1、實驗五實驗五 人類淋巴細胞株培養人類淋巴細胞株培養 培養基的配制培養基的配制一、實驗目的一、實驗目的v熟練掌握熟練掌握rpmi 1640rpmi 1640培養基的配制方法。培養基的配制方法。二、實驗原理二、實驗原理v 細胞培養使用的培養基一般是由細胞培養使用的培養基一般是由合成合成培養基培養基和小牛血清配制而成。合成培養基和小牛血清配制而成。合成培養基有商品出售，它是根據細胞生長的需要按有商品出售，它是根據細胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質。其主要成分是一定配方制成的粉狀物質。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和其他輔助物質。它的酸堿度和滲

2、透壓與和其他輔助物質。它的酸堿度和滲透壓與活體內細胞外液相似。活體內細胞外液相似。v小牛血清含有一定的營養成分，更重要的是小牛血清含有一定的營養成分，更重要的是它含有細胞生長所必需的它含有細胞生長所必需的生長因子生長因子；酶、微酶、微量元素和激素量元素和激素；保護作用保護作用；提供伸展和貼附提供伸展和貼附因子因子等，是合成培養基所無法替代的。此外等，是合成培養基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質（重金屬、抗菌素）的它還能中和有毒物質（重金屬、抗菌素）的毒性。毒性。小牛血清小牛血清v氨基酸是組成蛋白質的基本單位。不同種類的氨基酸是組成蛋白質的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種

3、氨基酸細細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養基提供，這幾胞自身不能合成，必須依靠培養基提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。因此，各種氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。因此，各種培養液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于培養液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定，應置于谷氨酰胺在溶液中很不穩定，應置于-20冰箱冰箱中保存，在使用前加入培養液內。中保存，在使用前加入培養液內。l-谷氨酰胺三

4、、儀器、材料和試劑三、儀器、材料和試劑v超凈工作臺超凈工作臺v高壓滅菌鍋高壓滅菌鍋v多重蒸餾水器多重蒸餾水器v磁力攪拌器磁力攪拌器v天平天平v微量加樣器微量加樣器（一）儀器（一）儀器（二）用具、材料（二）用具、材料v細胞培養瓶細胞培養瓶v量筒、研缽、燒杯、漏斗、濾紙量筒、研缽、燒杯、漏斗、濾紙vphph試紙試紙v微孔過濾器（微孔過濾器（0.22m）及）及注射器注射器v各種規格的各種規格的tip 、離心管離心管（三）試劑（三）試劑vnaohnaoh、 酚紅酚紅vrpmi 1640rpmi 1640干粉干粉v小牛血清、青霉素、鏈霉素小牛血清、青霉素、鏈霉素vnahconahco3 3 、l-l-谷

5、氨酰胺谷氨酰胺v三蒸水三蒸水v要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：基本要求：v一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環境酸堿度和滲透壓的調節。外環境酸堿度和滲透壓的調節。v二是嚴格控制無菌條件。二是嚴格控制無菌條件。 注意注意四、實驗步驟四、實驗步驟（一）準備（一）準備( (清洗與滅菌）清洗與滅菌）（二）（二）合成培養基的配制合成培養基的配制1. 1%酚紅

6、：酚紅：v配制配制 0.1 mol/l naoh 100ml。v稱量稱量 1g 酚紅于研缽中，取酚紅于研缽中，取 30 ml 0.1 mol/l naoh逐漸加入研缽中，盡量研細，然后過濾。逐漸加入研缽中，盡量研細，然后過濾。v過濾后的酚紅液加三蒸水至過濾后的酚紅液加三蒸水至 100 ml。v4保存。保存。2. 2. 飽和飽和nahco3的配制：的配制：v稱取稱取 10g 的的 nahco3 溶于溶于 200 ml 三蒸三蒸水中，滅菌后分裝于水中，滅菌后分裝于50 ml 試劑瓶。試劑瓶。v4保存。保存。3 3rpmi 1640 培養液配制：培養液配制： 配制配制50ml rpmi 1640培養

7、液：培養液：v每組稱取每組稱取 rpmi 1640干粉干粉 0.52g，溶于，溶于50 ml 的三蒸水。的三蒸水。v置于攪拌器上攪拌置于攪拌器上攪拌 20 min，直到液體變，直到液體變為澄清為止。為澄清為止。磁珠磁珠4. rpmi 1640 合成培養基配制：合成培養基配制：v加入加入 0.1ml 1%的酚紅，通入的酚紅，通入co2，使液體，使液體變為金黃色，說明培養基完全溶好。變為金黃色，說明培養基完全溶好。v配制好的培養基，用時用飽和配制好的培養基，用時用飽和 nahco3液液調節調節 ph 至至 6.8-7.0。v溶好以后的培養液在超凈臺中進行溶好以后的培養液在超凈臺中進行0.22m濾過

8、除菌，分裝至細胞培養瓶中。濾過除菌，分裝至細胞培養瓶中。v瓶口封好，瓶口封好，-20或或4 貯存貯存。（三）小牛血清的處理（三）小牛血清的處理v新買的新生小牛血清一定要滅活。新買的新生小牛血清一定要滅活。v將買來的新生小牛血清不開封置于水將買來的新生小牛血清不開封置于水浴鍋中浴鍋中56，30min，期間要不時輕輕，期間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。v處理后的血清貯存于處理后的血清貯存于4。（四）生長培養基的配制（四）生長培養基的配制1 1雙抗：雙抗： （100000u/ml）v160160萬單位青霉素萬單位青霉素/ /瓶瓶+8ml 3dw = 20+

9、8ml 3dw = 20萬單位萬單位/ml/mlv1g1g鏈霉素鏈霉素+5ml 3dw = 200000 +5ml 3dw = 200000 g /mlg /mlv各取以上的液體各取以上的液體5ml5ml混合，使其濃度為混合，使其濃度為1010萬單位萬單位/ml/ml，0.220.22m m 過濾至過濾至1.5ml1.5ml離心管，離心管，-20-20貯存。貯存。2 2谷氨酰胺儲備液谷氨酰胺儲備液（200mmol/l）： v1.5g1.5g的谷氨酰胺溶于的谷氨酰胺溶于50ml50ml三蒸水中三蒸水中（30 mg/ml= 200 mmol/l),0.2230 mg/ml= 200 mmol/l),0.22m m過濾過濾至至1.5ml1.5ml離心管中。離心管中。v-20-20貯存。貯存。3 3. rpmi 1640生長培養基的配制生長培養基的配制5050毫升毫升 儲備液濃度儲備液濃度終濃度終濃度rpmi 1640rpmi 1640培養液培養液 44.544.5谷氨酰胺谷氨酰胺0.50.530mg/ml30mg/ml0.3mg/ml0.3mg/ml雙抗雙抗0.050.05100000u/ml100000u/ml100u/ml100u