1、第十一章第十一章 生物素生物素- -親合親合素放大技術素放大技術生物素（生物素（biotin,bbiotin,b）是一是一種小分子生長因子種小分子生長因子,又稱維生又稱維生素素h或輔酶或輔酶r動、植物組織中廣泛分布動、植物組織中廣泛分布, ,卵黃和肝含量高卵黃和肝含量高mw 244.31kd.mw 244.31kd.i i環為環為咪唑酮環咪唑酮環，可與親合可與親合 素結合素結合環為環為噻吩環噻吩環，c2c2上戊酸上戊酸 側鏈的未端羧基是結合生側鏈的未端羧基是結合生 物大分子的唯一結構物大分子的唯一結構 羧基羧基第一節第一節 生物素理化性質與標記生物素理化性質與標記一、活化生物素一、活化生物素

2、生物素側鏈的末生物素側鏈的末端羧基經化學修端羧基經化學修飾后制成帶各種飾后制成帶各種活性基團的衍生活性基團的衍生物物活化生物素活化生物素( (生物素化衍生物生物素化衍生物) )生物素活化生物素活化活化生物素易活化生物素易與抗原、抗體與抗原、抗體酶及核酸分子酶及核酸分子中相應基團偶中相應基團偶聯形成生物素聯形成生物素化標記物化標記物 標記蛋白質標記蛋白質氨基氨基的活化生物素的活化生物素 標記蛋白質標記蛋白質醛基醛基的活化生物素的活化生物素 標記蛋白質標記蛋白質巰基巰基的活化生物素的活化生物素 標記標記核酸核酸的活化生物素的活化生物素 cnhnhchch2chchos(ch2)4coohnh2co

3、ch2ch2conhohcooncoocch2ch2edc標記蛋白質氨基的活化生物素標記蛋白質氨基的活化生物素生物素生物素n-n-羥基丁二酰胺羥基丁二酰胺碳二亞碳二亞胺胺生物素羥基生物素羥基琥珀酰亞胺琥珀酰亞胺酯（酯（bnhs bnhs ）活化生物素活化生物素bnhsbnhs分子可與蛋白質分子可與蛋白質 賴氨酸的氨基形成肽鍵賴氨酸的氨基形成肽鍵 bnhsbnhs適用標記抗體和適用標記抗體和 中性或偏堿性的蛋白質中性或偏堿性的蛋白質如何減小空間位阻？如何減小空間位阻？長臂活化生物素長臂活化生物素（bcnhsbcnhs）：）：生物素和生物素和n-n-羥基丁二酰亞胺之間添羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個

4、加了兩個6-6-氨基已糖分子基團，形氨基已糖分子基團，形成連結臂，生物素與大分子基團的成連結臂，生物素與大分子基團的距離距離 標記蛋白質醛基的活化生物素標記蛋白質醛基的活化生物素生物素酰肼生物素酰肼(bhz)(bhz)：水合肼與生物素的合成物水合肼與生物素的合成物 主要用于標記偏酸性糖蛋白主要用于標記偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(bchz)(bchz) ：生物素與賴氨酸連接：生物素與賴氨酸連接 后，再與無水肼反應而成。后，再與無水肼反應而成。 除醛基外，除醛基外， bchzbchz還可標記氨基還可標記氨基標記蛋白質巰基的活化生物素標記蛋白質巰基的活化生物素馬來酰亞胺馬來酰亞胺- -丙

5、酰丙酰- -生物胞素（生物胞素（mpb)mpb)能特異地與蛋白質巰基結合的活化能特異地與蛋白質巰基結合的活化生物素生物素 標記核酸的活化生物素標記核酸的活化生物素光敏生物素光敏生物素(photobiotin)(photobiotin) 側鏈上連接的芳香基疊氮物基團側鏈上連接的芳香基疊氮物基團, , 經光照后經光照后, , 變為芳香變為芳香基硝基苯，可直接與腺嘌呤氨基結合基硝基苯，可直接與腺嘌呤氨基結合, , 形成形成b-b-核酸探針核酸探針 n3no2nh(ch2)3n(ch2)3ch3nhc(ch2)4snhnho生物素脫氧核苷三磷酸生物素脫氧核苷三磷酸（bio-dutp） 作為作為ttpt

6、tp的結構類似物，可采用缺口移的結構類似物，可采用缺口移 位法摻入到雙鏈位法摻入到雙鏈dnadna中。中。bnhs和和bhz 可直接標記核酸，可直接標記核酸，但對但對堿基配對堿基配對有影有影響。響。 活化生物素通過側鏈與蛋白分子連接；活化生物素通過側鏈與蛋白分子連接； 一個蛋白分子可被多個生物素標記多價性；一個蛋白分子可被多個生物素標記多價性； 對對bnhs多標記抗體多標記抗體, bhz則多標記微酸性抗原；則多標記微酸性抗原； 抗原、抗體標記后活性不變；抗原、抗體標記后活性不變； 可對標記材料（如酶）標記：可對標記材料（如酶）標記：堿性磷酸酶標記后堿性磷酸酶標記后 活性將降低；活性將降低；二、

7、生物素標記蛋白質二、生物素標記蛋白質 選擇活化生物素：選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標記基團依抗原或抗體分子所帶可標記基團 的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性； 控制生物素：控制生物素：蛋白質比例蛋白質比例 生物素：生物素：igg igg 用量比用量比(mg/mg)宜為宜為2:1, igg2:1, igg應用濃度應用濃度 0.50.55 5g/ml; 生物素生物素1 13 3個個/ag/ag，3 35 5個個/ab/ab； 使用交聯臂減少空間阻力使用交聯臂減少空間阻力第二節第二節 親合素、鏈霉親合素的理親合素、鏈霉親合素的理化性質與標

8、記化性質與標記親合素親合素(avidin, av) 和鏈霉親合素和鏈霉親合素(streptavidin, sa)是生物素的天然特異性結合是生物素的天然特異性結合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標記的物質均可以同親合素（有用于標記的物質均可以同親合素（av）或鏈）或鏈酶親合素（酶親合素（sa）結合。）結合。 結構結構 四亞基糖蛋白四亞基糖蛋白 四肽鏈蛋白四肽鏈蛋白 無糖基無糖基pi pi 10.5 610.5 6結合位結合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4ka ka 10 1015 15 10 101515活性活性 13

9、1315 1515 151818一、理一、理 化化 特特 性性二、親合素二、親合素/鏈霉親合素標記鏈霉親合素標記標記物：小分子示蹤物125i、膠體金、熒光素、化學發光物 大分子物質如酶抗原、抗體親和素的標記：hrp的標記 改良過碘酸鈉法 戊二醛法過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法oooooonaio4ooohooohoh+ nh2avidinooonnavidinavidinh2onavdinnabh4schiff堿酶-五炭糖環戊二醛法戊二醛法酶酶nhnh2 2親和素親和素nhnh2 2(ch2 2)3 3chocho(ch2 2)3 3chn酶酶chn親和素親和素b-e + a abc2.親和素生

10、物素化hrp復合物的制備鏈霉親和素的標記方法：過碘酸鈉法hrp+naio4+sa 透析+kbh4 沉淀過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法oooooonaio4ooohooohoh+ nh2savidinooonnsavidinsavidinh2onavdinkbh4schiff堿酶-五炭糖環第三節第三節 生物素生物素- -親合素系統的特點親合素系統的特點一、靈敏度高一、靈敏度高二、特異性強二、特異性強三、穩定性好三、穩定性好四、適用性廣四、適用性廣五、其他五、其他第四節第四節 生物素生物素- -親合素系統的應用親合素系統的應用生物素與親合素之間結合的親合生物素與親合素之間結合的親合力高、特異性強，各

11、自均可以與各型力高、特異性強，各自均可以與各型大小分子結合，以及二者在結合反應大小分子結合，以及二者在結合反應時具有的多級放大作用等優越性，使時具有的多級放大作用等優越性，使basbas及其相關技術被廣泛應用在各種標及其相關技術被廣泛應用在各種標記免疫分析技術領域中，尤其為標記記免疫分析技術領域中，尤其為標記免疫檢測自動化分析做出了極大的貢免疫檢測自動化分析做出了極大的貢獻。獻。 一、生物素一、生物素- -親合素系統基本類型親合素系統基本類型及原理及原理babbab法：法： ag+bag+bab ag-abab ag-abb b a a ag-ab ag-abb-a b-a b be e ag

12、-ab ag-abb-a-bb-a-be e 特點：以游離特點：以游離a a分別連接分別連接b-abb-ab和和b-e b-e +a+a abc abc法法 a+b a+be a- be a- be-abce-abc ag+b ag+bab ag-abab ag-abb b abcabc ag-ab ag-abb-abc b-abc 特點特點: :將將babbab法中的法中的a a先與先與b-eb-e結合，制備成復合物結合，制備成復合物abcabc+abcb-e + a abcab-ag-ab-b + abc ab-ag-ab-b-abc baba法法ag+bag+bab ag-abab ag

13、-abb b a ae e ag-ab ag-abb-ab-ae e特點：以特點：以a-e/sa-ea-e/sa-e代替代替babbab法中的法中的a a，省，省 卻了加卻了加b-eb-e的步驟的步驟 ag-ab1-ab2-b + a-e ag-ab1-ab2-b-a-e+a-ebas實驗方法及反應層次方法反應層次直接法baag-(ab-b)-a*babag- (ab-b)-a-b*abcag- (ab-b)-ab*c間接法baag-ab1-(ab2-b)-a*babag-ab1- (ab2-b)-a-b*abcag- ab1- (ab2-b)-ab*c二、生物素二、生物素- -親合素系統在酶

14、免疫親合素系統在酶免疫測定中的應用測定中的應用basbas在在elisaelisa中的應用中的應用 生物素生物素- -親合素系統在均相酶免疫測定親合素系統在均相酶免疫測定 ab固相化抗原或抗體b電化學發光免疫測定示意圖電化學發光免疫測定示意圖 用于終反應的放大三、生物素三、生物素- -親合素系統在熒光免親合素系統在熒光免疫技術中的應用疫技術中的應用 bas bas用于熒光抗體技術，通常采用用于熒光抗體技術，通常采用baba法，即用法，即用熒光素直接標記親合素（或鏈酶親合素）；熒光素直接標記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩

15、端分別連接生物素化抗體和熒光素標記的兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標記的生物素（生物素（babbab法）或熒光標記的抗親合素（或法）或熒光標記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。鏈酶親合素）抗體的夾心法。 四、生物素四、生物素- -親合素系統在放射免親合素系統在放射免疫測定中的應用疫測定中的應用basbas主要與免疫放射分析主要與免疫放射分析(irma)(irma)檢測體系偶檢測體系偶聯，用于對終反應的放大（聯，用于對終反應的放大（baba法）法） basbas也可用于也可用于irmairma反應后反應后b b、f f成分的分離成分的分離 五、生物素五、生物素- -親合素系統在分子生親合

16、素系統在分子生物學中的應用物學中的應用以生物素標記核酸探針進行的定位檢測以生物素標記核酸探針進行的定位檢測用用bas制備的親和吸附劑進行基因的分離制備的親和吸附劑進行基因的分離純化純化將免疫測定技術與將免疫測定技術與pcr結合建立免疫結合建立免疫-pcr(immuno-pcr)用于抗原的檢測用于抗原的檢測 anti-hcvsandwich principle.total duration:18minutes. 1st incubation:40l of sample,60 l of reagent containing biotinylated hcv antigens and 60 l of

17、 a reagent containing hcv antigens labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich complex. 2nd incubation:after addition of strepetavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biontin and streptavidin. the reaction mixture is aspirated into

18、the measuring cell where the microparticles are magnetically captured onto the surface of the electrode.unbound substances are then removed with procell.application of a voltage to the electrode then induces chemiluminescent emission which is measured by a photomultiplier. results are determined aut

19、omatically by the elecsys software by comparing the electrochemiluminescence signal obtained from the sample with the cutoff value obtained by anti-hcv calibration.hbsagiisandwich principle.total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:50 l of sample,two biotinylated monoclonal anti-hbsag antib

20、odies, and a mixture of monoclonal anti-hbsag antibody and polyclonal anti-hbsag antibodies labeled with a ruthenium complex form a sandwich complex. 2nd:incubation:after addition of streptavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and strepta

21、vidin.anti-hbecompetition principle. 1st:incubation:anti-hbe in the sample (35 l) binds to the added hbeag. 2nd incubation:after addition of biotinylated antibodies and ruthenium complex-labeled antibodies specific for hbeag,together with streptavdin-coated microparticles,the still-free binding site

22、s on the hbe-antigens become occupied.the entire complex is then bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavdin.anti-hav igm-capture test principle.total duration of assay:18 minutes.1st incubation:pretreatment of 10 l of the automatically 1:400 diluted sample(using elecsys dilue

23、nt universal )with anti-fdy reagent to block specific in the presence of the monoclonal anti-hav antibodies labeled with ruthenium complex. 2nd incubation:after addion of biotinylated monoclonal h-igm-specific antibodies ,hav antigen, and streptavdin-coated microparticles,the anti-hav igm antibodies

24、 present in the sample form a sandwich complex with the hav antigen and the ruthenium-labeled anti-havantibody which becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.anti-hbssandwich principle. 1st incubation:anti-hbs in the sample(40l),biotinylated hbsag(ad/ay),and hbsag(ad/ay)labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich coplex. 2nd incubation:after addition of strepavdin-coated microparticles,the comples becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavi