1、項目三 工業(yè)微生物培養(yǎng)與檢測技術(shù)v 細胞總數(shù)測量（直接計數(shù)法） v 活菌數(shù)測量（間接計數(shù)法） v 細胞生物量測量一、微生物生長的測定1.顯微鏡直接計數(shù) 是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。血球計數(shù)板：菌體較大的酵母菌或霉菌孢子細菌計數(shù)板：一般細菌用途：適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液的計數(shù)缺點：不易區(qū)分顆粒、死菌體和雜菌。細胞總數(shù)測量細胞總數(shù)測量v常用計數(shù)器有血球計數(shù)板(血細胞計數(shù)板)、petroff-hauser計菌器以及hawksley計菌器等。v各種計數(shù)板的計數(shù)原理相同，只是血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡觀

2、察，只能計數(shù)較大的霉菌孢子和酵母菌；v后兩種細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察，可以直接計數(shù)細菌。常用計菌器 血球計數(shù)板 petroff-hauser計菌器hawksleyhawksley計菌器計菌器（1）血球計數(shù)板法 原理：特制的厚玻片，有四條槽和兩條嵴，中央有一短橫槽和兩個平臺，兩嵴的表面比兩個平臺的表面高0.1mm。每個平臺有不同規(guī)格的網(wǎng)格，每個方格網(wǎng)分為9個大方格，中央大方格1mm2面積上面積上可有400個小格，即為計數(shù)室。計數(shù)在計數(shù)室中進行。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成

3、25個小方格。無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(1/10000毫升)。v使用血球計數(shù)板計數(shù)時，通常數(shù)5個中方格的總菌數(shù)a，然后求每個中方格的平均值，再乘上大方格（計數(shù)室）中方格的數(shù)量，就得出一個大方格中的總菌數(shù)。再換算成每毫升菌液中微生物細胞的數(shù)量。v計算：1ml菌液中總菌數(shù)=a/5*25*104*b=50000*a*b1ml菌液中總菌數(shù)=a/5*16*104*b=32000*a*b其中b為稀釋倍數(shù)。計數(shù)方法 適用范圍：細胞個體形態(tài)較大的單細胞（酵母、血細

4、胞等） 特點：快速，準確，對酵母菌可同時測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍可以區(qū)分死活細胞。 petroff-hauser計菌器hawksleyhawksley計菌器計菌器細菌計數(shù)板 （2）涂片染色法（適于細菌計數(shù)）應(yīng)用：可同時計數(shù)不同微生物的菌數(shù)， 適于土壤、牛奶中細菌計數(shù)。 方法：用鏡臺測微尺計算出視野面積；取0.01ml菌液涂于1cm2面積上，計數(shù)后代入公式： 視野中平均菌數(shù)每ml原菌液含菌數(shù)= 涂布面積100稀釋倍數(shù) 視野面積2.電子計數(shù)器計數(shù)法 工作原理是測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過一個細胞，當一個細胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄裝置上。

5、該法測定結(jié)果較準確，但它只識別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。不適于微生物肥料產(chǎn)品的檢測。原理：在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度（od值）成正比，菌數(shù)越多，光密度越大，但與透光度成反比。優(yōu)缺點：簡便 菌懸液顏色不宜太深，不能混雜其他雜質(zhì)。3.比濁法在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(optical density, 即o.d.)表示菌量。實驗測量時應(yīng)控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確：l 合適波長；l 適宜菌液濃度；分光光度計法1、平板計數(shù)法活細胞在培養(yǎng)基中能形成菌落，菌落數(shù)就是活菌數(shù)。以菌落形成單位cfu(co

6、lony forming units)表示。活菌數(shù)測量 制作培養(yǎng)基并對培養(yǎng)基滅菌 配制樣品稀釋液 接種（兩種方法） 涂布平板法：倒平板 接種0.1ml 涂布 混合平板法：接種1ml 混勻 培養(yǎng)：室溫下培養(yǎng)形成單菌落 查菌落數(shù)并計算 菌落數(shù)菌體數(shù)/ml= 菌液稀釋倍數(shù) 接種量倒平板培養(yǎng)基溫度4525g/ml 樣品樣品225ml無無菌生理鹽水菌生理鹽水每管每管9ml無無菌生理鹽水菌生理鹽水瓊脂培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基每皿每皿15ml-2-3-4-5-6-6-6-61ml1ml1ml1ml1ml1ml-5-5-51ml-4-4-41ml混合平板培養(yǎng)法混合平板培養(yǎng)法-1技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（1

7、5-20min完成操作），嚴格無菌操作；注意事項：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養(yǎng)基溫度；適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物，誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當操作。平板菌落計數(shù)法x 5x 5x 5x 52、最大或然數(shù)法測數(shù)（mpn）如某一細菌在稀釋法中的生長情況如下；稀釋度10-310-410-510-6 10-7 10-8重復(fù)數(shù)555555出現(xiàn)生長的管數(shù)555410根據(jù)以上結(jié)果，在接種10-310-5稀釋液的試管中5個重復(fù)都有生長，在接種10-6稀釋液的試管中有4個重復(fù)生長，在接種10-7稀釋液

8、的試管中只有1個生長，而接種10-8稀釋液的試管全無生長。由此可得出其數(shù)量指標為“541”，查最大或然數(shù)表得近似值17，然后乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)（10-5的稀釋倍數(shù)為100000）。那么，1ml原菌液中的活菌數(shù)17100000=17105。即每毫升原菌液含活菌數(shù)為l700000個。 本法特別適合于測定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化細菌等）的數(shù)量和檢測污水、牛奶及其他食品中特殊微生物類群（如大腸菌群）的數(shù)量。 缺點是只適于進行特殊生理類群的測定，結(jié)果也較粗放，只有在因某種原因不能使用平板計數(shù)時才采用。測定在一個混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢，但具有某種特殊

9、生理功能的類群。硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜測定空氣、水等含菌量低的樣品當中的活菌數(shù)3、濃縮法（濾膜法）1、稱重法適用于絲狀微生物生長量的測定適用于含菌量高，不含或少含顆粒性雜質(zhì)的樣品 將微生物培養(yǎng)液過濾或離心，收集菌體，洗凈后稱重，即為濕重，若在100-105烘干至恒重，稱重即為干重。細胞生物量測量2、dna含量測定法每個細菌細胞約含dna 8.4x10-5 ng3、atp含量測定法微生物細胞中的atp含量恒定4、代謝活性法 物質(zhì)的消耗 產(chǎn)生量 對氧的吸收 發(fā)酵糖產(chǎn)酸量 二氧化碳的釋放量等細胞生物量測量顯微鏡直接計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法（不辨死活）（不辨死活）平板菌落計數(shù)法（形成菌落的微生物）平板

10、菌落計數(shù)法（形成菌落的微生物） 光電比濁法光電比濁法（不用于顏色太深的樣品）（不用于顏色太深的樣品）測定細胞重量法（測定絲狀真菌生長量）測定細胞重量法（測定絲狀真菌生長量）測定細胞生物量（適于濃度較高的樣品）測定細胞生物量（適于濃度較高的樣品）。v微生物的生長通常以群體的生長作為指標。群體生長表現(xiàn)為細胞數(shù)目的增加微生物的生長通常以群體的生長作為指標。群體生長表現(xiàn)為細胞數(shù)目的增加或者細胞物質(zhì)的增加。或者細胞物質(zhì)的增加。v測定微生物數(shù)量的主要方法：測定微生物數(shù)量的主要方法：同步培養(yǎng)：同步培養(yǎng)：能使培養(yǎng)物中所有微生物細胞都處于相同的生長階段的培養(yǎng)方法。二、微生物的同步生長二、微生物的同步生長同步培養(yǎng)

11、物用途：l來研究在單個細胞上難以研究的生理與遺傳特性；l作為工業(yè)發(fā)酵的種子。 細胞同步生長細胞同步生長細胞非同步生長細胞非同步生長同步生長：同步生長：在培養(yǎng)物中所有的微生物細胞都處于同一生長階段。同步培養(yǎng)方法 誘導(dǎo)法溫度溫度培養(yǎng)基成份控制培養(yǎng)基成份控制光照和黑暗交替培養(yǎng)光照和黑暗交替培養(yǎng)獲得同步生長的方法主要有兩類： 環(huán)境條件誘導(dǎo)法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等，造成與正常細胞周期不同的周期變化。 選擇法：選擇性過濾、梯度離心。物理方法，隨機選擇，不影響細胞代謝。選擇法離心方法離心方法過濾分離法過濾分離法硝酸纖維素濾膜法硝酸纖維素濾膜法原理：一些細菌細胞會緊緊吸附于硝酸纖維微孔濾膜上。步驟：菌懸液

12、通過微孔濾膜，細胞吸附其上；反置濾膜，以新鮮培養(yǎng)液通過濾膜，洗掉浮游細胞；除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來的新生細胞，即為同步培養(yǎng)。同步生長的時間，因菌種和條件而變化，由于同步群體的個體差異，同步生長不能無限地維持，往往會逐漸破壞，最多能維持2-3個世代，又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機生長，即非同步化三、單細胞微生物的生長曲線生長曲線：細菌接種到定量的液體培養(yǎng)基中，定時取樣測定細胞數(shù)量，以培養(yǎng)時間為橫座標，以細菌數(shù)目為縱座標作圖，得到的反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。在微生物學(xué)中提到的“生長”，指群體生長。細菌的生長曲線一般用菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標作圖一條典型的生長曲線可以分為四個時期： 遲緩期

13、、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期（一） 遲緩期將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加或增加很少，生長速度接近于零，也稱延遲期、適應(yīng)期。遲緩期的特點：u生長速度接近于零；u細胞形態(tài)變大或增長，例如巨大芽孢桿菌，在遲緩期末，細胞的平均長度比剛接種時長6倍。一般來說處于遲緩期的細菌細胞體積最大；u細胞內(nèi)rna（尤其是rrna）含量增高，合成代謝活躍，核糖體、 酶類和atp的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶；u對外界不良條件反應(yīng)敏感。分裂遲緩、代謝活躍遲緩期出現(xiàn)的原因：微生物接種到一個新的環(huán)境，短時間內(nèi)缺乏分解和催化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一

14、段適應(yīng)期。調(diào)整代謝v在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；v在食品工業(yè)上，盡量在此期進行消毒或滅菌.對實踐的指導(dǎo)意義：.縮短延遲期的措施：選用繁殖快的菌種菌齡：采用對數(shù)生長期的健壯菌種；增加接種量；（群體優(yōu)勢-適應(yīng)性增強）接種前后的培養(yǎng)基組分相差不要太大，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。（二）對數(shù)期又稱指數(shù)生長期(exponentialphase)，緊接著延滯期的一段細胞數(shù)以幾何級數(shù)增長的時期。三個重要參數(shù)：三個重要參數(shù)：繁殖代數(shù)（n）代時（g）生長速率常數(shù)（r）.特點:生長速度常數(shù)r最大細胞進行平衡生長，細胞大小、形態(tài)、生理特征一致酶系活躍，代謝旺盛活菌數(shù)和總菌數(shù)接近。 t t0 = g n

15、細菌細胞分裂繁殖一代所需細菌細胞分裂繁殖一代所需的時間為的時間為代時代時(generation time)，用，用g表示。表示。生長速率常數(shù)（生長速率常數(shù)（r）=1/g影響微生物代時長短的因素：u菌種：不同的微生物及微生物的不同菌株代時不同； u營養(yǎng)成分：在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長代時短；u營養(yǎng)物濃度：一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比；u溫度：在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)。2.應(yīng)用意義：由于此時期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡；發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；是生理代謝及遺傳研究或進行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。（三）穩(wěn)定期（三）穩(wěn)定期

16、又稱恒定期或最高生長期，此時培養(yǎng)液中活細菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。1.穩(wěn)定期的特點：總菌數(shù)達到最大值，菌體含量最高； 代謝活力鈍化，細胞生長變得不平衡。 積累貯存物質(zhì)，如糖原、異染粒等；也是積累代謝產(chǎn)物的重要階段，某些抗生素的大量形成也在此時期；芽孢桿菌在此階段形成芽孢。穩(wěn)定期到來的原因：l 營養(yǎng)物質(zhì)消耗；l 營養(yǎng)物的比例失調(diào)（如c/n比值不合適）；l ph、氧化還原電勢等環(huán)境變化；l 有害代謝產(chǎn)物積累（如酸、醇、毒素、h2o2等）。2.應(yīng)用意義：1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時期（抗生素等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長此期，提高產(chǎn)量，措施如下： 補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料） 調(diào)ph 調(diào)整溫度 2）穩(wěn)定期細胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達

17、到最高。（四）衰亡期（四）衰亡期營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細菌死亡速率超過新生速率，整個群體呈現(xiàn)出負增長。1.衰亡期的特點：細菌衰老并出現(xiàn)自溶；產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等。菌體形態(tài)出現(xiàn)改變，有時產(chǎn)生畸形，細胞大小懸殊，有些革蘭氏染色反應(yīng)陽性菌此時會變成陰性反應(yīng)。芽孢桿菌開始釋放芽孢。.產(chǎn)生原因：生長條件的進一步惡化，使細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡。.意義：微生物在衰亡期活力下降，積累的代謝毒物會影響某些代謝物的提純，所以應(yīng)該掌握時間，及時收取產(chǎn)物。 1.微生物在對數(shù)生長期生長速率最快；2.營養(yǎng)物的消耗，代謝產(chǎn)物的積累，以及因此引

18、起培養(yǎng)條件的變化，是限制培養(yǎng)液中微生物快速增殖的主要原因；3.用生活力旺盛的對數(shù)生長期細胞接種，可以縮短延遲期，加速進入對數(shù)期；4. 補充營養(yǎng)物，調(diào)節(jié)因生長而改變了的ph、氧化還原電勢，排除培養(yǎng)環(huán)境中的有害代謝產(chǎn)物，可以延長對數(shù)生長期，提高菌體濃度與有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；5. 對數(shù)期以菌體生長為主，穩(wěn)定期以代謝產(chǎn)物合成與積累為主。生長曲線用于指導(dǎo)發(fā)酵工程中工藝條件的優(yōu)化溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在：溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在：影響酶活性，溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響酶活性，溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響細胞合成。影響細胞合成。影響細胞膜的流動性，進而，溫度變化影響營養(yǎng)影響細胞膜的流動

19、性，進而，溫度變化影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。影響物質(zhì)的溶解度，對生長有影響。影響物質(zhì)的溶解度，對生長有影響。一、溫度對微生物生長的影響一、溫度對微生物生長的影響（一）微生物生長的三個溫度基點（一）微生物生長的三個溫度基點最低生長溫度：最低生長溫度：微生物生長的最低溫度下限；微生物生長的最低溫度下限；超過最超過最低生長溫度時，微生物不生長，溫度過低，甚至低生長溫度時，微生物不生長，溫度過低，甚至?xí)劳觥劳觥Ｗ钸m生長溫度：最適生長溫度：微生物生長最快時的溫度微生物生長最快時的溫度，處于最適處于最適生長溫度時，生長速度最快，代時最短。生長溫度時，生長速度最快

20、，代時最短。最高生長溫度：最高生長溫度：微生物生長的最高溫微生物生長的最高溫度；度；超過最高生長溫度時，微生物超過最高生長溫度時，微生物不生長，溫度過高，甚至?xí)劳觥２簧L，溫度過高，甚至?xí)劳觥?生長速度溫度停此生長致死最低最高最適根據(jù)微生物的最適生長溫度的不同，可將微生物劃為三個類型：根據(jù)微生物的最適生長溫度的不同，可將微生物劃為三個類型：（二）微生物生長溫度類型（二）微生物生長溫度類型v低溫型微生物（嗜冷微生物）低溫型微生物（嗜冷微生物）v中溫型微生物（嗜溫微生物）中溫型微生物（嗜溫微生物）v高溫型微生物（嗜熱微生物）高溫型微生物（嗜熱微生物）1.低溫型微生物低溫型微生物:最適生長溫度在

21、最適生長溫度在520,520,主要分布在地球的兩極、冷主要分布在地球的兩極、冷泉、深海、冷凍場所及冷藏食品中。泉、深海、冷凍場所及冷藏食品中。例：假單孢菌中的某些嗜冷菌在低溫下生長，常引起例：假單孢菌中的某些嗜冷菌在低溫下生長，常引起冷藏食品的腐敗。冷藏食品的腐敗。嗜冷微生物在低溫下生長的機理，嗜冷微生物在低溫下生長的機理，據(jù)推測有兩種原因：據(jù)推測有兩種原因：它們體內(nèi)的酶能在低溫下有效地催化，在高溫下酶它們體內(nèi)的酶能在低溫下有效地催化，在高溫下酶活喪失活喪失細胞膜中的不飽和脂肪酸含量高，低溫下也能保持細胞膜中的不飽和脂肪酸含量高，低溫下也能保持半流動狀態(tài)，可以進行物質(zhì)的傳遞。半流動狀態(tài)，可以進

22、行物質(zhì)的傳遞。 2.中溫型微生物：中溫型微生物：最適生長溫度為最適生長溫度為2040 2040 ，大多數(shù)微生物屬于此，大多數(shù)微生物屬于此類。類。室溫型主要：為腐生或植物寄生，在植物或土壤中室溫型主要：為腐生或植物寄生，在植物或土壤中。體溫型主要：為寄生，在人和動物體內(nèi)。體溫型主要：為寄生，在人和動物體內(nèi)。中溫型微生物不能在低溫條件下生長是由于：中溫型微生物不能在低溫條件下生長是由于： 1 1、中溫型微生物在低溫下蛋白質(zhì)的合成過程不能啟、中溫型微生物在低溫下蛋白質(zhì)的合成過程不能啟動；動； 2 2、低溫下，受代謝產(chǎn)物的反饋抑制。、低溫下，受代謝產(chǎn)物的反饋抑制。 3.高溫型微生物：高溫型微生物：最適

23、生長溫度為最適生長溫度為50 60 ,50 60 ,主要分布在溫泉、堆主要分布在溫泉、堆肥和土壤中。肥和土壤中。在高溫下能生長的原因：在高溫下能生長的原因：酶蛋以及核糖體有較強的抗熱性酶蛋以及核糖體有較強的抗熱性核酸具有較高的熱穩(wěn)定性（核酸中核酸具有較高的熱穩(wěn)定性（核酸中g(shù)+cg+c含量高（含量高（trnatrna），可提供形成），可提供形成 氫鍵，增加熱穩(wěn)定性氫鍵，增加熱穩(wěn)定性 ）。）。細胞膜中飽和脂肪酸含量高，較高溫度下能維持正細胞膜中飽和脂肪酸含量高，較高溫度下能維持正常的液晶狀態(tài)。常的液晶狀態(tài)。高溫微生物的特點高溫微生物的特點:生長速度快，合成大分子迅速，可及時修復(fù)生長速度快，合成大分

24、子迅速，可及時修復(fù)高溫對其造成的分子損傷。高溫對其造成的分子損傷。 耐高溫菌具應(yīng)用優(yōu)勢耐高溫菌具應(yīng)用優(yōu)勢：在減少能源消耗、減：在減少能源消耗、減少染菌、縮短發(fā)酵周期等方面具重要意義。少染菌、縮短發(fā)酵周期等方面具重要意義。乳酸鏈球菌：乳酸鏈球菌：34 ：繁殖速度最快，最適宜生長溫度：繁殖速度最快，最適宜生長溫度40 ：發(fā)酵速度最快：發(fā)酵速度最快30 ：產(chǎn)乳酸量最多，積累產(chǎn)物最適宜溫度：產(chǎn)乳酸量最多，積累產(chǎn)物最適宜溫度2530 ：細胞產(chǎn)量最高，得率最高的溫度：細胞產(chǎn)量最高，得率最高的溫度不同生理生化過程的最適溫度不同生理生化過程的最適溫度微生物不同生理活動要求不同溫度，所以，微生物不同生理活動要求

25、不同溫度，所以， 最適生長溫度最適生長溫度 發(fā)酵速度快、積累代謝產(chǎn)物多發(fā)酵速度快、積累代謝產(chǎn)物多。又如：青霉素產(chǎn)生菌菌體的最適生長溫度為又如：青霉素產(chǎn)生菌菌體的最適生長溫度為30，而，而產(chǎn)生青霉素的最適溫度為產(chǎn)生青霉素的最適溫度為23。1、高溫對微生物的影響、高溫對微生物的影響高溫下蛋白質(zhì)不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞高溫下蛋白質(zhì)不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞細胞結(jié)構(gòu)（溶菌）。細胞結(jié)構(gòu)（溶菌）。微生物對熱的耐受力與以下因素有關(guān)微生物對熱的耐受力與以下因素有關(guān):(1)微生物種類及發(fā)育階段微生物種類及發(fā)育階段 嗜熱菌比其它類型的菌體抗熱嗜熱菌比其它類型的菌體抗熱有芽孢的細菌比無芽孢的菌抗熱有芽

26、孢的細菌比無芽孢的菌抗熱微生物的繁殖結(jié)構(gòu)比營養(yǎng)結(jié)構(gòu)抗熱性強微生物的繁殖結(jié)構(gòu)比營養(yǎng)結(jié)構(gòu)抗熱性強老齡菌比幼齡菌抗熱老齡菌比幼齡菌抗熱（三）高溫與低溫對微生物的影響（三）高溫與低溫對微生物的影響(2)微生物對熱的耐受力還受環(huán)境條件的影響微生物對熱的耐受力還受環(huán)境條件的影響 ：與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分有關(guān)與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分有關(guān) 培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量高培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量高時比較耐熱時比較耐熱.與與ph 有關(guān)有關(guān) ph適宜時不易死亡，適宜時不易死亡，ph不適宜時，容不適宜時，容易死亡易死亡.與水分有關(guān)與水分有關(guān) 含水量大時容易死亡，含水量小時含水量大時容易死亡，含水量小時不容易死亡不容易死亡.與含菌量有關(guān)與含菌量

27、有關(guān) 含菌量高，抗熱性增強，含菌量含菌量高，抗熱性增強，含菌量低，抗熱性差。低，抗熱性差。與熱處理時間有關(guān)與熱處理時間有關(guān) 熱處理時間長，微生物易死熱處理時間長，微生物易死亡。亡。 2、低溫對微生物的影響、低溫對微生物的影響造成死亡的原因：造成死亡的原因：凍結(jié)時細胞水分變成冰晶，冰晶對細胞凍結(jié)時細胞水分變成冰晶，冰晶對細胞膜產(chǎn)生機械損傷，膜內(nèi)物質(zhì)外漏。膜產(chǎn)生機械損傷，膜內(nèi)物質(zhì)外漏。凍結(jié)過程造成細胞脫水。凍結(jié)過程造成細胞脫水。因此，利用快速凍結(jié)可以對一些菌種進行凍結(jié)保因此，利用快速凍結(jié)可以對一些菌種進行凍結(jié)保藏，一般情況下在菌懸液中再加一些甘油、糖、藏，一般情況下在菌懸液中再加一些甘油、糖、牛奶

28、、保護劑等可對菌種進行長期保藏。牛奶、保護劑等可對菌種進行長期保藏。二、二、 ph ph 值對微生物生長的影響值對微生物生長的影響 微生物在微生物在 ph49 之間都可以生長。之間都可以生長。 引起細胞膜電荷的變化，從而影響了微生物對引起細胞膜電荷的變化，從而影響了微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；營養(yǎng)物質(zhì)的吸收； 影響代謝過程中酶的活性；影響代謝過程中酶的活性；改變營養(yǎng)物質(zhì)的可給性以及有害物質(zhì)的毒性。改變營養(yǎng)物質(zhì)的可給性以及有害物質(zhì)的毒性。（一）環(huán)境（一）環(huán)境phph值對微生物生長的影響值對微生物生長的影響微生物生長的微生物生長的ph值三基點：值三基點：各種微生物都有其生長的最低、最適和最高各種微生物

29、都有其生長的最低、最適和最高ph值。值。低于低于最低、或超過最高生長最低、或超過最高生長phph值時，微生物值時，微生物生長受抑制或?qū)е滤劳觥ＩL受抑制或?qū)е滤劳觥８鶕?jù)微生物生長的最適根據(jù)微生物生長的最適ph值，將微生物分為：值，將微生物分為：嗜堿微生物：硝化細菌、尿素分解菌、多數(shù)放線菌嗜堿微生物：硝化細菌、尿素分解菌、多數(shù)放線菌 耐堿微生物：許多鏈霉菌耐堿微生物：許多鏈霉菌 中性微生物：絕大多數(shù)細菌，一部分真菌中性微生物：絕大多數(shù)細菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫桿菌屬嗜酸微生物：硫桿菌屬 耐酸微生物：乳酸桿菌、醋酸桿菌耐酸微生物：乳酸桿菌、醋酸桿菌（二（二) ) 不同微生物對不同微生物對ph

30、ph要求不同要求不同同一種微生物在其不同的生長階段和不同的生同一種微生物在其不同的生長階段和不同的生理生化過程中，對理生化過程中，對ph值的要求也不同。值的要求也不同。 生長的最適生長的最適phph值與發(fā)酵的最適值與發(fā)酵的最適phph值值例如：丙酮丁醇梭菌例如：丙酮丁醇梭菌 在在phph值值=5.5=5.57.07.0時，以菌體生長為主時，以菌體生長為主 在在phph值值=4.3=4.35.35.3時，進行丙酮丁醇發(fā)酵時，進行丙酮丁醇發(fā)酵同一種微生物由于環(huán)境同一種微生物由于環(huán)境phph值不同，可能積累值不同，可能積累不同的代謝產(chǎn)物。不同的代謝產(chǎn)物。例如：黑曲霉例如：黑曲霉phph值值=2=23

31、 3時，產(chǎn)物以檸檬酸為主，只產(chǎn)少量草酸。時，產(chǎn)物以檸檬酸為主，只產(chǎn)少量草酸。phph值在值在7 7左右時，產(chǎn)物以草酸為主，只產(chǎn)少量檸檬酸。左右時，產(chǎn)物以草酸為主，只產(chǎn)少量檸檬酸。（三）微生物的生命活動對環(huán)境（三）微生物的生命活動對環(huán)境phph值的影響值的影響微生物在生長過程中也會使外界環(huán)境的微生物在生長過程中也會使外界環(huán)境的ph值值發(fā)生改變，原因：發(fā)生改變，原因：由于有機物分解：由于有機物分解：分解糖類、脂肪等，分解糖類、脂肪等，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)液產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)液phph值下降；值下降；分解分解蛋白質(zhì)、尿素等，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)液蛋白質(zhì)、尿素等，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)液phph值上升

32、值上升由于無機鹽選擇性吸收：由于無機鹽選擇性吸收：銨鹽吸收銨鹽吸收(nh4)2so4 h2so4， phph硝酸鹽吸收硝酸鹽吸收nano3 naoh， phphnh4+被吸收被吸收no3+被吸收被吸收配制培養(yǎng)基時調(diào)整配制培養(yǎng)基時調(diào)整ph值的措施：值的措施：培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)ph值的措施值的措施過酸時：過酸時：加入堿或適量氮源，提高通氣量。加入堿或適量氮源，提高通氣量。過堿時：過堿時：加入酸或適量碳源，降低通氣量。加入酸或適量碳源，降低通氣量。三、氧氣對微生物生長的影響三、氧氣對微生物生長的影響根據(jù)微生物與氧的關(guān)系根據(jù)微生物與氧的關(guān)系,可把它們分可把它們分為幾種類群為幾種類群: 專性好

33、氧菌專性好氧菌: : 好氧菌好氧菌 微好氧菌：微好氧菌： 兼性厭氧菌兼性厭氧菌 耐氧厭氧菌：耐氧厭氧菌： 厭氧菌厭氧菌 (專性專性)厭氧菌：厭氧菌：專性好氧菌專性好氧菌必須在有分子氧的條件下才能生長，有完整的呼吸必須在有分子氧的條件下才能生長，有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，細胞含有超氧物歧化酶鏈，以分子氧作為最終氫受體，細胞含有超氧物歧化酶（sod，superoxide dismutase）和過氧化氫酶。）和過氧化氫酶。在有氧或無氧條件下均能生長，但有氧情況下在有氧或無氧條件下均能生長，但有氧情況下生長得更好，在有氧時靠呼吸產(chǎn)能，無氧時接發(fā)酵生長得更好，在有氧時靠呼吸產(chǎn)能，無氧時接發(fā)

34、酵或無氧呼吸產(chǎn)能；細胞含有或無氧呼吸產(chǎn)能；細胞含有sod和過氧化氫酶。和過氧化氫酶。微好氧菌微好氧菌只能較低的氧分壓下才能正常生長，通過呼吸只能較低的氧分壓下才能正常生長，通過呼吸鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能，鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能，兼性好氧菌兼性好氧菌耐氧菌耐氧菌可在分子氧存在下進行厭氧生活的厭氧菌。生活不可在分子氧存在下進行厭氧生活的厭氧菌。生活不需要氧，分子氧也對它無毒害。不具有呼吸鏈，依靠專需要氧，分子氧也對它無毒害。不具有呼吸鏈，依靠專性發(fā)酵獲得能量。細胞內(nèi)存在性發(fā)酵獲得能量。細胞內(nèi)存在sod和過氧化物酶，但缺和過氧化物酶，但缺乏過氧化氫酶。乏過氧化氫酶。厭氧菌厭氧菌分子氧對它有毒

35、害，短期接觸空氣，也會抑制其生分子氧對它有毒害，短期接觸空氣，也會抑制其生長甚至致死；在空氣或含有長甚至致死；在空氣或含有10%co2的空氣中，在固體的空氣中，在固體培養(yǎng)基表面上不能生長，只有在其深層的無氧或低氧化培養(yǎng)基表面上不能生長，只有在其深層的無氧或低氧化還原電勢的環(huán)境下才能生長；生命活動所需能量通過發(fā)還原電勢的環(huán)境下才能生長；生命活動所需能量通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵提供；細胞酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵提供；細胞內(nèi)缺乏內(nèi)缺乏sod和細胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫和細胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。酶。嚴格厭氧微生物并不是被氣態(tài)的氧所殺死，而是由

36、于不能解除某些氧代謝嚴格厭氧微生物并不是被氣態(tài)的氧所殺死，而是由于不能解除某些氧代謝產(chǎn)物的毒性而死亡。產(chǎn)物的毒性而死亡。在氧還原為水的過程中，可形成某些有毒的中間產(chǎn)物，例如，過氧化氫（在氧還原為水的過程中，可形成某些有毒的中間產(chǎn)物，例如，過氧化氫（h2o2）、超氧陰離子（）、超氧陰離子（ o2 ）等。超氧陰離子為活性氧，兼有分子和離子的）等。超氧陰離子為活性氧，兼有分子和離子的性質(zhì)，反應(yīng)力極強，極不穩(wěn)定，可破壞膜和重要生物大分子，性質(zhì)，反應(yīng)力極強，極不穩(wěn)定，可破壞膜和重要生物大分子，對微生物造成對微生物造成毒害或致死。毒害或致死。好氧微生物具有降解這些產(chǎn)物的酶，如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化

37、好氧微生物具有降解這些產(chǎn)物的酶，如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等，物歧化酶等，而嚴格厭氧菌缺乏而嚴格厭氧菌缺乏sod，故易被生物體內(nèi)極易產(chǎn)生的超氧陰離子自由基毒害，故易被生物體內(nèi)極易產(chǎn)生的超氧陰離子自由基毒害致死。致死。厭氧菌的氧毒害機制厭氧菌的氧毒害機制 sod學(xué)說：學(xué)說：各類菌所含對氧解毒酶各類菌所含對氧解毒酶專性好氧菌專性好氧菌 sod，過氧化氫酶，過氧化氫酶 兼性厭氧菌兼性厭氧菌 sod， 過氧化氫酶過氧化氫酶 微好氧菌微好氧菌 少量少量sod 耐氧菌耐氧菌 sod， 過氧化物酶過氧化物酶專性厭氧菌專性厭氧菌 二種酶均無二種酶均無 厭氧菌的氧毒害機制厭氧菌的氧毒害機制 sod

38、學(xué)說：學(xué)說：在培養(yǎng)不同類型的微生物時在培養(yǎng)不同類型的微生物時: :培養(yǎng)好氧微生物：培養(yǎng)好氧微生物：需震蕩或通氣，保證充足的氧氣需震蕩或通氣，保證充足的氧氣。培養(yǎng)專性厭氧微生物：培養(yǎng)專性厭氧微生物：需排除環(huán)境中的氧氣，同時需排除環(huán)境中的氧氣，同時 在培養(yǎng)基中添加還原劑，降低培在培養(yǎng)基中添加還原劑，降低培 養(yǎng)基中的氧化還原電位勢。養(yǎng)基中的氧化還原電位勢。培養(yǎng)兼性厭氧或耐氧微生物：培養(yǎng)兼性厭氧或耐氧微生物：可深層靜止培養(yǎng)可深層靜止培養(yǎng)。四、水分與空氣相對濕度 在自然條件下，微生物喜歡生長在濕潤的物質(zhì)表面和潮濕的環(huán)境中。 配制培養(yǎng)基時加入足夠量的水分，同時在培養(yǎng)微生物時，還要求有適宜空氧濕度。大多數(shù)微

39、生物生長適宜的空氣濕度為80%80%90%90%。空氣濕度低，影響微生物生長。滲透壓是影響水分利用的重要因素。在低滲溶液中：水分向細胞內(nèi)滲透，細胞吸水膨脹。在等滲溶液中：細胞保持原形，微生物生長最好。在高滲溶液中：細胞失水，造成生理干燥，引起質(zhì)壁分離，抑制微生物生長五、光與射線 紅外線波長在800-1000nm，對微生物作用不大，主要是照射后產(chǎn)熱，間接影響微生物生長。 可見光波長在400-760nm，是光能營養(yǎng)型微生物的能源。大部分微生物生長不需要，但有些化能營養(yǎng)型微生物在不同生長階段需要一定量的散射光照。 紫外線及其他射線具有較強的殺菌作用。（一）、分批培養(yǎng)：（一）、分批培養(yǎng)： 以少量純培養(yǎng)

40、細菌接種一定容積的培養(yǎng)基中經(jīng)以少量純培養(yǎng)細菌接種一定容積的培養(yǎng)基中經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲，此稱分批培養(yǎng)。過培養(yǎng)生長，最后一次收獲，此稱分批培養(yǎng)。 單批培養(yǎng)或封閉培養(yǎng)的培養(yǎng)基一次加單批培養(yǎng)或封閉培養(yǎng)的培養(yǎng)基一次加入，不予補充，不再更換入，不予補充，不再更換 。利用分批培養(yǎng)可以測定細菌純培養(yǎng)生長曲線。利用分批培養(yǎng)可以測定細菌純培養(yǎng)生長曲線。 在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)物質(zhì)，同時排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的的微生物長時間地處于對數(shù)生長期，以

41、利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。連續(xù)培養(yǎng)的原理連續(xù)培養(yǎng)的原理:是利用是利用細菌細菌在在生長曲線生長曲線中的對數(shù)中的對數(shù)期生長最快。由于對典型生長曲線中穩(wěn)定期到來期生長最快。由于對典型生長曲線中穩(wěn)定期到來原因的認識，采取相應(yīng)有效措施推遲其來臨，從原因的認識，采取相應(yīng)有效措施推遲其來臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。原理：當微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達到對數(shù)期后期時，一方面以一定的原理：當微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達到對數(shù)期后期時，一方面以一定的速度流進新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達到動速度

42、流進新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達到動態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。單批培養(yǎng)單批培養(yǎng) 恒濁法恒濁法恒化法恒化法 單批培養(yǎng)單批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)時間時間連續(xù)流入連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液新鮮培養(yǎng)液lg細胞數(shù)（個細胞數(shù)（個/ml）連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)原理連續(xù)培養(yǎng)原理連續(xù)連續(xù)培養(yǎng)器培養(yǎng)器按控制方式分按控制方式分按培養(yǎng)器的級數(shù)分按培養(yǎng)器的級數(shù)分按細胞狀態(tài)分按細胞狀態(tài)分按用途分按用途分內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長速率）外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長速率）：恒化器：恒化器單級連續(xù)培養(yǎng)器單級連續(xù)培養(yǎng)器多級連續(xù)培養(yǎng)器多級連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)