g置于小燒杯內，加入1mol/LNaOH溶液約10mL，使其完全溶解，并用1mol/LNaOH溶液或1mol/L鹽酸調整pH至7.4，加磷酸緩沖液定容至100mL。可加氯仿數滴防腐。此溶液每毫升含-酮戊二酸2.0微摩爾，丙氨酸200微摩爾。在冰箱內可保存一周。（14）1mmol/L 2，4-二硝基苯肼:在200mL錐形瓶內放入分析純2，4-二硝基苯肼19.8mg，加100mL 1mol/L鹽酸。把錐形瓶放在暗處并不時搖動，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，濾入棕色瓶中，置冰箱內保存。緩沖液溶解后定容至100mL。臨

10、用前配制。（16）0.4mol/LNaOH溶液（3） 器材離心機、移液管、透析袋、試管、吸管、容量瓶、燒杯、電子分析天平、分光光度計、鐵架臺、凝膠柱（10×1.0cm）、玻璃棒 膠頭吸管、吹風機、培養皿、濾紙、剪刀、恒溫水浴鍋、量筒。二、實驗方法與方案設計實驗一 血清膽固醇的定量測定（鄰苯二甲醛法）1、標準曲線的繪制取清潔干燥試管5支，編號，按表2加入試劑。表2 鄰苯二甲醛法測定血清總膽固醇標準曲線的繪制編號試劑編號編號編號編號編號01234標準膽固醇應用液/mL00.10.20.30.4醋酸/mL0.40.30.20.10鄰苯二甲醛試劑/mL0.20.20.20.20.2蒸餾水/m

11、L0.010.010.010.010.01混合酸/mL4.04.04.04.04.0100mL血清中總膽固醇含量/mg0100200300400A550nm加畢，混勻，靜置10min，以550nm波長比色測定，以吸光度值為縱坐標，膽固醇含量為橫坐標，做標準曲線。2、樣品的測定取3支清潔干燥試管，編號后，按表3加入試劑。表3 鄰苯二甲醛法測定血清總膽固醇樣品的測定試管試劑對照樣品1樣品2醋酸/mL0.40.40.4血清/mL0.010.010.01鄰苯二甲醛試劑/mL00.20.2無水乙醇/mL0.200混合酸/mL*4.04.04.0*硫酸含量的高低對顯色有影響，故混合酸的配制和測定過程中的加

12、量都應準確。顯色時要避免高溫，采用混合酸液反應時溫度不會升得太高，一般在432時，顏色能穩定2h。加畢，混勻，靜置10min，于550nm波長比色，以對照管校零點，對照標準曲線即知100mL樣品中總膽固醇含量（mg）。實驗二 血清清蛋白與-球蛋白的分離與鑒定（一）血清清蛋白與-球蛋白的鹽析實驗步驟血清清蛋白與-球蛋白的鹽析實驗步驟取離心管一支，加入2mL血清加入2mLPBS（稀釋血清），搖勻逐滴加入pH=7.2的（NH4）2SO4溶液2mL，邊加邊搖靜止30min，離心20min（v=3000rpm）上清液（主要含有清蛋白）沉淀（主要含有-球蛋白）加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液飽

13、和加1mLPBS溶解靜止30min逐滴加入飽和（NH4）2SO4溶液0.5mL（相當于33%飽和（NH4）2SO4溶液）離心、沉淀加1mLPBS溶解沉淀放置30min放入透析袋離心20min（v=3000rpm）*放棄離心后的上清液（主要是、球蛋白），沉淀即為初步純化的-球蛋白（二） 蛋白質透析與濃縮的實驗步驟1. 取玻璃紙（15cm×15cm）兩張，折成袋狀。將前面第一次鹽析得到的含有清蛋白的上清液和-球蛋白分別倒入兩個透析袋中，用線繩系緊上口。2. 用玻璃棒懸掛在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯中，使透析袋下半部浸入水中，流水透析1h。 3. 將兩透析袋取出，埋入蔗糖中濃縮。【三】

14、 凝膠層析的實驗步驟凝膠層析的實驗步驟過程名稱實驗步驟凝膠預處理8g葡萄糖膠G-25放入100mL燒杯中100mL蒸餾水小火煮沸1h靜止、冷卻、傾棄蒸餾水加入PBS10mL輕輕攪拌至凝膠懸起傾入10cm×1.0cm層析柱裝柱    將全部凝膠都傾入柱內，且液面接近凝膠面時，用螺旋夾將橡膠管夾緊，然后小心放松螺旋夾，使液體緩慢流出，到液體剛好流入凝膠面時，將螺旋夾再夾緊，裝柱工作完成。加樣    用膠頭吸管將柱中上方清液吸出，加入重鉻酸鉀和藍葡聚糖混合溶液，用膠塞封住上口。洗脫    用生理鹽水洗

15、脫液進行洗脫。打開螺旋夾，使液體的流速達到67dpm（實際1015 dpm）。收集混合液在凝膠柱中分離，藍色的藍葡聚糖在下方，黃色的重鉻酸鉀在上方。用試管收集流出藍、黃色液體，比色并畫出洗脫曲線。（三） 醋酸纖維素薄膜電泳的實驗步驟醋酸纖維素薄膜電泳實驗步驟浸泡    將醋酸纖維素薄膜在緩沖溶液中浸泡20min，取出識別光面和粗糙面。點樣    用鑷子將薄膜置于濾紙上，吸收多余的液體，用鉛筆在薄膜粗糙面一端2cm處畫一細線，利用蓋玻片一側蘸取樣品，于細線處點樣。電泳    將薄膜粗糙面朝下，平懸于電泳槽支

16、架的濾紙橋上，點樣一端靠近負極；使U=160V，電泳45min。染色    將薄膜取出后，置于氨基黑10B染色劑重，染色10min。漂洗及透明    將薄膜取出，移至漂洗液中漂洗若干次，至背景無色后置于玻板上，用濾紙去除多余液體后滴加透明液透明，烘干。實驗三 谷丙轉氨酶活性的鑒定及活力單位的測定（一）谷丙轉氨酶提取液制備谷丙轉氨酶提取液制備方法2g肝臟 + 0.9% NaCl 6mL + 海砂200mg在低溫下，研磨成漿用脫脂棉（或雙層紗布）過濾，得提取液（濾液不清）（二）轉氨作用試    劑對照管測試管

17、 1測試管 20.1moL/L谷氨酸0.500.500.500.1moL/L丙酮酸鈉0.500.500.500.1% KHCO30.500.500.500.025% 溴乙酸0.250.250.25煮沸的酶液0.50酶液0.500.50加脫脂棉塞，45水浴，1.5h，時時振蕩內容物2% 乙酸6滴6滴6滴沸水浴2min，使蛋白質完全沉下，過濾，作層析（三）紙層析1、方法紙層析方法取圓形層析濾紙1張，在圓心處用圓規繪出直徑為3cm的同心圓通過中心將濾紙繪成五等分扇形，用毛細管點樣24次（直徑不超過2mm）在濾紙的圓心上剪一小孔，直徑約12mm取一小濾紙條，將下端剪成刷狀，再卷成燈芯插入圓形小孔，不能

18、使燈芯突出紙面將圓形濾紙平放在盛有層析液（水飽和酚）培養皿上，使燈芯向下與溶劑接觸用大小相同的培養皿蓋在濾紙上溶劑通過燈芯上升到濾紙上向四周展層，直到溶劑前沿移至距濾紙邊緣約1cm處時停止（展層時間為1h）80100烘箱干燥，噴灑水合茚三酮的正丁醇溶液，80100顯色四、血清谷丙轉氨酶活力單位測定1、標準曲線的繪制試     劑試管號012345丙酮酸鈉標準液（mL）0.050.100.150.200.25GPT基質液（mL）0.500.450.400.350.300.25pH7.4磷酸緩沖液（mL）0.100.100.100.100.100.10充分搖

19、勻后，置于37水浴，保溫10min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.500.500.500.500.50充分搖勻后，置于37水浴，保溫20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.005.005.005.005.00充分搖勻，室溫靜置10min后，以0號管為空白，520nm波長下比色A520nm值各管所含丙酮酸量（mol）0.100.200.300.400.50各管相當于酶的單位數100200300400500以酶的活力單位數為橫坐標，以光吸收值為縱坐標，繪制A520nm與對應的酶活力單位數的標準曲線。注：（1）丙酮酸鈉標準液mL數×摩爾濃度（2mol/mL）（2） GP

20、T活力單位為：每mL血清在37與pH=7.4的基質液作用60min，生成1mol丙酮酸為一個單位（U）。本實驗（臨床檢驗）取血清量為0.1mL，報告數據以100mL血清計算，因此將實際測得結果×1000即可。2、酶活力的測定試         劑測定管測定管對照管120GPT基質液（mL）0.500.500.5037水浴，預溫10min血清（mL）0.100.10充分搖勻后，置于37水浴，保溫30min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.500.50血清（mL）0.100.4mol/L NaOH（mL）

21、5.005.005.00搖勻后，室溫靜置10分鐘，520nm波長下比色A520nm值  查標準曲線的對應值，得100mL血清中谷丙轉氨酶的活力單位數【實驗結果】1、鄰苯二甲醛法測定血清總膽固醇標準曲線的繪制以550nm波長比色測定，以吸光度值為縱坐標，膽固醇含量為橫坐標，做標準曲線，如圖所示： 圖1 鄰苯二甲醛法測定血清總膽固醇的標準曲線材料 項目100mL血清中總膽固醇含量/mg家雞40烏雞30 表12、 血清清蛋白與-球蛋白的分離與鑒定（1）凝膠層析的實驗結果：圖二：凝膠層析的結果（2）血清清蛋白與-球蛋白的鑒定：圖三：醋酸纖維素薄膜電泳結果3、谷丙轉氨酶活性的鑒定及活

22、力單位的測定（1）、血清谷丙轉氨酶活力單位數標準曲線的繪制以酶的活力單位數為橫坐標，以光吸收值為縱坐標，繪制A520nm與對應的酶活力單位數的標準曲線，如下圖所示： 圖四 根據標準曲線得：材料 項目100mL血清中谷丙轉氨酶的活力單位數家雞33880烏雞43040 表2（2）谷丙轉氨酶活性的鑒定圖五：谷丙轉氨酶活性的鑒定結果（紙層析法）【結果分析與討論】1、實驗一測定血清膽固醇的含量時，所用的方法是鄰苯二甲醛法，所測得的數據相比偏小，可能存在如下幾個原因： （1）、在實驗操作過程當中，試劑的添加可能出現誤差，從而導致實驗結果的改變。例如：硫酸含量的高低對顯色有影響，故混合酸的配制和測定過程中的

23、加量都應正確。（2）、測量血清膽固醇的方法不同也可能會導致實驗結果出現差異。根據查閱資料后的結果分析，還可用酶法和硫磷鐵法測量血清膽固醇。2、血清清蛋白與球蛋白的分離與鑒定過程中需要注意的幾點： （1）凝膠層析 這里主要是要注意在向柱中加入重絡酸鉀和藍葡聚糖混合溶液時，不要觸碰到凝膠面，避免凝膠面的破損。 樣品在通過層析柱時，因為分子量較大的物質因為不能或較難通過網孔而進入凝膠顆粒，而是沿著凝膠顆粒間的間隙流動，所以流程較短，最先流出層析柱，反之，分子量較小，流程較大，流出較晚 裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝的均勻，務必做到凝膠懸液或DEAE纖維素混懸液不稀不厚，一般濃度為1:1，進樣及洗脫時切勿是床面暴露在空氣中，否則柱床會出現氣泡或分層現象；加樣時必須均勻。切勿攪動床面，否則會影響分離效果。（2）醋酸纖維素薄膜電泳 在做醋酸纖維素薄膜電泳的實驗時，將薄膜經染色之后，錯誤的先向玻璃皿中添加了透明液，從而導致薄膜迅速軟化，以至于無法取出并烘干，造成薄膜破損。從這次操作失誤當中我們應該吸取教訓，在今后的實驗過程當中，不管是進行什么步驟，都應該先確定整個