1、部分酶的定向進化與穩定性第六部分第六部分 酶的定向進化與穩定酶的定向進化與穩定性探究性探究 第一節第一節 定向進化簡介定向進化簡介第二節第二節 定向進化的應用定向進化的應用第三節第三節 蛋白質的穩定性蛋白質的穩定性第四節第四節 蛋白質不可逆失活的原理和機蛋白質不可逆失活的原理和機理理部分酶的定向進化與穩定性第一節第一節 定向進化簡介定向進化簡介一理論來源二概念三定向進化的選擇策略四雜合酶部分酶的定向進化與穩定性一理論來源利用基因工程原理可以在實驗室中模擬生物進化過程 l化學進化l生物進化部分酶的定向進化與穩定性部分酶的定向進化與穩定性部分酶的定向進化與穩定性二概念酶分子改造l化學修飾，定點突變

2、 定向進化部分酶的定向進化與穩定性定向進化示意圖定向進化示意圖隨機突變隨機突變+ +定向選擇目標突變體定向選擇目標突變體細菌細菌誘發突變的誘發突變的因素因素5050 0 0C C培養培養突變體庫突變體庫選擇壓力選擇壓力（溫度）（溫度）溫度耐受型突溫度耐受型突變體變體最適生長溫度為最適生長溫度為37370 0C C最適生長溫度提高了！最適生長溫度提高了！部分酶的定向進化與穩定性 Strategies for the development of effective enzymes部分酶的定向進化與穩定性定向進化l屬于蛋白質的非合理設計，它不需要事先了解酶的空間結構和催化機制，人為地創造特殊的進化

3、條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質的突變酶。 部分酶的定向進化與穩定性澄清一個事實：定向進化澄清一個事實：定向進化不是不是定點突變定點突變定向進化：突變定向進化：突變 篩選篩選 突變位點是隨機的，不確定的；突變位點是隨機的，不確定的； 突變位點的數目也是不確定的；突變位點的數目也是不確定的； 突變的效應更是不可預知的；突變的效應更是不可預知的； 理論上講，凡是能夠引起突變的因素（物理的，化學的，理論上講，凡是能夠引起突變的因素（物理的，化學的， 生物的）都可以應用于定向進化中突變體的產生。生物的）都可以應用于定向進化中突變體

4、的產生。定點突變：定點突變： 突變位點是確定的，突變的個數也是預知的；突變位點是確定的，突變的個數也是預知的； 突變的效應可能是已知的，也可能是未知的；突變的效應可能是已知的，也可能是未知的； 定點突變的方法一般是以定點突變的方法一般是以PCRPCR技術為基礎的。技術為基礎的。部分酶的定向進化與穩定性三定向進化的選擇策略l關鍵突變和篩選l突變采用回交法l篩選蛋白酶選擇平板初選，配合活性染色和X光片消化分析部分酶的定向進化與穩定性DNA shuffling部分酶的定向進化與穩定性體體外外定定向向進進化化部分酶的定向進化與穩定性部分酶的定向進化與穩定性Increasing the ee-value

5、 of the lipase-Increasing the ee-value of the lipase-catalyed hydrolysis of the chiral estercatalyed hydrolysis of the chiral ester2%2%31%31%57%57%75%75%81%81%0%0%0 01 12 23 34 4mutant generationsmutant generations%ee%ee部分酶的定向進化與穩定性部分酶的定向進化與穩定性部分酶的定向進化與穩定性成功實例成功實例Lipase genes (Lipase genes (lipB52,

6、lipB68lipB52, lipB68) isolated from ) isolated from Pseudomonas Pseudomonas fluorescensfluorescens B52 B52、B68B68Genbank Accssion number AY623009Genbank Accssion number AY623009、AY694785AY694785部分酶的定向進化與穩定性成功實例成功實例 Lipase gene (Lipase gene (lipB52lipB52）expressed expressed in Pichia pastoris KM71KM7

7、1 Zhengbing Jiang, Yitao zheng, Yu Luo, Gang Wang, Hongping Wang, Yushu Ma and Dongzhi Wei*. Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From Pseudomonas fluorescens B52. Molecular Biotechnology. 2005 ( 31), 095-102. SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purificationfunctional lipase secre

8、ted by Recombinants screened with BMMY plates部分酶的定向進化與穩定性Enantioselective esterification of R-phenylethanol,S-phenylethnol remained at its original formeep98.7% and conversion 48.1% at 40oC for 48 hours.Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52部分酶的定向進化與穩定性Transesterification between soybean oil

9、and methanol.Conversion 90% at 40oC for 35 hoursProduction of Biodiesel via Transesterification Catalyzed by Lipase B52部分酶的定向進化與穩定性Characterization of a psychrophilic lipase Characterization of a psychrophilic lipase from from Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens strain B68strain B68p-nit

10、rophenyl caprate as substrate.Optimal temperature as 20C ，50% activity at 0C。0%20%40%60%80%100%120%010 20 30 40 50 60 70Temperature (C)Relative Activity (%)Hydrolyzation activity of lipase lipB68 部分酶的定向進化與穩定性Chiral selectivity of lipB68 ROHOOROHROO+lipase lipB68R=CH3, and CH2CH3Model Reaction：Chiral

11、 resolution of -phenylethanol and -phenylpropanol via esterification.Reaction system contained: 0.5mmol of racemic -phenylethanol or -phenylpropanol dissolved in 10ml toluene containing 1mmol of vinyl acetate, with 0.5g immobilized enzyme added. Samples taken at 120hour and subjected to GC analysis.

12、 部分酶的定向進化與穩定性Production of Biodiesel Production of Biodiesel viavia Transesterification Catalyzed by Transesterification Catalyzed by Lipase B68Lipase B68Yield to 92% at 20 C and 24 hours with immobilized lipB68.The lowest temperature reported previously.Production of biodiesel from soybean oil by i

13、mmobilized lipB68部分酶的定向進化與穩定性Lipase R&D from uncultured microorganismLipase R&D from uncultured microorganism Lipase genes ( Lipase genes (lipJ02, lipJ03lipJ02, lipJ03) isolated from ) isolated from environmental sampleenvironmental sampleCloned with Genome-Walking. Genbank Accssion number A

14、Y673674、AY700013部分酶的定向進化與穩定性Lipase R&D from uncultured microorganism Lipase R&D from uncultured microorganism Lipase genes ( Lipase genes (lipJ02, lipJ03lipJ02, lipJ03) ) expressed in Pichia expressed in Pichia pastoris KM71pastoris KM71Zhengbing Jiang, Dongzhi Wei* et al., Applied Microbiol

15、ogy and Biotechnology, 2006, Online First. Functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY platesSDS-PAGE analysis of lipase on expression and purified部分酶的定向進化與穩定性Prodrugs of ibuprofenNHHNHClOOOOOMeOOONOHOHONHAcOHOHNOOHOHOOHOHOOOHOHOOHOOHOHNOROOOAcOAcOOAcOOAcOHO部分酶的定向進化與穩定性Synthesis of

16、 ibuprofen glucopyranside derivative OHOHOOOHOHOHOabOOHOHOOOHOOOHOHOOOHOH2OcdEnzymeSolvent(a) methyl -D-glucopyranoside, (b) ibuprofen, (c) 6-O-(2R -(4-isobutylphenyl) propionyl) -D-glucopyranoside (d) 6-O-(2S-(4-isobutylphenyl) propionyl) -D-glucopyranoside Xiang-Guo Zhao, Dong-Zhi Wei*, A facile e

17、nzymatic process for the preparation of ibuprofen ester prodrug in organic media J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,2005, 36:47-53.部分酶的定向進化與穩定性Dongzhi WeiDongzhi Wei*, Ping Zou, J. Molecular J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,Catalysis B: Enzymatic, 2002,18:273-278. 部分酶的定向進化與穩定性Wei Dongzhi*, Yu yi

18、ng, Biocatalysis and Biotransformation, 2003,21(3)135-139. Enzymatic Synthesis of Ethyl-glucoside Monooleate with Lipase in Solvent-free Medium部分酶的定向進化與穩定性 Qingxun Song, Dongzhi Wei*, J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,2002,18:261-266.Qing-Xun Song, Dong-Zhi Wei*, et al., Biotechnology Letters, 200

19、4, 26(23): 1777 - 1780. Qingxun Song, Dongzhi Wei*, et al., Bioprocess and Biosystems Engineering, 2006, Online first. Studies of Vitamin ester synthesis by immobilized lipase from Candida sp.部分酶的定向進化與穩定性四雜合酶來自不同酶分子中的結構單元或是整個酶分子進行組合或交換，以產生具有所需性質的優化酶雜合體。 部分酶的定向進化與穩定性第一節結束點擊返回部分酶的定向進化與穩定性第二節第二節 定向進化的應

20、用定向進化的應用一提高酶分子的催化活力二提高酶分子的穩定性三提高底物的專一性和增加對新底物催化活力的進化五對映體選擇性的定向進化六變換催化反應專一性部分酶的定向進化與穩定性一提高酶分子的催化活力L天冬氨酸酶定向進化研究l進行4輪易錯PCR，篩選了3000個菌落。l得到酶活力提高28倍的突變體，該酶的pH穩定性和熱穩定性均優于天然酶部分酶的定向進化與穩定性二提高酶分子的穩定性T4溶菌酶11個不同的單點突變株將Tm提高0.8-1.4.8株大腸桿菌核酸酶HI單點突變中，7株Tm提高了0.7-4.2部分酶的定向進化與穩定性三提高底物的專一性和增加對新底物催化活力的進化Gulick分離到了一株谷胱苷肽轉硫酶，對于癌癥治療中烷化劑的耐受力提高了9倍Widersten利用噬菌體呈現技術來增加谷胱苷肽轉移酶與親電底物結合力，沒有成功 部分酶的定向進化與穩定性四對映體選擇性的定向進化S型選擇性的轉氨酶轉化-丁酮，僅有65%的手性專一性。通過10 000個隨機突變的菌株的篩選，獲得10個手性專一性在80%-94%之間的酶 部分酶的定向進化與穩定性五變換催化反應專一性來源于銅綠假單胞菌的脂肪酶對于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸鹽的S構型的選擇性2%。經過4輪易錯PCR突變和篩