1、紫外吸收法測定蛋白質含量一、實驗目的 學習紫外分光光度法測定蛋白質含量的原理； 熟練掌握紫外分光光度計測定原理及使用方法。二、實驗原理 由于蛋白質中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質具有吸收紫外光的性質，最大吸收峰在280nm波長處。在此波長范圍內，蛋白質溶液的光密度od280nm與其濃度呈正比關系，可作定量測定。三、 實驗材料、主要儀器和試劑 1試驗材料：待測的蛋白質溶液。 2 主要儀器： （1）紫外分光光度計，（2）試管與試管架，（3）刻度吸量管 3試劑： （1）標準牛血清蛋白溶液：準確稱取經凱氏定氮法校正的結晶牛血清蛋白，配制成濃度為1mg/ml的溶液。 （2）待測蛋白質溶液

2、：濃度為1mg/ml左右的溶液 四、操作步驟 1標準曲線制作 按下表分別向每支試管內加入各種試劑，混勻。以光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長處測定各管溶液的光密度值od280nm。 以蛋白質濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪出標準曲線。 2樣品測定 取待測蛋白質溶液1ml，加入蒸餾水3ml，混勻，按上述方法測定280nm的光密度，并從標準工作曲線上查出待測蛋白質溶液的濃度。五、附注 1在測定工作中，可以利用280nm及260 nm的光密度值求出蛋白質的濃度：蛋白質濃度（mg/ml）=1.45od280nm0.74od260nm 上式中的od280nm是蛋白質溶液在280nm下測得的光密

3、度，od260nm是蛋白質溶液在260nm下測得的光密度。 2對于有核酸存在時所造成的誤差，可將待測的蛋白質溶液稀釋至光密度在0.22.0之間，選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm及260nm處分別測出光密度od280nm /od260nm的比值，從下表中查出校正因子“f”值，同時可查出該樣品內混雜的核酸的百分含量，將f值代入下述公式，即可計算出該溶液的蛋白質濃度。 蛋白質濃度（mg/ml）= fod280nmd 式中：od280nm為被測溶液在280nm紫外波長下的光密度，d為溶液的稀釋倍數。od280nm /od260nm校正因子核酸%od280nm /od260nm校正因子核酸%1

4、.751.1160.000.8460.6565.501.631.0810.250.8220.6326.001.521.0540.500.8040.6076.501.401.0230.750.7840.5857.001.360.9941.000.7670.5657.51.300.9701.250.7530.5458.001.250.9441.500.7300.5089.001.160.8992.000.7050.47810.001.090.8522.500.6710.42212.001.030.8143.000.6440.37714.000.9790.7763.500.6150.32217.00

5、0.9390.7434.000.5950.27820.000.8740.6825.00 注：通常純蛋白質的od280nm /od260nm 約為1.8，而純核酸的比值約為0.5。六、思考題 1紫外吸收法與folin-酚比色法測定蛋白質含量相比，有何缺點及優點？ 2若樣品中含有核酸類雜質，應如何校正？ 參考答案 1蛋白質測定的folin-酚比色法（即lowry法）的定量范圍為5100g蛋白質，靈敏度高；但操作要費較長時間，且folin試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用；不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度也稍有不同。 紫外

6、吸收法測蛋白質含量迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，已在蛋白質和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進行紫外檢測，來判斷蛋白質吸附或洗脫情況。 但該法的缺點是：（1）對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適于測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。（2）若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質，會出現較大干擾。例如，在制備酶的過程中，層析柱的流出液中有時混雜有核酸，應予以校正 2當樣品中含有核酸類雜質，可以根據核酸在260nm波長處有最強的紫外光吸收，而蛋白質在280nm處有最大的紫外光吸收的性質，通過計算可以適當校正核酸對于測定蛋白質濃度的干擾作用。但是，因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定結果還存在著一定的誤差 表1 蛋白質標準曲線制作管號管號標準蛋白質溶標準蛋白質溶液（液（ml）蒸餾水蒸餾水（ml）蛋白質濃度