1、1流式細(xì)胞術(shù)在臨床上的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在臨床上的應(yīng)用深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心 李富榮李富榮2 第一部分 流式細(xì)胞儀（fcm)）工作原理3fcmfcm系統(tǒng)結(jié)構(gòu)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)流體系統(tǒng)：樣本流、鞘液流體系統(tǒng)：樣本流、鞘液光學(xué)系統(tǒng)：激光光源、分光鏡、濾片、光學(xué)系統(tǒng)：激光光源、分光鏡、濾片、 散射光和熒光探測器散射光和熒光探測器分選系統(tǒng)：壓電晶體、液流成滴、加電分選系統(tǒng)：壓電晶體、液流成滴、加電 系統(tǒng)、偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)系統(tǒng)、偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：計算機工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：計算機工作站4fcmfcm工作原理流程：工作原理流程：樣本（血液實體組織）單細(xì)胞懸液熒光染料特異染色的樣本上機細(xì)胞

2、單列通過測量區(qū)1.散射光信號2.熒光信號分離、收集、分析、光信號細(xì)胞理化特性分析圖加入熒光染料激光激發(fā)5流式細(xì)胞儀的構(gòu)造及原理流式細(xì)胞儀的構(gòu)造及原理6fcmfcm測量光信號獲取與分析測量光信號獲取與分析散射光信號前向散射光(fsc)-細(xì)胞大小側(cè)向散射光（ssc)-細(xì)胞粒度（膜的粒度、核大小與粒度、胞質(zhì)數(shù)量）fsc信號越大，表明細(xì)胞體積越大；反之，則越小。ssc信號越大，表明細(xì)胞粒度越大；反之，則越小。7根據(jù)根據(jù)fsc-sscfsc-ssc二維點圖，可以容易區(qū)分二維點圖，可以容易區(qū)分lym(r3)gran(r1)lym(r3)gran(r1)與與mono(r2)mono(r2)r1r2incid

3、ent light sourceright angle light dectector a cell complexityforward light detector a cell surface arear3r2r1根據(jù)根據(jù)fsc-sscfsc-ssc二維點圖，可以容易的區(qū)分出二維點圖，可以容易的區(qū)分出lym(r3) .gran(r1)lym(r3) .gran(r1)與與mono(r2)mono(r2)8流式細(xì)胞術(shù)常用染料及檢測波長流式細(xì)胞術(shù)常用染料及檢測波長910熒光染料的發(fā)射不同波長熒光染料的發(fā)射不同波長11dna dna 和和rnarna熒光探針的理化特性熒光探針的理化特性熒光探針熒

4、光探針 分子量分子量 結(jié)合方式結(jié)合方式 堿基特異性堿基特異性 激發(fā)鋒（激發(fā)鋒（nm) nm) 發(fā)射鋒發(fā)射鋒(nm)(nm)p1 668 p1 668 嵌入嵌入 無無 493 630493 630eb 394 eb 394 嵌入嵌入 無無 482 616482 616mi 1069 mi 1069 非嵌入非嵌入 g-c 320,445 575 g-c 320,445 575 ca3 1183 ca3 1183 非嵌入非嵌入 gc 320,445 575 gc 320,445 575 ho33258 624 ho33258 624 非嵌入非嵌入 at 343 480 at 343 480 ho33

5、342 615 ho33342 615 非嵌入非嵌入 at 343 455at 343 455dapi 350 dapi 350 非嵌入非嵌入 at 540 650at 540 6507-aad 1270 7-aad 1270 嵌入嵌入 gc 540 655 gc 540 655 ao 370 ao 370 嵌入嵌入 ( (雙鏈）雙鏈） 無無 492 530492 530 靜電（單鏈）靜電（單鏈） 640640py 303 py 303 嵌入嵌入 ( (雙鏈）雙鏈） gcat 549-562 565-574gcat 549-562 565-574 靜電（單鏈）靜電（單鏈）12細(xì)胞周期分析細(xì)胞周

6、期分析通過熒光探針對細(xì)胞周期進行相對通過熒光探針對細(xì)胞周期進行相對dnadna含量的測定，可分析細(xì)含量的測定，可分析細(xì)胞周期各時期的百分比，周期動力參數(shù)及胞周期各時期的百分比，周期動力參數(shù)及dnadna異倍體異倍體g1sg2gom13分選系統(tǒng)（分選系統(tǒng)（sorting)sorting)依據(jù)流式細(xì)胞術(shù)測定的細(xì)胞參數(shù)可分選所需細(xì)胞群體：依據(jù)流式細(xì)胞術(shù)測定的細(xì)胞參數(shù)可分選所需細(xì)胞群體：電荷式分選電荷式分選穩(wěn)定液流測量區(qū)液滴形成液滴充電液滴偏轉(zhuǎn)分選收集邏輯電路14電荷式分選電荷式分選15通道式分選通道式分選穩(wěn)定液流測量區(qū)邏輯電路捕獲管分選收集16 第二部分第二部分 流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞

7、術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1718流式臨床應(yīng)用流式臨床應(yīng)用淋巴細(xì)胞亞群分析淋巴細(xì)胞亞群分析th1/th2 腫瘤學(xué)腫瘤學(xué)hla-b27pnh 四聚體四聚體血小板活化血小板活化 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 移植免疫移植免疫192021222324常常用用淋淋巴巴細(xì)細(xì)胞胞亞亞群群報報告告模模式式r25深圳深圳市人市人民醫(yī)民醫(yī)院流院流式細(xì)式細(xì)胞術(shù)胞術(shù)報告報告單模單模式式26272829303132333435363738hla-b27通過cd3pevsssc設(shè)門，圈定cd3陽性細(xì)胞（t淋巴細(xì)胞），檢測其b-27的平均熒光強度。如標(biāo)本的平均熒光強度小于標(biāo)準(zhǔn)微球熒光強度則為陰性，反之為陽性。3940 th1/th2細(xì)胞4

8、1424344454647 腫瘤學(xué)腫瘤學(xué)48495051525354555657585960 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡616263646566 移植免疫移植免疫676869707172 四聚體四聚體73tetramer-原理原理內(nèi)源性抗原內(nèi)源性抗原外源性抗原外源性抗原74tetramer-原理原理mhc class i-hla-a275tetramer-原理原理76tetramer-原理原理國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊 2001；24(2):102-10577hla class i 限定性腫瘤抗原肽限定性腫瘤抗原肽78抗原特異性抗原特異性ctl的分析方法的分析方法51cr釋放實驗釋放實驗pcr法法酶聯(lián)免疫斑點法

9、酶聯(lián)免疫斑點法(elispot)擴增特異t淋巴細(xì)胞受體tetramer法法間接法需大量的特異性ctls作為效應(yīng)細(xì)胞需體外擴增，周期長，敏感性低， 費時費力難以廣泛應(yīng)用敏感性高但只能用于已知tcr基因型的特異性ctls檢測直接法敏感性高不受tcr基因型的限制有限稀釋法有限稀釋法(lda)用用tetramer法研究表明，外周血中僅有法研究表明，外周血中僅有0.2-2.5% 的的cd8+細(xì)胞對細(xì)胞對cmv和和ebv特異特異79tetramer法法doherty pc.the numbers game for virus-specific cd8+t cellsj. science,1998,280:

10、227了解病毒特異性ctl和記憶性ctl方面的一項革命檢測病毒特異性cd8細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)(gold standard)80tetramer-應(yīng)用應(yīng)用感染性疾病感染性疾病hiv-aids, ebv, cmv, hpv, hbv, hcv, influenza, measles, malaria, tb and rsvbreast, prostate, melanoma, colon, lung, cervical, ovarian and leukemiadiabetes, lyme disease, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, autoim

11、mune vitiligoebv and cmv 移植移植 自身免疫性疾病自身免疫性疾病腫瘤腫瘤81感染性疾病感染性疾病tetramer-應(yīng)用應(yīng)用-例證例證含有hiv-i型病毒包膜肽等三種抗原肽：hiv特異性ctl數(shù)量與血漿中rna病毒量有明顯的負(fù)相關(guān)，而與產(chǎn)毒性感染細(xì)胞的清除率無關(guān)慢性hcv感染患者的特異性ctls數(shù)量明顯少于急性hcv感染和已康復(fù)患者用黑色素瘤抗原誘導(dǎo)潛在的腫瘤特異性t細(xì)胞用tetramer分離，富集gvhd(移植物抗宿主反應(yīng))：受體與供體的次要組織相容性抗原(mhags)的不同引起，在骨髓移植后早期出現(xiàn)(14天內(nèi))，造成骨髓移植失敗-hla-mhags肽四聚體監(jiān)測mhag

12、s特異性ctl，以了解對gvhd的臨床治療效果hla-a2/pp65 tetramer監(jiān)測腎移植患者感染cmv后的免疫應(yīng)答能力 移植移植腫瘤腫瘤828384 第三部分第三部分 定量流式細(xì)胞術(shù)定量流式細(xì)胞術(shù)85 定量流式細(xì)胞術(shù)的概述定量流式細(xì)胞術(shù)的概述定量流式細(xì)胞術(shù)指的是對待細(xì)胞的某種生物分子的絕定量流式細(xì)胞術(shù)指的是對待細(xì)胞的某種生物分子的絕對計量，而不是陽性細(xì)胞的相對百分?jǐn)?shù)。對計量，而不是陽性細(xì)胞的相對百分?jǐn)?shù)。原理：通過檢測標(biāo)準(zhǔn)微球的熒光強度獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，原理：通過檢測標(biāo)準(zhǔn)微球的熒光強度獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線（或方程）求得待測細(xì)胞的某種生物分通過標(biāo)準(zhǔn)曲線（或方程）求得待測細(xì)胞的某種生物分子

13、的精確數(shù)值，從而反應(yīng)在某種生理、病理條件下待子的精確數(shù)值，從而反應(yīng)在某種生理、病理條件下待測細(xì)胞出現(xiàn)的微細(xì)變化，對臨床疾病的研究、診斷及測細(xì)胞出現(xiàn)的微細(xì)變化，對臨床疾病的研究、診斷及治療等具有重要意義治療等具有重要意義。86血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- platelet calibrator kit- platelet calibrator kit87特點特點可定量與血小板相關(guān)的任何抗原(如cd41, cd61, cd42a等)免洗間接法一抗亞型為igg1, igg2a或igg2b定量范圍寬(500-90,000 分子/血小板 )定量準(zhǔn)確，cv值(變異系數(shù))小血小板表面抗原定量血小板

14、表面抗原定量- platelet calibrator kit- platelet calibrator kit88標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- platelet calibrator kit- platelet calibrator kit89結(jié)果結(jié)果血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- platelet calibrator kit90cd41/61復(fù)合物變形與復(fù)合物變形與firbrinogen結(jié)合，為結(jié)合，為初期血栓初期血栓形成的關(guān)鍵步驟形成的關(guān)鍵步驟platelet fibrinogen kit91應(yīng)用應(yīng)用心血管疾病(不穩(wěn)定心絞痛，心肌梗塞等)監(jiān)測抗凝集治療

15、(如reppro, integrelin, plavix, ticlid等)檢測gpiib/iiia(cd41/cd61)受體fibrinogen結(jié)合能力血液體外(in vitro)活化(adp等誘導(dǎo))后，檢測fibrinogen結(jié)合能力血小板活化狀態(tài)(ex vivo)標(biāo)本處理標(biāo)本處理platelet fibrinogen kit92白細(xì)胞表面抗原定量白細(xì)胞表面抗原定量- cellquanttm calibrator kit93特點特點可定量與白細(xì)胞相關(guān)的任何抗原(如cd3, cd4, cd55, cd59等)單個定量(用一個單抗，如cd28抗體定量白細(xì)胞表面cd28分子數(shù))多參數(shù)定量(如用c

16、d8設(shè)門來定量cd8+ t細(xì)胞上cd28分子數(shù))全血和分離的細(xì)胞(如細(xì)胞株等)均可間接法一抗亞型為igg1和igg2a定量范圍寬(1000-300,000 分子/白細(xì)胞 )定量準(zhǔn)確，cv值(變異系數(shù))小白細(xì)胞表面抗原定量白細(xì)胞表面抗原定量- cellquanttm calibrator kit94標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線白細(xì)胞表面抗原定量白細(xì)胞表面抗原定量- cellquanttm calibrator kit95結(jié)果結(jié)果白細(xì)胞表面抗原定量白細(xì)胞表面抗原定量- cellquanttm calibrator kit96blood dendritic cell enumeration kitdcdc作用作

17、用：1.樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,dc）為一群非均一性專職抗原遞呈細(xì)胞，與mhc二類分子結(jié)合向其它免疫活性細(xì)胞傳遞抗原信息。 2.骨髓樣dc（mdc）和淋巴樣dc(pdc).在誘導(dǎo)和調(diào)控免疫應(yīng)答方式上完全不同：首先它們表達不同的抗原識別受體并對不同的抗原起作用；表達不同的細(xì)胞因子受體并對不同的細(xì)胞因子起反應(yīng)，即使受到相同的抗原刺激。骨髓樣dc（mdc）與th1效應(yīng)相關(guān),而淋巴樣dc（pdc）與th2效應(yīng)有聯(lián)系； 已經(jīng)應(yīng)用的領(lǐng)域包括已經(jīng)應(yīng)用的領(lǐng)域包括：1）sle病人病情和療效觀察；2）aids病人免疫機能分析；3）病毒性肝炎病人免疫狀況研究；4）疫苗研究。97特點特點簡便、簡便、

18、快捷、快捷、絕對計數(shù)絕對計數(shù)dc亞群數(shù)亞群數(shù)/ml9899最新技術(shù)最新技術(shù)計數(shù)血液中循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法計數(shù)血液中循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法100循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(cec)增加于增加于cellquant ff-cd146急性冠狀動脈綜合征血小板減少性紫癜鐮刀細(xì)胞貧血敗血癥狼瘡腎病綜合征器官移植排斥手術(shù)創(chuàng)傷癌癥傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法顯微鏡檢，手工計數(shù)。費時，費力，無法標(biāo)準(zhǔn)化101新技術(shù)新技術(shù)新標(biāo)準(zhǔn)新標(biāo)準(zhǔn)cellquant ff-cd146免疫磁珠富集與3色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合僅需1 ml血整個過程不到1個小時靈敏度高：1ml血中可檢測出10個循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞重復(fù)性好，室間差(interlaboratory cv)小102方法方法cellquant ff-cd146將包被cd146單抗的鐵磁性納米顆粒(cd146ff)與1ml 血孵育富集的cd146+細(xì)胞用以下試劑染色 pi(碘化丙啶) (確定有核細(xì)胞) cd45-fitc(排除wbc(白細(xì)胞)干擾) cd146-pe單抗(識別cd146抗原的另一位點) 標(biāo)準(zhǔn)濃度微球(用于絕對計數(shù))流式分析(循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞鑒定) 有核細(xì)胞(pi+); cd45-; cd146+;前向散射角(fsc)范圍寬103cellquant ff-cd146pi-cd45 fitc104cel