1、中心法則中心法則（the central dogma)the central dogma)dnarnaprotein轉錄轉錄翻譯翻譯復制復制復制復制反轉錄反轉錄1958 f.crick 1970 h.temin (逆轉錄逆轉錄)chapter 5chapter 5 dna replicationdna replication復復 制制 概概 念念 遺傳信息從親代遺傳信息從親代dnadna傳遞到子代傳遞到子代dnadna分分子上，稱為子上，稱為復制復制，這是生物體內高分，這是生物體內高分 子的聚合過程，即子的聚合過程，即dnadna的生物合成。的生物合成。第一節第一節 dnadna復制的基本方式

2、復制的基本方式一、半保留復制一、半保留復制（semiconservative replication)semiconservative replication) 復制時母鏈的雙鏈復制時母鏈的雙鏈dna解開成各自作解開成各自作為模板指導子代合成互補鏈；為模板指導子代合成互補鏈；子代的兩條鏈：親代鏈新合成鏈；子代的兩條鏈：親代鏈新合成鏈；由于堿基互補，子代由于堿基互補，子代dna雙鏈和親代雙鏈和親代dna堿基序列一致。堿基序列一致。agaacttagtcttgaatctcttgaatc通過半保留復制，子代通過半保留復制，子代dna和親代的和親代的dna是一致的是一致的agaacttag重新合成的子

3、代鏈重新合成的子代鏈tcttgaatcagaacttag母鏈母鏈意意 義義 子代保留了親代子代保留了親代dna的全部信息；的全部信息； dna通過復制和基因表達決定生物特性；通過復制和基因表達決定生物特性； 體現了遺傳過程的相對保守性；體現了遺傳過程的相對保守性； 保守性是相對的，不能忽視其變異性。保守性是相對的，不能忽視其變異性。復制叉移動方向復制叉移動方向前導鏈前導鏈岡崎片段岡崎片段后隨鏈后隨鏈二、半不連續性二、半不連續性（semidiscontimitysemidiscontimity）不連續復制不連續復制 連續復制連續復制概念概念復制叉、前導鏈、后隨鏈、岡崎片段復制叉、前導鏈、后隨鏈、

4、岡崎片段第二節第二節 dna復制的酶學復制的酶學 復制是在酶催化下的復制是在酶催化下的核苷酸核苷酸聚合聚合過程，需要多種高分子物質過程，需要多種高分子物質共同參與。共同參與。dntpdna-pol單鏈的單鏈的dna母鏈母鏈rna引物引物其它輔助因子其它輔助因子5 tca3 5 3 oh3 a gtcaagtga5gpp-phodttpdatpdctp復制過程中的脫氧核苷酸聚合復制過程中的脫氧核苷酸聚合 代表引物代表引物c5 tctohp pp3 v dna聚合酶聚合酶（dna polymerase）v dna螺旋酶螺旋酶 v 拓撲酶拓撲酶v 引物酶引物酶v 連接酶連接酶v 其它相關酶和蛋白質其

5、它相關酶和蛋白質一、一、dna聚合酶（聚合酶（dnapolymerasednapolymerase）原核生物：原核生物：dna-pol i ii iii 真核生物：真核生物：dna-pol 原核生物原核生物dna聚合酶聚合酶nc小片段小片段35kda大片段（大片段（klenow片段）片段）68kda5 3 5 3 核酸核酸外切酶活性外切酶活性dnadna聚合酶聚合酶活性活性3 5 3 5 核酸核酸外切酶活性外切酶活性蛋白酶蛋白酶dna-pol i（ 103kda）結構特點結構特點1、由、由18個個 -螺旋區組成；螺旋區組成；2、蛋白酶水解產生、蛋白酶水解產生2個片段：個片段：小片段：有小片段：

6、有53外切酶活性外切酶活性大片段：有大片段：有dna聚合酶活性及聚合酶活性及3 5外切酶活性。外切酶活性。kornberg酶,1956 主要作用：主要作用：填補填補復制修復復制修復空隙空隙(53(53外切酶活外切酶活性性) )校正校正復制中復制中錯誤錯誤( (一條分子量一條分子量120kda的多肽鏈的多肽鏈活性很低活性很低能促進能促進dna合成合成有有35的外切核酸酶活性的外切核酸酶活性，無，無53外外切酶活性切酶活性 在在dna的修復中起一定作用的修復中起一定作用 dna-pol iikornberg,gefter, 19701971kornberg,gefter, 19701971真正負責

7、大腸桿菌細胞內合成真正負責大腸桿菌細胞內合成dna的復的復制酶（制酶（replicase）；）；10種亞基組成的種亞基組成的不對稱二聚體；不對稱二聚體；核心酶核心酶(core enzyme)：具有核苷酸聚合：具有核苷酸聚合的作用；的作用； 35外切酶活性。外切酶活性。dna-pol iiikornberg,gefter, 19701971kornberg,gefter, 19701971 e.coli dna 聚合酶聚合酶不對稱二聚體不對稱二聚體 核心酶核心酶( , , )原核生物原核生物dna聚合酶的比較聚合酶的比較 酶活性酶活性 5 3 聚合酶活性聚合酶活性 3 5 外切酶活性外切酶活性

8、分子大小（分子大小（kd） 250 36-38 163-300 170 256細胞內定位細胞內定位 核核 核核 線粒體線粒體 核核 核核功能功能 引物酶活性引物酶活性 修復修復 復制復制 主要主要 校讀、修校讀、修 復制復制 （無其它（無其它 聚合酶聚合酶 復、填補復、填補 dna-pol時）時）真核生物的真核生物的dna聚合酶聚合酶dna解旋酶解旋酶/dna解旋蛋白解旋蛋白（dna dna unwinding proteinunwinding protein）：催化雙螺旋催化雙螺旋dna的的解旋和解鏈，該過程需水解解旋和解鏈，該過程需水解atp提供能提供能量。量。二、二、dna解旋酶解旋酶（

9、dna helicasedna helicase）解旋酶解旋酶和和rep蛋白蛋白；解旋酶解旋酶：沿著后隨鏈的模板，從：沿著后隨鏈的模板，從53方向移動，促使復制叉向前延伸；方向移動，促使復制叉向前延伸；rep蛋白蛋白：沿著前導鏈的模板，以：沿著前導鏈的模板，以35方向向前移動，從而促進雙鏈不斷解開。方向向前移動，從而促進雙鏈不斷解開。三、三、dna拓撲異構酶拓撲異構酶（dna topisomerase dna topisomerase ） 原核和真核生物中都發現二類拓撲異構酶：原核和真核生物中都發現二類拓撲異構酶： topo和和topo 原核生物：原核生物：topo與復制有關與復制有關 top

10、o與轉錄有關與轉錄有關真核生物：真核生物：topo和和均與復制有關均與復制有關。作用：通過切斷、旋轉和再連接作用，理作用：通過切斷、旋轉和再連接作用，理順順dna鏈。鏈。 dna結合蛋白對單鏈結合蛋白對單鏈dna有高親和力，能特異地結合到有高親和力，能特異地結合到分開的單鏈分開的單鏈dna上。對上。對dna復制區形成的單鏈復制區形成的單鏈dna有穩定有穩定作用。作用。 在真核生物中，一種單鏈在真核生物中，一種單鏈dna結合蛋白稱之復制蛋白結合蛋白稱之復制蛋白a（replication protein a,replication protein a, rpa）結結合到暴露的單鏈上。合到暴露的單鏈

11、上。三、單鏈三、單鏈dna結合蛋白結合蛋白 (single- strand dna binding protein,(single- strand dna binding protein,ssbssb) )解螺旋酶解螺旋酶 helicasehelicasedna拓樸異構酶拓樸異構酶 dna topoisomerasedna topoisomerase單鏈單鏈dna結合蛋白結合蛋白 ssb解開解開、理順理順dna鏈、維持鏈、維持dna單鏈單鏈狀態狀態四、四、dna引物酶引物酶(primase)(primase)引物酶引物酶：復制是在一段：復制是在一段rna引物上加入引物上加入脫氧核苷酸，而催化引

12、物合成的脫氧核苷酸，而催化引物合成的rna聚聚合酶。合酶。目的目的：盡量減少：盡量減少dna復制起始處的突變。復制起始處的突變。五、五、dna連接酶連接酶(dna ligase )(dna ligase )dna連接酶連接酶：催化岡崎片段間：催化岡崎片段間磷酸二磷酸二酯鍵的形成酯鍵的形成； 注意注意：連接堿基互補基礎上雙鏈中的：連接堿基互補基礎上雙鏈中的單鏈缺口，單鏈缺口，不能連接單獨存在的不能連接單獨存在的dna或或rna單鏈單鏈。連接酶連接模板鏈上相鄰兩個片段的切口連接酶連接模板鏈上相鄰兩個片段的切口 v解螺旋酶：解螺旋酶：解開解開dna雙螺旋雙螺旋vdna拓樸異構酶：拓樸異構酶：理順理順

13、dna鏈鏈v單鏈單鏈dna結合蛋白：結合蛋白：穩定維持穩定維持dna單鏈狀態單鏈狀態v前導鏈的合成前導鏈的合成：在：在聚合酶聚合酶iii與與滑動夾子滑動夾子結合結合下連續合成。下連續合成。v尾隨鏈的合成尾隨鏈的合成：解旋酶解旋酶（dnabdnab）和和引物酶引物酶（dnagdnag）沿著模板移動。每沿著模板移動。每1000-2000bp合成合成一個引物。一個引物。聚合酶聚合酶iii延伸引物，一直達到前一延伸引物，一直達到前一個岡崎片段為止。個岡崎片段為止。聚合酶聚合酶i去除去除rna引物，并引物，并填補留下的空隙。填補留下的空隙。連接酶連接酶封閉最后缺口。封閉最后缺口。 各種酶與蛋白質的作用小

14、結各種酶與蛋白質的作用小結復制復制基本過程基本過程起始起始 延長延長 終止終止大腸桿菌大腸桿菌dna復制的相關酶和蛋白質復制的相關酶和蛋白質蛋白質蛋白質dnab蛋白引物酶(dnag)rep蛋白(解鏈酶)ssb(單鏈結合蛋白)dna旋轉酶(拓撲異構酶)dna pol全酶dna poldna連接酶dnaa蛋白dnac蛋白作用作用開始解鏈合成rna引物解開雙鏈穩定單股鏈區引入負超螺旋合成dna去除引物，補充空隙連接dna片段連接dna片段辨認起始點運送和協同dnab（一）復制的起始（一）復制的起始(initiation)一、原核生物的一、原核生物的 dna 生物合成生物合成引發體生成引發體生成引物合

15、成引物合成dna 解鏈解鏈vdnaa蛋白、蛋白、rep蛋白、蛋白、ssb 和和 拓撲酶共同拓撲酶共同參與。參與。v起始點（起始點（ori c） 固定單一起始點固定單一起始點 跨度跨度 254 bp 結構：結構：3 組串聯重復序列組串聯重復序列（識別區）（識別區） 2 對反向重復序列對反向重復序列（富含（富含at）1、dna 解鏈解鏈dna bdna cdna assbdna大腸桿菌起始點大腸桿菌起始點: : dna- dna-蛋白質復合物的類核小體結構蛋白質復合物的類核小體結構dna aadnadnaa蛋白識別、結合于蛋白識別、結合于ori c的重復序列的重復序列vdna 解鏈的基本過程解鏈的

16、基本過程bdnaa蛋白與蛋白與dna形成形成復合物，促使解鏈復合物，促使解鏈c在在dnac的協助下，的協助下，dnab結合于初步打開的雙鏈，結合于初步打開的雙鏈，并用其解螺旋酶活性使雙并用其解螺旋酶活性使雙鏈解開一定長度鏈解開一定長度v在解鏈基礎上，引物酶進入形成引發體。在解鏈基礎上，引物酶進入形成引發體。v引發體引發體 為含解螺旋酶、引物酶和為含解螺旋酶、引物酶和dna復制起始區的復合物。復制起始區的復合物。2、引發體形成：、引發體形成：3、引物的生成：、引物的生成：v引發體移動過程中，在適當位置引物酶引發體移動過程中，在適當位置引物酶催化引物生成。催化引物生成。復制的起始復制的起始(ini

17、tiation)復制方向（復制方向（5 3）半不連續復制半不連續復制岡崎片段岡崎片段前導鏈前導鏈滯后鏈滯后鏈（二）復制的延長（二）復制的延長(elongation)5 5 3 3 3 5 不連續復制不連續復制隨從鏈隨從鏈復制叉復制叉岡崎片段岡崎片段 連續復制連續復制領頭鏈領頭鏈引物水解（引物水解（rna酶）酶）補缺（補缺（dna-pol i ）連接（連接酶）連接（連接酶）（三）復制的終止（三）復制的終止(termination)0/10050ori c82ter32e.coli 基因圖基因圖雙向復制雙向復制終止點（終止點（ter）：）：基本過程基本過程二、真核生物的二、真核生物的dna生物合成

18、生物合成（一）復制的起始（比較原核生物）（一）復制的起始（比較原核生物） 1、過程同原核生物：、過程同原核生物： 解鏈解鏈 引發體形成引發體形成 生成引物生成引物 2、特點：、特點： 起始點結構較起始點結構較 ori c 短短（ 酵母為酵母為11bp，富含，富含at，稱為自主復制序列稱為自主復制序列 autonomouse replication sequence，ars） 多起點（多復制子）多起點（多復制子） 時序性（分組激活，非同步進行）時序性（分組激活，非同步進行）3、參與酶和蛋白因子：、參與酶和蛋白因子： dna-pol （引物酶活性）（引物酶活性） dna-pol （解螺旋酶活性）（

19、解螺旋酶活性） 拓撲異構酶拓撲異構酶 復制因子復制因子（rf，如：，如：rfa、rfc） 增殖細胞核抗原增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，pcna）4、通過細胞周期實現其調節：、通過細胞周期實現其調節： 細胞周期與細胞周期與dna復制復制 細胞周期蛋白、周期蛋白依賴激酶與細胞周期細胞周期蛋白、周期蛋白依賴激酶與細胞周期 cdk抑制物抑制物 錨蛋白錨蛋白（ankynin）、p21蛋白蛋白1、 dna-pol 催化合成引物。催化合成引物。2、 dna-pol 在增殖細胞核抗原（在增殖細胞核抗原（pcna）協同下，）協同下，催化領頭鏈或隨從鏈合成催

20、化領頭鏈或隨從鏈合成（ dna-pol 與與 發生轉發生轉換）換）。3、引物除有、引物除有rna外，還有外，還有dna片段參與構成片段參與構成（去除（去除引物不僅需要引物不僅需要rna酶，還需要核酸外切酶）酶，還需要核酸外切酶）。4、引物和岡崎片段都較原核短、引物和岡崎片段都較原核短（引物長度大致與核（引物長度大致與核小體所含小體所含dna長度或其若干倍）長度或其若干倍） 。5、合成速度較慢，但總速度不慢。、合成速度較慢，但總速度不慢。（二）復制延長（二）復制延長353553核小體核小體引物引物真核生物復制叉的延長真核生物復制叉的延長注：當隨從鏈延長了一個或若干個核小體的長度后，注：當隨從鏈延

21、長了一個或若干個核小體的長度后， 要重新合成引物要重新合成引物（三）復制終止和端粒酶（三）復制終止和端粒酶 復制與核小體裝配同步進行復制與核小體裝配同步進行引物水解（引物水解（rna酶）酶）補缺（補缺（dna-pol ）連接（連接酶）連接（連接酶）1、基本過程、基本過程2、端粒酶：、端粒酶： 由蛋白質和由蛋白質和 rna 兩部分組成，是一種特殊的反轉錄酶。兩部分組成，是一種特殊的反轉錄酶。 催化特點：催化特點：它以自身的它以自身的 rna 為模板，在隨從鏈的模為模板，在隨從鏈的模板板dna 的的 3 -oh 末端延長末端延長 dna，再以這種延長的，再以這種延長的 dna 為為模板，繼續合成隨

22、從鏈，直至一定長度。模板，繼續合成隨從鏈，直至一定長度。端粒的復制模型 1989年greider和blackburn提出了端粒的復制模型。反應為四步進行： （1）首先是端粒酶與端粒dna結合，端粒酶 中的rna與凸出的3模板配對； （2）以rna為模板，在dna3端上從頭合成 dna； （3）延伸六個nt； （4）合成一個重復單位后，端粒酶向dna模板 新合成的3移動， rna再和模板配對，就這樣循環 往復，周而復始。最后延伸的3端再回折，以gg 配對的方式形成發夾結構，產生端粒。 5 ttggggttggggttggggttgggg 3 aacccc ggggttgggg圖 11-68 端粒

23、3延伸，末端回折形成發夾結構癌癥與端粒酶此前人們已經發現，癌細胞往往會產生格外多的端粒酶，使它們能不斷分裂繁殖。認為80%的癌癥與端粒酶過多密切相關。英國自然細胞生物學雜志最近在網上提前發表了美國加利福尼亞大學伯克利分校的科學家的報告。科學家用會發出熒光的蛋白質給端粒酶“染色”，觀察它們在細胞里的活動。結果發現，正常細胞是將端粒酶限制在細胞核里的一個特定區域，只有在細胞分裂、dna端粒需要修補時才把它釋放出來。與之相反，在癌細胞里，端粒酶有很大的自由度。科學家認為，端粒酶在癌細胞里能夠自由活動，可能與癌細胞的強大生命力有關。如果找到方法把這些端粒酶重新“關起來”，就有可能抑制癌細胞的繁殖。rna模板模板逆轉錄酶逆轉錄酶逆轉錄酶逆轉錄酶rnase h堿水解堿水解雜化雙鏈雜化雙鏈單鏈單鏈dna雙鏈雙鏈dna逆轉錄酶逆轉錄酶dna pol is1核酸酶核酸酶整合整合基因組基因組dnacdna 逆轉錄酶催化細胞內逆轉錄酶催化細胞內dna合成合成逆轉錄酶在試管內催化逆轉錄酶在試管內催化cdna合成合成一、逆轉錄一、逆轉錄: rna dna二、滾動復制和二、滾動復