1、垂盆草醇提物對人肝癌細胞HepG2的抑制作用及其機制初探【摘要】 目的： 觀察垂盆草醇提物(CCW)對人肝癌細胞HepG2生長及其腫瘤相關分子指標的影響。方法： MTT法測定CCW對 HepG2細胞增殖的作用;流式細胞術觀察細胞周期的改變;分別用RTPCR及免疫細胞化學法檢測CCW對VEGF、cMyc基因及蛋白水平的影響。結果： HepG2細胞的增殖在CCW作用的第24、48和72 h均被顯著地抑制;CCW(100、200 g·ml-1)可使HepG2細胞阻滯于G0/G1期;CCW可顯著下調VEGF、cMyc的mRNA及蛋白水平的表達。結論： CCW對HepG2細胞增殖具有明顯的抑制

2、作用，并且能阻止細胞進入G2/M期，這可能與cMyc基因表達的下調密切相關;CCW能抑制HepG2細胞的VEGF分泌，初步推測CCW具有抗血管生成作用。 【關鍵詞】 垂盆草; 肝癌; 抗增殖; 細胞周期; 抗血管生成垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge)又稱臥莖景天，系景天科多年生草本植物，分布于全國大部分地區。垂盆草主要含有垂盆草苷類、黃酮類、三萜類、甾醇、生物堿及糖類。此藥性涼，味甘、淡，新鮮或干燥全草入藥，主要用于治療濕熱黃疽、小便不利、癰腫瘡瘍，并且具有抑制炎性滲出，減少肝細胞損傷，降低血清丙基酸氨基轉移酶水平，治療急、慢性肝炎等功效1。近年來，國內外大量研究表明，慢

3、性病毒性肝炎與肝癌(hepatocellular carcinoma)的發生有著密切的聯系23，一些傳統中草藥中的黃酮、生物堿及多糖等成分在抗腫瘤、延長患者生命等方面有著獨特的生物活性，不僅能夠抑制腫瘤細胞增殖，還能有效抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)和原癌基因cMyc的表達47，而VEGF和cMyc在肝癌的形成、生長、浸潤、轉移過程中均發揮著重要的作用8。因此，本研究著重觀察垂盆草醇提物(CCW)對人肝癌細胞 HepG2生長及腫瘤相關基因VEGF和cMyc表達的影響。1 材料與方法1.1 材料垂盆草購于江蘇省藥材公司。M

4、TT、蛋白酶(Sigma公司)，RPMI 1640培養基(Invitrogen公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Biozol RNA提取劑(BioFlux公司)，MMLV 酶、Taq DNA聚合酶(Promega公司)，VEGF、cMyc 和actin引物由Invitrogen Biotechnology Co., Ltd.(上海)合成，兔抗人VEGF、cMyc抗體、生物素化羊抗兔IgG、SABC試劑盒、DAB檢驗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，其余試劑均為國產分析純。CO2培養箱MCO15AC(Sanyo公司)，真空冷凍干燥機(Matin Christ公司)，酶標儀(

5、BioTek公司)，PTC200 PCR 儀(BioRad公司)，Gel Doc EQ圖像分析儀(BioRad公司)，FACS Calibur 流式細胞儀 (BectonDickson公司)。1.2 方法1.2.1 垂盆草醇提物的制備 垂盆草干草500 g，于95%的乙醇5 000 ml中浸泡5 d，紗布過濾，收集藥液。重復2次，合并藥液，離心取上清，所得上清液經減壓蒸發揮去溶劑，再用石油醚經索氏提取法去除脂類，揮去石油醚,再用甲醇溶解，減壓蒸干得醇提物。1.2.2 細胞培養 人肝癌細胞 HepG2于含10%小牛血清、青霉素100 U·ml-1、鏈霉素150 g·ml-1的

6、RPMI 1640培養液，在37 、5%CO2培養箱中培養。1.2.3 細胞增殖能力的檢測 將腫瘤細胞培養至對數生長期，計數，調整細胞濃度為1×105ml-1，接種于96孔板，80 l·孔-1，3 h貼壁后加入終質量濃度分別為 25、50、100、200 g·ml-1的CCW，同時設0. 1 %DMSO對照組，每組設6個平行孔，將培養板置5%CO2、37 培養箱中培養24、48、72 h后MTT法檢測9。1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期細胞調成濃度為2×105 ml-1，300 l·孔-1接種于24孔培養板中，細胞貼壁后加入質量

7、濃度分別為50、100、200 g·ml-1的CCW，對照組加含0.1%DMSO的同體積培養液，設4個復孔。分別收集對照組和醇提物各劑量作用48 h后的HepG2細胞1×106個，70 %乙醇4 固定過夜，PBS清洗，加入含2 %TritonX100、50 g·ml-1 RNase A的PI溶液，4 避光染色30 min, 上機檢測2×104個細胞，用WinMDI分析軟件分析結果。1.2.5 RTPCR檢測肝癌細胞的VEGF和cMyc的mRNA水平 用Biozol試劑分別提取各組HepG2 細胞的總RNA，得到白色沉淀,加入1DEPC水30 l至RNA完

8、全溶解并測定RNA的濃度和純度。取各組總RNA各2 g分別進行逆轉錄合成cDNA 。PCR反應體系總體積為25 l，其中含cDNA 1 l，10×buffer 2.5 l、MgCl2(25 mmol·L-1)2 l、dNTP(10 mmol·L-1)0.4 l、引物0.8 l、Taq DNA聚合酶(1 U·L-1)1 l。VEGF、cMyc和內參actin基因引物序列分別參照有關文獻1012。94 預變性5 min;然后94 30 s變性、58 40 s退火、72 30 s延伸，共30個循環;最后72 延伸7 min。1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分

9、析儀分析結果。1.2.6 免疫細胞化學法檢測VEGF、cMyc蛋白表達 將HepG2細胞貼壁于預先置于6孔板的蓋玻片上，加入不同質量濃度(25、50、100、200 g·ml-1)CCW，用含0. 1 %DMSO的培養液作為對照，37 、5%CO2培養48 h后取出玻片，PBS清洗標本2次，80%丙酮醇4 固定15 min，染色步驟按SABC試劑盒說明書操作，PBS代替一抗作陰性對照。染色結果以細胞漿或核出現棕黃色高出背景的細胞為陽性細胞,每組隨機選取10個高倍視野，計算每組的陽性細胞率(陽性細胞數占視野內總細胞數的百分比)。1.3 統計學處理采用SPSS10.0軟件進行統計學分析,

10、實驗數據以x-±s表示, F檢驗方差齊性后 t檢驗進行組間比較,P<0.05為差異具有統計學意義。2 結 果2.1 CCW對 HepG2 細胞增殖的影響CCW對 HepG2的增殖抑制效果隨著藥物作用時間的延長而逐漸增強，在作用24 h和48 h后，最高濃度組抑制作用具有統計學意義(P<0.05)，隨著藥物作用時間的增加，在72 h各濃度組均有明顯的抑制增殖作用(P<0.001)。見表1。表1 CCW對肝癌細胞HepG2增殖的影響Tab 1 Inhibitory effects of CCW on the proliferation2.2 CC

11、W對肝癌細胞增殖周期的影響CCW作用于HepG2細胞48 h后，PI單染后經流式細胞儀進行細胞周期分析(圖1)。結果顯示，100、200 g·ml-1CCW能夠有效阻滯腫瘤細胞于G0/G1期分別為(67.39±1.97)%、(70.45±1.23)%，降低進入G2/M 期細胞的數量分別為(15.46±2.7)%、(14.20±1.41)%，與對照組G0/G1期為(60.37±2.7)%、G2/M 期(20.45±2.32)%相比，差異具有統計學意義(100 g·ml-1， P<0.05;200 g&#

12、183;ml-1，P<0.01。n= 4)。2.3 CCW對HepG2 細胞VEGF、cMyc mRNA表達的影響采用RTPCR法檢測VEGF、cMyc的mRNA表達，經擴增的產物VEGF、cMyc和actin的相對分子質量分別為212、200 和 389 bp(圖2A)，與內參actin相比，各組相對光密度比值見圖2B，100、200 g·ml-1CCW處理組VEGF mRNA表達較對照組均明顯降低，均具有統計學意義(100 g·ml-1，P<0.01;200 g·ml-1，P<0.001)。100、200 g·

13、;ml-1CCW處理組cMyc mRNA表達較對照組明顯降低，均具有統計學意義(100 g·ml-1，P<0.05;200 g·ml-1，P<0.001)。2.4 CCW對VEGF和cMyc蛋白表達的影響細胞漿或核有棕黃色或棕褐色顆粒著色為陽性特征。未加藥對照組細胞中表達較強，VEGF和cMyc陽性細胞率分別為(35.78±3.90)%和(43.21±8.37)%。在質量濃度100、200 g·ml-1的CCW作用48 h后，VEGF 陽性細胞率分別為(24.15±1.93)%和(14.48±2.

14、83)%，cMyc陽性細胞率分別為(28.67±5.65)%和(27.99±3.34)%，與對照組相比，均具有統計學意義(P<0.001)。見圖3。A. 對照組;B.50 g·ml-1組;C.100 g·ml-1 組;D.200 g·ml-1組3 討 論近年來，從祖國傳統醫藥寶庫中發掘新的抗癌藥物已經成為腫瘤治療的研究熱點之一，并且這些新的抗癌藥物在臨床中的應用也取得了可喜的進展。垂盆草作為一種重要的藥用植物資源，在民間被用于治療咽喉腫痛、水火燙傷、蛇蟲咬傷等已有多年的歷史，此外，據文獻報道垂盆草還具有免疫抑制作用13、雌激素樣作

15、用14、血管緊張素轉化酶抑制作用15等，然而，它最重要的一個功效就是能夠降低血清丙氨酸氨基轉移酶水平，抑制炎性滲出，減少肝細胞的損傷，所以在臨床上被廣泛用于治療各型慢性病毒性肝炎16。眾所周知，慢性病毒性肝炎是肝癌發生的重要危險因素17，鑒于慢性病毒性肝炎與肝癌的密切關系以及垂盆草在治療慢性病毒性肝炎中的療效，本實驗采用垂盆草醇提物對肝癌細胞HepG2進行干預，結果顯示CCW可明顯阻止細胞進入G2/M 期，使其停留在靜止期，抑制HepG2的生長。AE.CCW作用質量濃度分別為0、25、50、100、200 g·ml-1時VEGF的表達;FJ.CCW作用質量濃度分別為0、25、50、1

16、00、200 g·ml-1時cMyc的表達圖3 免疫細胞化學檢測HepG2細胞VEGF和cMyc蛋白的表達 ×200Fig 3 Immunocytochemical detection of VEGF and cMyc in HepG2 cells (×200)cMyc作為一種廣泛存在的轉錄調節因子參與了許多基因表達的調控，與細胞的增殖、生長、分化、凋亡、新陳代謝以及腫瘤的形成有密切的關系18。該基因位于染色體8q24 上，一方面通過染色體易位與免疫球蛋白輕鏈序列融合而被激活，另一方面通過DNA 擴增導致功能失常，其編碼的蛋白質能與核內的DNA 特異結合行使轉錄調

17、節功能。cMyc在細胞靜止期不表達，而在有絲分裂原作用下迅速表達，促使細胞增殖、浸潤，最終使細胞增殖異常而癌變。過度表達的cMyc原癌基因在腫瘤細胞周期調控中扮演著重要的角色19。它能導致CDK抑制因子(KIP1)從原本無活性的cyclin ECDK2KIP1復合體中解離出來，使此復合物被磷酸化而獲得活性，促進細胞從G0/G1期向S期進行20。本實驗研究了HepG2細胞cMyc mRNA轉錄水平及蛋白翻譯水平的改變，結果顯示經CCW處理48 h后的HepG2細胞cMyc的表達明顯下降，說明CCW能抑制cMyc的表達，而細胞周期調控蛋白被認為是cMyc重要的下游效應器，所以我們推測CCW對Hep

18、G2細胞增殖活性的影響可能與下調cMyc表達密切相關。此外，血管生成在肝癌的生長、浸潤以及轉移過程中發揮著重要的作用，新生的血管不僅能提供給腫瘤生長所需的營養成分，而且提供了腫瘤細胞擴散的途徑21，其中VEGF是一高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素，它通過旁分泌方式作用于血管內皮細胞，促進內皮細胞增殖和遷移，誘導新生血管的生成。已有研究發現，實體瘤的發生、發展分為無血管期和血管期，無血管期的腫瘤直徑不超過2 mm22，瘤體的營養由血液中氧氣和營養物質通過彌散作用供給，此期的腫瘤無誘導血管生成的能力，不會發生轉移。進入血管期后，腫瘤細胞分泌大量VEGF等血管生長因子，誘導新生血管生成，導致瘤細胞迅

19、速增殖，發生浸潤和轉移。本實驗通過檢測經不同濃度CCW處理后HepG2細胞中VEGF基因及蛋白表達量的變化，發現隨著藥物濃度的增加，HepG2細胞VEGF的陽性表達率有顯著的下降。說明CCW能有效抑制HepG2細胞分泌VEGF，為垂盆草在體外的抗血管生成作用提供一定的實驗依據。總之，垂盆草醇提物能抑制HepG2細胞增殖，并阻滯細胞于G0/G1期，這可能與它能降低cMyc的蛋白表達有關系。另外，垂盆草醇提物能有效抑制HepG2細胞分泌VEGF，具有一定的抗血管生成作用。本實驗結果為垂盆草應用范圍的拓展提供了一定的實驗依據。【參考文獻】 1國家藥典委員會.中國藥典M.5版.北京:化學工業出版社,2

20、005:149.2PERZ J,ARMSTRONG G,FARRINGTON L,et al.The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwideJ.Hepatol,2006,45(4):529538.3曹基輝,張靜,翟成凱,等.乙型肝炎病毒X基因與肝細胞肝癌J.東南大學學報：醫學版,2003,22(3):195198.4KIM M H.Flavonoids inhibit VEGF/bFGFinduced a

21、ngiogenesis in vitro by inhibiting the matrixdegrading proteasesJ.J Cellular Biochemistry,2003,89(3):529538.5SHUKLA S,MACLENNAN G T,FLASK C A,et al.Blockade of catenin signaling by plant flavonoid apigenin suppresses prostate carcinogenesis in tramp miceJ.Cancer Research,2007,67(14):69256935.6ZHUANG

22、 W J,FONG C C,CAO J,et al.Involvement of NFB and cmyc signaling pathways in the apoptosis of HL60 cells induced by alkaloids of tripterygium hypoglaucum (levl) HutchJ.Phytomedicine,2004,11(4):295302.7CAO Q Z,LIN Z B.Ganoderma lucidum polysaccharides peptide inhibits the growth of vascular endothelia

23、l cell and the induction of VEGF in human lung cancer cellJ.Life Sci,2006,78(13):14571463.8CUI J,DONG B W,LIANG P,et al.Effect of cMyc,Ki67,MMP2 and VEGF expression on prognosis of hepatocellular carcinoma patients undergoing tumor resectionJ.World J Gastroenterol,2004,10(10):15331536.9司徒鎮強,吳軍正,劉斌,等

24、.細胞培養M.西安:世界圖書出版公司,1996:138.10HERMES M,OSSWALD H,MATTAR J,et al.Influence of an altered methylation potential on mRNA methylation and gene expression in HepG2 cellsJ.Exp Cell Res,2004,294(2):325334.11GUO W J,DATTA S,BAND V,et al.Mel18,a polycomb group protein,regulates cell proliferation and senesce

25、nce via transcriptional repression of Bmi1 and cMyc oncoproteinsJ.Mol Biol Cell,2007,18(2):536546.12ZHANG W Y,LI J,QIU S Q,et al.Effects of the exopolysaccharide fraction (EPSF) from a cultivated Cordyceps sinensis on immunocytes of H22 tumor bearing miceJ.Fitoterapia,2008,79(3):168173.13戴岳,馮國雄.垂盆草對

26、免疫系統的影響J.中國藥理與臨床,1995,11(5):3033.14KIM W H,PARK Y J,PARK M R,et al.Estrogenic effects of Sedum sarmentosum Bunge inovarieectomized ratsJ.J Nutr Sci Vitaminol,2004,50: 100105.15OH H,KANG D G,KWON J W,et al.Isolation of angiotens in converting enzyme(ACE) inhibitory flavonoids from Sedum sarmentosum bungeJ.Biol P