1、引物設計一、軟件使用：l 推薦軟件：Primer Premier 5.0 l 優點：操作簡單、顯示各種參數改變和可能的二聚體、異二聚體、發夾結構等l 缺點：沒有明顯缺點 l 本地同類軟件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar；DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada).l 網上同類軟件：Primer3（Whitehead Institute 開發）；JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 開發）。http:/2

2、0網站已引進并調試好這兩種軟件。獨特之處在于：對全基因組PCR的引物設計，可以將設計好的引物對后臺核酸數據庫進行比對，發現并排除引發錯配的引物。因此建議經常做全基因組PCR的用戶試用。二、推薦操作：l 引物搜索：Primer Premier 5.0l 引物評價：Oligo 6.22三、引物設計的原則:首先引物要跟模板緊密結合，其次引物與引物之間不能有穩定的二聚體或發夾結構存在，再次引物不能在別的非目的位點引起DNA聚合反應（即錯配）。圍繞這幾條基本原則，設計引物需要考慮諸多因素，如引物長度（primer length）、產物長度（product length）、序列Tm值(

3、melting temperature)、G值(internal stability)、引物二聚體及發夾結構（duplex formation and hairpin）、錯誤引發位點（false priming site）、引物及產物GC 含量（composition），有時還要對引物進行修飾，如增加限制酶切點，引進突變等。以使用Oligo 軟件分析設計引物為例，筆者總結出以下的要點：1. 引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74，即Taq 酶的最適溫度。2. 引物3端的序列要比5端重要。引物3端的堿基一般不用A（3端堿基序列最好

4、是G、C、CG、GC），因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高。另外引物間3端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。5端序列對PCR 影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。3. 引物的GC含量一般為40-60%，以45-55為宜，過高或過低都不利于引發反應。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5端增加As或Ts；而如果A-T比例過高，則同樣在5端增加Gs或Cs。但也有認為：原來普遍認為PCR引物

5、應當有50%的GC/AT比率的觀點其實是不對的，以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物可以產生單一的、專一的、長250 bp，含有70% AT的產物。完全沒有必要復雜地去計算產物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應當等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。4. 引物所對應模板序列的Tm 值最好在72左右。（Tm 值曲線以選取72 度附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發聚合反應），至少要在5580之間5. G值(自由能)反映了引物與模板結合的強弱程度。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對較低，且不要超過9（G值為負值，這里取絕對值），

6、如此則有利于正確引發反應而可防止錯誤引發。3末端雙鏈的G是02 kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產量逐漸下降，在6時只有40%、到8時少于20%、而10時接近于0。6. 可能的錯誤引發位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發率高，錯誤引發的引發率一般不要高過100，如此可保證不出非目的產物的假帶。但對于特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發效率為450 以上，而在錯誤位點的引發效率為130，并且不好找其他更合適的引物，那么這對引物也是可以接受的。7. Frq 曲線為Oligo6新引進的

7、一個指標，揭示了序列片斷存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用Frq 值相對較低的片斷。8. 引物二聚體及發夾結構的能量一般不要超過4.5，否則容易產生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導致PCR 正常反應不能進行，與二聚體相關的一個參數是堿基的分布，3端的連續GGG 或CCC 會導致錯誤引發。二聚體形成的能值越高越穩定，越不符合要求。與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。雖然有些帶有發夾環，其G為3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結果，但是如果它的3末端被發夾環占據時就很麻煩，即會引發引物內部的延伸反應，減少了參與正式反應引物的數量。當然，如果發夾環在5末端對反應就沒有多大的

8、影響了。9. 以公式(4×G/C + 2×A/T5)計算Tm值，即退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應的退火溫度。4-6的差別似乎對PCR產量影響不大。最好，保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75范圍內10. 要知道，更重要的因素是模板與穩定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因為DNA的解鏈溫度也取決于它的長度，所以有的研究者喜歡設計很長，而不求它很穩定的引物。可是，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補，因此，一般還是不用為好。如果期待的產物長度等于或小于500 bp，選用短的(1618 mer)的引物：若產物長5 kb，則用24

9、mer的引物。有人用2023 mer引物得到40 kb的產物。11. 在DNA測序和PCR中最好用5末端穩定(如GC含量較多)，而3末端不太穩定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發反應。這就是基于引物內部穩定性的經驗之談。其3末端穩定性低的引物在這些反應中能起好作用的原因在于，接近或在3末端上的堿基與非靶位點堿基所形成的配對的穩定程度還不足以引發DNA合成，所以不會產生假產物。因此，為了有效地引發反應，引物的5末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩定的、GC豐富的3末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3末端與靶序列任何位點的牢

10、固配合就可以引發反應，產生非專一產物。無論如何，寡核苷酸3末端最后5個核苷酸的穩定性小于9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3末端越不穩定，假引發的可能性越低。12. 如果用3末端低穩定性的引物，反應的最適退火溫度范圍會不尋常的寬。這就可以不經過事先的最佳化實驗就能在最佳條件下進行反應。13. 引物的唯一性：為了放大單個的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應當是唯一的，即在模板中沒有重復序列。如果用哺乳動物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復元件來核對想用的引物的互補性。由此也可知，應當避免使用同寡聚物(如AAAAAA)和二核苷酸重復(如ATATAT)。1

11、4. 引物和產物的Tm值不要相差太大，20攝氏度范圍內較好。定下引物的Tm值范圍之后即可定下引物的長度范圍。15. 對引物的修飾一般是增加酶切位點，應參考載體的限制酶識別序列確定，常常對上下游引物修飾的序列選用不同限制酶的識別序列，以有利于以后的工作。16. 值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件較差，比如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；有時PCR產物要作為克隆對象插入到載體中表達，因此PCR引物設計的可選擇度很低。遇到這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件，這時，使用自動搜索引物及正確地評價引物可使研究人員對實驗心中有數。17. 在設計克隆PCR引

12、物時，引物兩端一般都添加酶切點，必然存在發夾結構，而且能值不會太低，這種PCR需要靈活調控退火溫度以達到最好效果，對引物的發夾結構的檢測就不應要求太高。18. 如擴增出多條帶（引發錯配所致），不出目的帶或出目的帶很弱（引物引發效率低下）四、Oligo 6.22使用技巧1. Oligo的主要功能集中在Analyze 菜單里，只要把它弄懂了，其他的就很簡單了2. Frq為6.22的新功能，為鄰近67個堿基組成的亞單位在一個指定數據庫文件中的出現頻率。該頻率高則可增加錯誤引發的可能性3. 因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade 排列方式不太方便，可從windows 菜單改為tili 方式4

13、. 當結束檢測，按Alt+P鍵就出來PCR窗口，其中總結性地給出該引物的位置、產物大小、Tm值等參數，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評價。五、G概念：用于估測可能形成DNA或RNA雙鏈的穩定性：在一個雙鏈結構中，堿基對的相對穩定性是由其鄰近堿基決定的。在熱動力學中，這樣的性質以雙鏈形成時的自由能(G)來表示。現在大多采用 Breslauer等人提出的以最接近的相鄰核苷酸的動力學數值(自由能)來預測雙鏈穩定性的方法。為簡化起見，所有的計算都在25 條件下進行。此時，最接近的相鄰核苷酸的自由能是：第一個(5)核苷酸 第二個核苷酸 dA dC dG dT dA 1.9 1.3 1.6

14、1.5 dC 1.9 3.1 3.6 1.6 dG 1.6 3.1 3.1 1.3 dT 1.0 1.6 1.9 1.9                            G(kcal/mol) 如：雙鏈d(ACGGCCGT)的G是：G(ACGG)G(AC)G(CG)G(GG)()8.0 kcal/mol此計算方法特別適用于測

15、定其3末端會形成雙鏈的引物的相容性。也可以用來計算發夾環結構的G。不過，這時需要根據環區內核苷酸的數量添加一定的數值。如3個核苷酸時為5.2 kcal/mol；4個時為4.5；5個為4.4；6個是4.3；7和8個為4.1 kcalmo1。六、按照氨基酸序列設計寡核苷酸：按照多肽的氨基酸序列來設計PCR引物或雜交探針是最常用的實驗手段，尤其是在試圖“釣取”一個蛋白質的基因時。此時要注意的問題有：   (1) 寧可用簡并引物，也不用猜測的引物。氨基酸密碼子的簡并性給予引物設計以可塑性，這比用猜測的密碼子要好得多。有人用1 024個簡并引物得到很好的結果。但是，應當避免在一個區域

16、內有很高的簡并性。但也有簡并性低使引物不工作的報道。    (2) 引物與模板的錯配。一般認為，所用引物與模板有15%20%的錯配，PCR的效果還能接受。但是，引物3末端的錯配比同樣錯配率的5末端錯配會引起更嚴重的問題。在最后4個堿基中有2個錯配的引物，其PCR產量急劇下降。但是，當核苷酸濃度高時，3末端有錯配的引物還能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8mmol/L時，大多數3末端錯配引物可以接受，雖然非專一產物比較多，DNA合成的忠實性也下降。即使在低核苷濃度下，還會有少量從錯配堿基出發的合成，因此，在開始的PCR循環中把退火時間增加到35分鐘，比之于用標準退火

17、時間和高濃度核苷酸能夠產生質量更好的所求產物。   (3) 在用唯一性引物時，建議用0.2 mmol/L或更低的總核苷酸濃度，因為高濃度會增加錯誤參入的比率。    (4) 簡并寡核苷酸時，PCR應當在比較高的引物濃度下進行，即13 mol/L而不是0.2 mol/L，因為在反應混合物中的大多數寡聚物并不是被用來引發專一的反應，而只是產生高的背景而已。七、復雜模板的擴增體系：所謂復雜模板，是指體系中的DNA種類和數量較多，不能以此引物對所有的模板一一比較來計算其異位引發的可能性的情形。此情形下與簡單模板擴增相比較，還需要遵循下面一些原則以盡可能

18、的避免異位擴增。 1. 引物3末端的穩定性。引物3末端的穩定性由引物3末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的G。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3末端穩定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發。因此在復雜模板的擴增體系中，3末端5聚體的G應大于-9.0kcal/mol。2. 堿基組成應盡量隨機分布，避免單一堿基的聚集。這樣可避免引物在模板的單一堿基富集區引發擴增反應。3. 引物3末端應盡量避免T，相較而言，3末端的T對于此處的錯配更為寬容。 八、測序引物設計時的注意點：1. 對特異性的標準掌握更嚴格一些，也比普通PCR引物設計時更優先考慮特異性。因為如果在測序反應中，如果引物與模

19、板在非預期位置退火并引發鏈延伸，會對結果對來很大的干擾甚至造成結果無法識讀。 2. Tm值適當高一些。現在大部分測序反應均選用耐熱的測序級DNA聚合酶來催化，并采用PCR的熱循環程序。選用Tm值稍高一些，甚至退火溫度接近酶的最佳延伸溫度的引物，有助于使反應順利跨過待測模板的二級結構區，也有助于降低非特異反應。 九、關于引物5端引入限制性內切酶位點：自從發現 Taq 酶具有非模板依賴的在新生成DNA鏈的3末端加上一個A的特性以來，在引物5端引入酶切位點從而方便后續克隆步驟的方法的應用大大減少，取而代之的是利用帶T載體的粘端連接來包裝PCR產物。若實驗需要在引物5端引入相關酶切位點時，除了需要清楚

20、所選用的酶的識別序列之外，還需要了解此酶是否有位點優勢效應，即酶的活性是否因為識別位點在序列的不同位置而不同，并根據此點來選擇5末端的保護堿基。此外保護堿基的另外一個作用就是保護酶切位點不被Taq 酶具有的微弱的53外切酶活性破壞。 十、簡并引物的設計：l 概念：簡并引物的出現是出于遺傳密碼的簡并性。有時需要根據一段氨基酸的保守序列反推到DNA 水平設計引物。眾所周知，大多數氨基酸（二十種常見結構氨基酸中的十八種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時，就遇到部分堿基的不確定性。這種不確定性因物種或細胞亞結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的，甚至植物線粒

21、體與無脊椎動物線粒體以及無脊椎動物線粒體的遺傳密碼都不盡相同。Premier 可以針對各種不同的遺傳密碼規律設定不同的DNA 和氨基酸的相互轉換，這取決于被分析序列的出處。這樣設計出來的引物實際上是多種序列的混和物，在某些位點有所變化，但大部分還是相同的，稱之為簡并引物。Primier 軟件給出八種生物亞結構的不同遺傳密碼規則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear），無脊椎動物線粒體（Invertebrate Mitochondrion），支原體（Mycoplasma），植物線粒體（Plant Mitochondrion），原生動物線粒體（Protozoan Mit

22、ochondrion），一般標準（Standard），脊椎動物線粒體（Vertebrate Mitochondrion），和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。l 概念：簡并引物是根據某些特定的目的而選用的一組混合物，指在寡核甘酸的某一位置（一個簡并位）上有多個堿基存在于不同的寡核甘酸分子中，如一組簡并引物中有N1，N2，N3三個簡并位，在N1上有三個堿基簡并，N2二個，N3 四個，則此簡并引物中共有3*2*4=24種寡核甘酸分子。 l 簡并引物常用的幾個方面： （1）從已知蛋白到相關核酸分子的研究；（2）用一組引物擴增一類分子。 l 在上述兩個主要應用中，需要注意的幾個主要

23、問題： u 從蛋白到核酸，應注意： 1) 盡量選擇簡并度低的氨基酸區域為引物設計區。如蛋氨酸和色氨酸均只有一個密碼子。 2) 充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。 3) 引物不要終止于簡并堿基，對于大多數氨基酸殘基來說，意味著引物3末端不要位于密碼子的第三位。 4) 在簡并度高的位置，可用次黃嘌呤（dI）代替簡并堿基。 5) 以上幾點，遵循的總的原則為：盡量降低引物的簡并度，尤其在3末端或近3末端。 u 用一對簡并引物擴增一類DNA分子時，同樣遵循上述總的原則，即盡量降低引物的簡并度，尤其在3末端或近3末端。 在此種應用中，應先利用工具軟件（多序列

24、對準比較軟件）或其它工具找到這些分子的保守區，然后根據共有序列，應用上面所述的一些原則來設計所需要的引物。Degenerate Primers For amplification of cognate sequences from different organisms, or for "evolutionary PCR", one may increase the chances of getting product by designing "degenerate" primers: these would in fact be a set of p

25、rimers which have a number of options at several positions in the sequence so as to allow annealing to and amplification of a variety of related sequences. For example, Compton (1990) describes using 14-mer primer sets with 4 and 5 degeneracies as forward and reverse primers, respectively, for the a

26、mplification of glycoprotein B (gB) from related herpesviruses. The reverse primer sequence was as follows: TCGAATTCNCCYAAYTGNCCNT where Y = T + C, and N = A + G + C + T, and the 8-base 5'-terminal extension comprises a EcoRI site (underlined) and flanking spacer to ensure the restriction enzyme

27、 can cut the product (the New England Biolabs catalogue gives a good list of which enzymes require how long a flanking sequence in order to cut stub ends). Degeneracies obviously reduce the specificity of the primer(s), meaning mismatch opportunities are greater, and background noise increases; also

28、, increased degeneracy means concentration of the individual primers decreases; thus, greater than 512-fold degeneracy should be avoided. However, I have used primers with as high as 256- and 1024-fold degeneracy for the successful amplification and subsequent direct sequencing of a wide range of Ma

29、streviruses against a background of maize genomic DNA (Rybicki and Hughes, 1990). Primer sequences were derived from multiple sequence alignments; the mismatch positions were used as 4-base degeneracies for the primers (shown as stars; 5 in F and 4 in R), as shown above.  Despite their degenera

30、cy, the primers could be used to amplify a 250 bp sequence from viruses differing in sequence by as much as 50% over the target sequence, and 60% overall.  They could also be used to very sensitively detect the presence of Maize streak virus DNA against a background of maize genomic DNA, at dil

31、utions as low as 1/109 infected sap / healthy sap (see below). Some groups use deoxyinosine (dI) at degenerate positions rather than use mixed oligos: this base-pairs with any other base, effectively giving a four-fold degeneracy at any postion in the oligo where it is present. This lessens problems

32、 to do with depletion of specific single oligos in a highly degenerate mixture, but may result in too high a degeneracy where there are 4 or more dIs in an oligo. 十一、克隆PCR引物的設計General guidelines on the primer design for PCR cloning1. Complementary sequence of 18-20 bases is sufficient in most cases

33、if you don't bother to calculate Tm (see links below if you want to calculate Tm). 2. If your protein is not fused to anything, you should add a start codon (ATG) immediately in front of your gene in the forward primer, and the complement of a stop codon (TAA/TGA/TAG - TAA is preferred) immediat

34、ely after in your reverse primer. 3. Introduce one or more restriction sites depending on how you wish to ligate the gene into the expression vector - e.g. if you use pET 21b, use NdeI (conveniently containing the start codon) for the forward primer, and XhoI for the reverse primer if you wish to fu

35、se the protein to a C-terminal His-tag. Make sure that the restriction sites chosen are absent in the gene. 4. Put in extra bases at the 5'end to allow for efficient digest by restriction enzymes - consult NEB catalog . 8-10 are more than sufficient in most if not all cases (it's actually a

36、bit of overkill as 3-4 are suitable for most). These extra bases are unnecessary if you are doing TA cloning. 5. Two or more of these extra bases can form a GC clamp at the 5'end. 6. Avoid too many G or C at the 3'end. 7. Avoid long runs of single nucleotide. 8. Make sure the forward and rev

37、erse primer don't form primer dimer (esp. no complementary sequences at the 3' end) or form significant secondary structure. See Alkami Biosystem Primer Design online for primer design sites. 9. It may be useful (though normally unnecessary) to check sequences of gene or vector for homology

38、of 70% or more with the primer to avoid multiple PCR products. The above guidelines should be sufficient in most cases, but if you'd like more details, see tips on primer design , notes on primer design, Tavi's PCR guide, and Primer design workshop. There are also a number of web-sites for p

39、rimer design at Alkami Biosystems and at BioGuide.ExampleN can be any of the 4 nucleotides, therefore Forward oligo5' GGCGCAATACATATGAGAGACAGTGGGACCGTCTG 3'Reverse oligo5' GGCCGAACTCGAGTTACTCTAGAATCCTCAAGTCCA 3'(sequence complement to the sense strand) Note:1) If the N-terminus of yo

40、ur protein is not fused to any fusion partner or peptide, it is often useful to change wherever possible G or C to A or T for the first few codon. This will help reduce secondary structure on the translation initiation site and therefore improve expression.2) Although we need not consider designing

41、degenerate primer, but should the need arise, see degenerate PCR for guidance.十二、巢式PCR引物This gel photo shows the effect of nested PCR amplification on the detectability of Chicken anaemia virus (CAV) DNA in a dilution series: the PCR1 just detects 1000 template molecules; PCR2 amplifies 1 template m

42、olecule (Soin?C, Watson SK, Rybicki EP, Lucio B, Nordgren RM, Parrish CR, Schat KA (1993)  Avian Dis 37: 467-476). 十三、cDNA PCRA very useful primer for cDNA synthesis and cDNA PCR comes from a sequencing strategy described by Thweatt et al. (1990): this utilised a mixture of three 21-mer primers

43、 consisting of 20 T residues with 3'-terminal A, G or C, respectively, to sequence inside the poly(A) region of cDNA clones of mRNA from eukaryotic origin. I have used it to amplify discrete bands from a variety of poly(A)+ virus RNAs, with only a single specific degenerate primer upstream: the

44、T-primer may anneal anywhere in the poly(A) region, but only molecules which anneal at the beginning of the poly(A) tail, and whose 3'-most base is complementary to the base next to the beginning of the tail, will be extended. eg: 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(A,G,C)-3' works for amplific

45、ation of Potyvirus RNA, and eukaryotic mRNA 十四、PCR部分注意事項l A more rigorous treatment of Ta is given by Rychlik et al. (1990): they maintain that if the Ta is increased by 1oC every other cycle, specificity of amplification and yield of products <1kb in length are both increased. Plasmid and biopsy sample DN