1、第三章 微生物的代謝調節和代謝工程n 第一節 微生物代謝的自我調節n 第二節 代謝調控n 第三節 次級代謝產物的主要調控機制 n 第四節 代謝工程【教學目的與要求教學目的與要求】掌握微生物自身代謝和次級代謝的機理、有關概念及代謝調控，了解代謝工程設計的方向。【教學重點與難點】教學重點與難點】微生物自身代謝和次級代謝的機理、有關概念及代謝調控。n微生物的生長繁殖和新陳代謝n代謝類型： 主要依賴兩種代謝途徑： 分解代謝 合成代謝n分解代謝:指復雜的有機物分子通過分解代謝酶系的催化，產生簡單分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和還原力（或稱還原當量，一般用H來表示）的作用。 微生物通過分解代謝從環境

2、中吸收的各種碳源、氮源等物質降解，為生命活動提供能源和小分子中間體。 包括：中心途徑如TCA、EMP、HMP及外圍途徑（指碳源、氮源通過分解進入中心途徑） 合成代謝n與分解代謝正好相反，指在合成代謝酶系的催化下，由簡單小分子、ATP形式的能量和H形式的還原力一起合成復雜的大分子的過程?；蚶梅纸獯x的能量和中間體合成氨基酸、核酸等單體物質及蛋白質、多糖等多聚物。n分解代謝與合成代謝是互相關聯、互相制約，是生命活動的基礎。n正常微生物的小分子物質的合成和降解是自身調節。研究微生物代謝調節的意義n十分重要，在工業上可通過對微生物的代謝途徑加以控制來滿足生產的需要。n如：谷氨酸發酵菌種：微生物的代謝

3、產物可分為：初級代謝產物定義：微生物通過代謝活動所產生的、自身生長和繁殖所必需的物質。舉例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。特征：不同的微生物初級代謝產物基本相同；初級代謝產物合成過程是連續不斷的，與菌體的生長呈平行關系。 次級代謝產物定義：微生物生長到一定階段才產生的化學結構十分復雜、對該微生物無明顯生理功能，或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質。舉例：抗生物、毒素、激素、色素等。特征：不同的微生物次級代謝產物不同；次級代謝產物的通常在菌體的生長后期合成，發酵分兩個階段進行，即營養增殖期和生產期。在多數情況下，增加前體是有效的兩種代謝產物的不同：n1、次級代謝通常在生長后期合成。不是微

4、生物生長所必需的，不參與微生物的生長和繁殖。 n2、次級代謝對環境條件的變化很敏感，其產物的合成往往會因環境條件的變化而停止。n3、不同微生物的次級代謝產物有很大區別。基于菌種的特異性n4、催化次級代謝產物合成的某些酶專一性不強。第一節 微生物代謝的自我調節 微生物有著一整套可塑性極強和極精確的代謝調節系統，以保證上千種酶能正確無誤、有條不紊地進行極其復雜的新陳代謝反應。n微生物細胞的代謝調節方式很多，例如可調節營養物質透過細胞膜而進入細胞的能力，通過酶的定位以限制它與相應底物的接近，以及調節代謝流等。n其中以調節代謝流的方式最為重要，它包括兩個方面，一是“粗調”，即調節酶的合成量，二是“細調

5、”，即調節現成酶分子的催化活力，兩者往往密切配合和協調，以達到最佳調節效果。微生物自我調節部位n1養分的吸收和排泄 細胞膜n2限制基質與酶的接近n3控制通量： 調節現有酶量和改變酶分子的活性n都涉及到酶促反應的調節包括酶活性的調節和和酶合成的調節一、酶活性的調節 酶活性的調節： 指在酶分子水平上的一種代謝調節，它是通過改變現成的酶分子活性來調節新陳代謝的速率。 酶活性的抑制 激活 是微生物代謝中存在的兩種矛盾的過程。n酶活性的激活系指在分解代謝途徑中，后面的反應可被較前面的中間產物所促進。n酶活性的抑制主要是反饋抑制，它主要表現在某代謝途徑的末端產物（即終產物）過量時，這個產物可反過來直接抑制

6、該途徑中第一個酶的活性，促使整個反應過程減慢或停止，從而避免了末端產物的過多累積。 圖：大腸桿菌代謝過程的抑制劑和激活劑（一）酶活性的激活（一）酶活性的激活n常見的酶活性的激活是前體激活，多發生在分支代謝途徑，即代謝途徑中的后面的反應可被較前面的一種代謝中間產物所促進。 如：粗糙脈胞酶的異檸檬酸脫氫酶的活性受到檸檬酸的激活。（二）酶活性的抑制（二）酶活性的抑制n酶活性的抑制包括： 競爭性抑制 反饋抑制 反饋抑制：指反應途徑中某些中間產物或末端產物對該途徑中前面反應的影響。 凡是反映加速地稱為正反饋； 凡是反應減速的稱為負反饋。 末端產物的反饋抑制普遍存在于合成途徑中。 反饋抑制：直鏈式 分支代

7、謝途徑：兩種以上的末端產物 反饋抑制的類型反饋抑制的類型 n1直線式代謝途徑中的反饋抑制2分支代謝途徑中的反饋抑制。 反饋抑制的情況較為復雜。 為避免在一個分支上的產物過多時不致同時影響另一分支上產物的供應，微生物已發展出多種調節方式。 n（1）同功酶調節 n同功酶是指能催化相同的生化反應，但酶蛋白分子結構有差異的一類酶，它們雖同存于一個個體或同一組織中，但在生理、免疫和理化特性上卻存在著差別。n同功酶的主要功能在于其代謝調節。n在一個分支代謝途徑中，如果在分支點以前的一個較早的反應是由幾個同功酶所催化時，則分支代謝的幾個最終產物往往分別對這幾個同功酶發生抑制作用。 如：大腸桿菌天冬氨族氨基酸

8、合成途徑中，有三個同工酶天冬氨酸激酶 分別受賴氨酸、蘇氨酸、硫氨酸反饋調節n（2）協同反饋抑制： n指分支代謝途徑中的幾個末端產物同時過量時才能抑制共同途徑中的第一個酶的一種反饋調節方式。n如：谷氨酸棒桿菌合成天冬氨族氨基酸時，天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協同反饋抑制。n（3）累積反饋抑制： 催化分支合成途徑第一步反應的酶有幾種末端產物抑制物，但每一種如過量，按一定百分率單獨抑制共同途徑中的第一個酶活性，總的抑制效果是累加的，各末端產物所起的抑制作用互不影響，只影響這個酶促反應的速率。 n兩種末端產物同時存在時，可以起著比一種末端產物大得多的反饋抑制作用。n（4）增效反饋抑制：代謝途徑中任何

9、一種末端產物過量時，僅部分抑制共同途徑中的第一個酶活性，但兩個末端產物同時過量時，其抑制作用可超過各產物存在的抑制能力的總和。如6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸合成途徑。n（5）順序反饋抑制：每個分支末端產物抑制分支后的第一個酶，產生部分抑制作用。通過逐步有順序的方式達到的調節。 n如枯草芽孢桿菌的芳香族氨基酸合成途徑和球型紅假單胞菌的蘇氨酸合成途徑。n當E過多時，可抑制CD，這時由于C的濃度過大而促使反應向F、G方向進行，結果又造成了另一末端產物G濃度的增高。由于G過多就抑制了CF，結果造成C的濃度進一步增高。C過多又對AB間的酶發生抑制，從而達到了反饋抑制的效果。這種通過逐步有順序的

10、方式達到的調節，稱為順序反饋抑制。二、酶合成的調節（酶量）二、酶合成的調節（酶量） n酶合成的調節是一種通過調節酶的合成量進而酶合成的調節是一種通過調節酶的合成量進而調節微生物的代謝速率。調節微生物的代謝速率。 這是一種在基因水平上（在原核生物中主要在這是一種在基因水平上（在原核生物中主要在轉錄水平上）的代謝調節。轉錄水平上）的代謝調節。 有誘導調節和阻遏調節。有誘導調節和阻遏調節。 根據酶的生成是否與環境中所存在的該酶底物或其有關物的關系，可把酶劃分成組成酶和誘導酶兩類。 n有些酶的合成不依賴于環境中物質的存在（如有些酶的合成不依賴于環境中物質的存在（如糖酵解途徑中的各種酶），稱為組合酶。糖

11、酵解途徑中的各種酶），稱為組合酶。n另一些酶只有在它們催化的底物（或底物的結另一些酶只有在它們催化的底物（或底物的結構類似物）存在時才能合成，此種酶稱為誘導構類似物）存在時才能合成，此種酶稱為誘導酶。酶。n凡能促進酶生物合成的現象，稱為誘導。凡能促進酶生物合成的現象，稱為誘導。n能阻礙酶生物合成的現象，則稱為阻遏。能阻礙酶生物合成的現象，則稱為阻遏。n與上述調節酶活性的反饋抑制等相比，調節酶的合成（即產酶量）而實現代謝調節的方式是一類較間接而緩慢的調節方式。n其優點則是通過阻止酶的過量合成，有利于節約生物合成的原料和能量。n在正常代謝途徑中，酶活性調節和酶合成調節兩者是同時存在且密切配合、協調

12、進行的。 （一）酶合成調節的類型（一）酶合成調節的類型 n1誘導n誘導酶：另一些酶只有在它們催化的底物（或底另一些酶只有在它們催化的底物（或底物的結構類似物）存在時才能合成，此種酶稱為物的結構類似物）存在時才能合成，此種酶稱為誘導酶。誘導酶。n誘導酶是細胞為適應外來底物或其結構類似物而臨時合成的一類酶。n能促進誘導酶產生的物質稱為誘導物，它可以是該酶的底物，也可以是難以代謝的底物類似物或是底物的前體物質。n外源誘導物：外源加入的。n內源誘導物：菌體代謝途徑的某些中間產物也能誘導該途徑的某些酶系的合成，這些中間產物稱為內源誘導物。酶的誘導合成類型酶的誘導合成類型n同時誘導同時誘導:當誘導物加入后

13、，微生物能同時或幾乎同時誘導幾種酶的合成，它主要存在于短的代謝途徑中。例如，將乳糖加入到Ecoli培養基中后，即可同時誘導出-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷酶和半乳糖苷轉乙酰酶的合成；n順序誘導順序誘導:先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達到對較復雜代謝途徑的分段調節。n2阻遏 在微生物的代謝過程中，當代謝途徑中某末端產物過量時，除用反饋抑制的方式來抑制該途徑中關鍵酶的活性以減少末端產物的生成外， 通過阻遏作用來阻礙代謝途徑中包括關通過阻遏作用來阻礙代謝途徑中包括關鍵酶在內的一系列酶的生物合成，從而更鍵酶在內的一系列酶的生物合成，從而更徹底地控制代謝和減少末端產物的合成。徹底

14、地控制代謝和減少末端產物的合成。n反饋阻遏：指代謝的終產物達到一定濃度時，反饋阻遏該代謝途徑的一種或幾種酶的生物合成。n阻遏作用有利于生物體節省有限的養料和能量。n阻遏的類型主要有兩種: 末端代謝產物阻遏 分解代謝產物阻遏。（1 1）末端產物阻遏）末端產物阻遏定義：指由某代謝途徑末端產物的過量累積而引起的阻遏。n對直線式反應途徑 ，末端產物阻遏的情況較為簡單，即產物作用于代謝途徑中的各種酶，使之合成受阻遏。 n對分支代謝途徑來說，情況就較復雜。 每種末端產物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。n多價阻遏多價阻遏：有兩種或兩種以上的末端產物的分支代謝途徑中，當分支代謝途徑中的幾種末端產物同時過

15、量就反饋阻遏其分支點以前的共同途徑的“公共酶”的合成，僅一種產物過量無阻遏作用。n末端產物阻遏在代謝調節中有著重要的作用，它可保證細胞內各種物質維持適當的濃度。（2）分解代謝產物阻遏）分解代謝產物阻遏定義：指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮源）或其分解產物存在時，被菌體迅速利用的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。n分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的碳源本身直接作用的結果，而是通過碳源（或氮源等）在其分解過程中所產生的中間代謝物所引起的阻遏作用。n因此，分解代謝物的阻遏作用，就是指代謝反應鏈中，某些中間代謝物或末端代謝物的過量累積而阻遏代謝途徑中一些酶合成的現象。 兩種調

16、節的對比酶合成的調節酶合成的調節酶活性的調節酶活性的調節不同點不同點調節對象調節對象通過酶量的變化通過酶量的變化控制代謝速率控制代謝速率控制酶活性，不涉控制酶活性，不涉及酶量變化及酶量變化調節效果調節效果相對緩慢相對緩慢快速、精細快速、精細調節機制調節機制基因水平調節，基因水平調節，調節控制酶合成調節控制酶合成酶分子水平調節，酶分子水平調節，調節酶活性調節酶活性相同相同點點細胞內兩種方式同時存在，密切配合，高效、準細胞內兩種方式同時存在，密切配合，高效、準確控制代謝的正常進行。確控制代謝的正常進行。三、能荷的調節三、能荷的調節 n能荷指細胞中ATP、ADP、AMP系統中可供利用的高能磷酸鍵的量

17、度。n能荷調節（或稱腺苷酸調節）：指細胞通過改變ATP、ADP、AMP三者的比例來調節其代謝活動。n細胞內3種腺苷酸含量不同，細胞的能荷狀態不同。能荷狀態用“能荷”表示 12能 荷100%ATPADPATPADPAMPn當細胞內全部為ATP，能荷為100%n當細胞內全部為ADP，能荷為50%nATP可以認為是糖分解代謝的末端產物，當ATP過量就對糖分解代謝產生反饋抑制，當ATP降解為ADP，能量釋放于其他的生化反應，反饋抑制被解除。 12能 荷100%ATPADPATPADPAMPR R曲線合成系統，如磷酸果糖激曲線合成系統，如磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶等。酶、檸檬酸合成酶等。U U曲線消耗曲

18、線消耗ATPATP的酶系，檸檬酸的酶系，檸檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶成酶(PRPP)(PRPP)等。等。 當能荷當能荷0.750.75，合成受到抑制，合成受到抑制，酶活性急速下降，消耗酶活性急速下降，消耗ATPATP的的酶活性急速上升。兩系統在酶活性急速上升。兩系統在0.850.85處交叉，酶系達到平衡。處交叉，酶系達到平衡。這種現象存在于許多生長狀態這種現象存在于許多生長狀態的細胞中。細胞通過調節腺的細胞中。細胞通過調節腺苷酸的比例，來協調分解代苷酸的比例，來協調分解代謝與合成代謝的代謝速率。謝與合成代謝的代謝速率。 第二節 代謝調控n微生物在正常生長條件下，可

19、以通過自我調節使機體內的代謝途徑與代謝類型互相協調與平衡，通常不會過量積累初級代謝產物。在某種條件下，過量積累的中間代謝產物也能夠被誘導酶轉化為次級代謝產物。但在人為條件的控制下，可以使微生物過量產生各種初級代謝產物和次級代謝產物。 n初級代謝產物控制比較簡單。它的形成一般只需要營養條件即可生成。 通過改變發酵工藝條件如pH、溫度、培養基組成和微生物遺傳特性等，達到改變菌體內的代謝平衡，過量產生所需要產物的目的。 n可通過發酵條件控制n改變細胞的滲透性 n改變菌種的遺傳特性 一、發酵條件的控制n1 各種發酵條件對微生物代謝的影響n同一種微生物在同樣的培養基中進行培養時，只要控制不同的發酵條件。

20、就可能獲得不同的代謝產物。 n如：啤酒酵母在中性和酸性條件下培養，可將葡萄糖氧化生成乙醇和二氧化碳；當在培養基中加入亞硫酸氫鈉或在堿性條件下培養時，則并不產生乙醇，而是產生甘油。 n控制不同的發酵條件，實際上是影響微生物自身的代謝調節系統，而改變其代謝方向，使之按人們所需要的方向進行，進而達到獲得高濃度積累所需要產物獲得高濃度積累所需要產物的目標。 2 使用誘導物n許多與蛋白質、糖類或其他物質降解有關的酶類都是誘導酶，在發酵過程中加入相應的底物作為誘導物，可以有效地增加這些酶的產量。n如：在木霉發酵生產纖維素酶中，加入槐糖可以誘導纖維素酶的產生；木糖可以誘導半纖維素酶的生成。青霉素?；缚捎帽?/p>

21、乙酸為誘導物。乙內酰胺酶發酵時，可以底物類似物為誘導物增加酶的產量。 3 添加生物合成的前體僅參與色氨酸的最后階段的合成，如果在發酵中加入鄰氨基苯甲酸，雖然色氨酸對第一個酶的反饋抑制仍然存在，但對由鄰氨基苯甲酸合成色氨酸并無影響，使色氨酸的合成可以不斷進行，從而大幅度提高了發酵產量。色氨酸生物合成途徑色氨酸生物合成途徑4 培養基成分和濃度的控制 n培養基即要保證微生物機體生長需要，又要利于代謝產物的合成，須考慮其的組成和濃度，盡量避免培養基使用不當引起的分解代謝阻遏。n在發酵培養基中通常采用適量的速效和遲效碳源、氮源的配比，來滿足機體生長的需要和避免速效碳、氮源可能引起的分解代謝阻遏。例如，用

22、甘油代替果糖作為碳源培養嗜熱脂肪酵母，可以使淀粉酶的產量提高25倍以上； 用甘露糖代替乳糖作為培養熒光假單胞菌的碳源，使纖維素酶產量提高1500倍以上。 改變細胞透性n在發酵過程中，可以控制使用那些影響細胞膜通透性的物質作為培養基的成分，有利于代謝產物分泌出來，避免了末端產物的反饋調節。n例如，利用棒狀桿菌的-酮戊二酸脫氫酶缺失突變株，在葡萄糖培養基中發酵生產谷氨酸，當谷氨酸濃度達到50mg/g(干細胞)時，由于反饋調節作用，谷氨酸的合成便終止。若將細胞中的谷氨酸釋放出細胞，而使胞內谷氨酸濃度降低，就可以解除反饋抑制，使谷氨酸繼續合成。 改變細胞的通透性的方法：1、限制培養基中生物素濃度在15

23、mg/L，控制細胞膜中脂質的合成；2、加入青霉素，抑制細胞壁肽聚糖合成中肽鏈的交聯；3、還可加入表面活性劑如吐溫80或陽離子表面活性劑，將脂類從細胞壁中溶解出來，使細胞壁疏松，通透性增加；4、控制MnMn2+、ZnZn2+的濃度，干擾細胞膜或細胞壁的形成。 另外，還可以通過誘變育種的方法，篩選細胞透性突變株。 n同樣增加細胞壁或細胞膜的通透性，對某些胞外酶的分泌也有一定作用。如在里氏木霉發酵過程中加入吐溫80，可提高纖維素酶的產量。 改變菌種的遺傳特性 反饋調節是微生物防止合成代謝產物過量產生的重要機制，解除反饋調節作用可以保證高水平積累各種代謝產物，除上所述外，改變微生物的遺傳特性，即改變酶

24、的活性或酶的合成系統，使之對反饋調節不敏感，也能夠達到過量生產代謝產物的目的。 篩選抗反饋調節突變株篩選抗反饋調節突變株： 通過誘變育種的方法獲得。包括營養缺陷型突變株、抗反饋調節突變株、組成型突變株、抗性突變株等的應用。 例如，在分支合成途徑中，利用黃色短桿菌抗-氨基-羥戊酸(蘇氨酸的一種結構類似物)的突變株發酵生產蘇氨酸，由于該菌株的同型絲氨酸脫氫酶對蘇氨酸的反饋抑制不敏感，可以使發酵液中蘇氨酸的濃度高達14g/L。 n在分支合成途徑中可以利用營養缺陷型突變株生產其中的一個末端產物。n選擇高絲氨酸脫氫酶營養缺陷型。大量生產賴氨酸。n在直鏈式合成途徑中，不能利用營養缺陷型突變株生產該途徑中的

25、末端產物，但可以利用這種菌株生產中間產物。例如，利用谷氨酸棒狀桿菌營養缺陷型(轉氨甲酰酶缺陷)可以大量積累鳥氨酸。 n分支合成途徑中，也可以利用雙重營養缺陷型生產某種代謝產物。例如利用谷氨酸棒狀桿菌的蘇氨酸、甲硫氨酸雙重營養缺陷型進行發酵，可以過量合成賴氨酸，賴氨酸濃度可達50g/L。 A B C D En除了利用抗反饋調節突變株和營養缺陷型菌株生產外，還可以利用既是抗反饋調節突變株，又是營養缺陷型菌株的雙重突變株進行氨基酸發酵。n例如，利用甲硫氨酸營養缺陷型和抗-氨基-羥戊酸的黃色短桿菌過量合成蘇氨酸；n利用酪氨酸營養缺陷型和抗對氨基苯丙氨酸的谷氨酸棒桿菌高水平積累苯丙氨酸。 人工控制黃色短

26、桿菌的代謝過程生產賴氨酸？營養缺陷第三節次級代謝產物的主要調控機制 n次級代謝是存在于某些生物如植物和某些微生物中一類特殊的代謝類型，次級代謝產物與人類的生活和健康長壽有著密切的關系，因此對其的研究受到了廣泛地重視。研究最多、最著名的是抗生素，其他包括生長刺激素、生物堿、維生素、色素、毒素等。 一、次級代謝的調節類型n因為次級代謝產物的種類在不同的微生物中非常不同，所以次級代謝途徑遠比初級代謝復雜，其代謝調節類型的多樣亦可想而知。已知抗生素等次級代謝產物生物合成的調控類型包括誘導調節、碳分解產物調節、氮分解產物調節、磷酸鹽調節、反饋調節、生長速度調節等。 酶合成的誘導調節n在次級代謝途徑中，某

27、些酶也是誘導酶，在底物或底物的結構類似物存在時才會產生。例如，卡那霉素-乙酰轉移酶是在6-氨基葡萄糖-2-脫氧鏈霉胺（底物）的誘導下才能合成。參與展開青霉的棒曲霉素合成的酶是被生物合成中的中間產物6-氨基水楊酸、龍膽酰醇和龍膽酰醛順序誘導合成。反饋調節 反饋調節在次級代謝產物的生物合成中有著重要的作用，包括n次級代謝產物的自身反饋調節、n分解代謝產物調節、n初級代謝產物的反饋調節。 1、次級代謝產物的自身反饋抑制和反饋阻遏n在多種次級代謝產物的發酵中，如青霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、嘌呤霉素、霉酚酸、殺真菌素、麥角堿等的生物合成途徑中，都發現了末端產物的反饋調節作用。 n例如：嘌呤霉素合成

28、途徑中，嘌呤霉素可以反饋抑制其生物合成途徑中催化最后一步反應的酶甲基轉移酶的活性；n卡那霉素合成途徑中，卡那霉素能夠反饋抑制其合成途徑中催化最后一步反應的酶N-乙酰卡那霉素轉移酶的活性；n麥角堿合成途徑中，麥角堿能抑制合成途徑中的二甲基丙烯色氨酸合成酶和裸麥素堿環化酶的活性；n氯霉素合成途徑中，氯霉素能反饋阻遏其合成途徑中第一個酶芳香胺合成酶的活性，但不影響產生菌體內其他芳香化酶的活性。 n抗生素生產菌的生產能力與自身抑制所需抗生素濃度呈正相關性，生產能力越高的菌株，反饋抑制所需抗生素濃度也越高。n如產黃青霉Q176的生產能力為420g/ml，受到抑制的濃度為2mg/ml ；n產黃青霉菌株RL

29、1951的生產能力為125g/ml，受到抑制的濃度為200g/ml 。 2分解代謝產物調節定義：指易被菌體迅速利用的碳源和氮源及其分解產物對其他代謝途徑的酶類的調節作用。n在許多抗生素發酵中，都發現了葡萄糖的抑制作用，如青霉素、鹽霉素、春日霉素、吲哚霉素、放線菌素、卡那霉素、新霉素、桿菌肽等。次級代謝產物的生物合成，一般是在葡萄糖等速效碳源耗至一定濃度才開始。除了葡萄糖外，凡能促進產生菌生長速度的碳源，對次級代謝產物生物合成都表現出抑制作用。次級代謝產物的合成速率與產生菌的生長速率呈相反關系。 n例如，在放線菌素生物合成中的氧化酚嗯嗪合成酶，受葡萄糖的阻遏。短桿菌肽合成中，葡萄糖分解生成的乙酸

30、和丙酸，在低pH條件下對短桿菌肽的合成產生阻遏作用。 n氮分解代謝產物調節也存在于次級代謝中。n例如，以銨鹽作為鏈霉素產生菌的唯一氮源時，可以抑制鏈霉素的合成；n在利用煙曲霉生產三羥甲苯中，無機氮源有利于菌體生長，但不利于三羥甲苯的合成；n氮分解代謝產物的阻遏作用也存在于頭孢霉素生物合成中。 3初級代謝產物的調節某些初級代謝產物可以調節次級代謝產物的合成，有兩種情況：1初級代謝產物和次級代謝產物的合成有一條共同的合成途徑，當初級代謝產物積累時，反饋抑制了某一步反應的進行，而最終抑制了次級代謝產物的合成。2初級代謝產物直接參與次級代謝產物的生物合成，即初級代謝產物是次級代謝產物的生物合成的前體，

31、當此種初級代謝產物因為積累，反饋抑制了它自身的合成時，必然也同時影響了次級代謝產物的合成。 如：青霉素合成中，賴氨酸的過量抑制了同型(高異)檸檬酸的合成，進而抑制了-氨基己二酸的形成，這樣即抑制了賴氨酸的合成，也抑制了青霉素的合成，因為賴氨酸與青霉素的合成有一段共同的合成途徑 (三)磷酸鹽的調節n在抗生素等多種次級代謝產物合成中，高濃度磷酸鹽表現出較強的抑制作用，稱為磷酸鹽調節。磷是微生物生長繁殖的必需元素，濃度為0.3300mmol/L時，能支持微生物細胞的生長，但當濃度超過10mmol/L時，就能抑制許多抗生素的生物合成。因此，磷酸鹽是一些次級代謝的限制因素。n微生物合成的次級代謝產物途徑

32、的不同，磷酸鹽表現的調節機制也不同 。1、磷酸鹽能促進初級代謝，抑制菌體的次級代謝 在微生物的代謝中，磷酸鹽除影響糖代謝、細胞呼吸及細胞內ATP水平外，還控制著產生菌的DNA、RNA、蛋白質和次級代謝產物的合成。如：向正在合成殺假絲菌素的灰色鏈霉菌培養液中添加5mmol的磷酸鹽，產生菌對氧的需要量顯著增加，抗生素的合成立即停止，同時細胞內的RNA、DNA和蛋白質的合成速率恢復到菌體生長時期的速率。當磷酸鹽被耗盡時，菌體的呼吸強度，DNA、RNA和蛋白質的合成速率又降至抗生素合成期的狀態，抗生素重新開始合成。 2過量磷酸鹽抑制次級代謝產物前體的生物合成n在鏈霉素合成中，肌醇是合成鏈霉胍的前體(鏈

33、霉胍是組成鏈霉素的亞單位)，是由葡萄糖衍生來的。過量的磷酸鹽能引起菌體內焦磷酸濃度增高，焦磷酸是催化6-磷酸葡萄糖向1-磷酸肌醇轉化的6-磷酸葡萄糖環化醛縮酶的競爭性抑制劑。因此，培養液中磷酸鹽濃度高時就抑制肌醇的形成，則必然影響鏈霉素產量。 3磷酸鹽阻抑次級代謝中的磷酸酯酶 在鏈霉素等的生物合成途徑的最后一個中間體，是無生物活性的磷酸化產物鏈霉素磷酸酯。此酯在磷酸酯酶的作用下生成相應的鏈霉素和磷酸。另外在鏈霉素生物合成中有三步是在磷酸酯酶作用下的去磷酸反應。上述的磷酸酯酶受到無機磷酸鹽的調節。所以在鏈霉素等氨基糖苷類抗生素的發酵生產時，要很好控制發酵培養基中的磷酸鹽濃度。 (四)ATP的調節

34、作用 n在研究四環素的生物合成過程中發現，產生菌體內的ATP水平調節著四環素的合成。 n丙二酰CoA是四環素合成的前體。在菌體生長旺盛期，乙酰CoA羧化酶活性高，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和羧基轉移酶的活力很低，在四環素合成期與其相反。 菌體生長時期，過量的無機磷和ATP對磷酸烯醇丙酮酸羧化酶抑制作用沿左側途徑進行， 合成時期沿綠色途徑進行。(五)產生菌生長速率的調節 在豐富培養基中進行的分批發酵動力學研究表明，大多數發酵過程都分為生長期和生產期。在生長期次級代謝產物合成酶受到阻抑作用，次級代謝產物不被合成。主要是一些抗生素合成酶受到抑制或阻遏。 用恒化器培養法研究短桿菌肽S合成酶的合成時發現，調

35、節短桿菌肽S合成酶合成的是菌體的生長速率。當稀釋率高時(0.450.5/h)，合成的酶量很少，降低稀釋率，酶量就增加。限制不同營養成分，出現最高酶活的稀釋率是不同的。限碳源時，酶的比活最高。由此提出調節次級代謝產物生物合成的因子是菌體的比生長速率，而不是某種營養物質，在青霉素、四環素等的發酵生產過程中，控制菌體的比生長速率，能提高發酵水平，可能與調節菌體比生長速率有關。 次級代謝調節：1酶合成的誘導調節2反饋調節：次級代謝產物自身， 分解代謝產物的調節 初級代謝產物的調節3磷酸鹽的調節：促進初級代謝，抑制次級代謝； 過量抑制次級代謝的前體； 阻抑次級代謝的磷酸酯酶。4ATP調節5產生菌生長速率的調節 第四節 代謝工程n代謝工程系指利用基因工程技術，定向地對細胞代謝途徑進行修飾、改造，以改變微生物的代謝特性，并與微生物基因調控、代謝調控及生化工程相結合，構建新的代謝途徑，生產新的代謝產物的工程技術領域。n在代謝工程設計中，主要有改變代謝流、擴展代謝途徑和構建新的代謝途徑三種. 一、改變代謝途徑n改變代謝途徑是指改變分支代謝途徑的流向，阻斷其他代謝產物的合成，以達到提高目標產物的目的。n改變代謝途徑有各種方法，如加速限速反應、