1、 血站核酸檢測血站核酸檢測 甘肅省紅十字血液中心甘肅省紅十字血液中心血站核酸檢測的意義 核酸檢測（NAT）可以 有效地縮短病毒特異抗原和抗體免疫測定的“窗口期”，從而減少輸血風險，提高輸血安全。乙型肝炎病毒（HBV）感染檢測中，NAT除可縮短HBV感染檢測的窗口期外，還可以減少HBV急性感染恢復期、慢性隱匿性HBV感染以及變異病毒株感染的漏檢。丙型肝炎病毒（HCV）感染檢測中，可將HCV感染檢測的窗口期縮短，減少免疫靜默感染的漏檢。人類免疫缺陷病毒（HIV）感染檢測中，可將HIV感染檢測的窗口期縮短。 檢測窗口期 Window Period核酸研究的歷史 1869 1869 米舍爾（米舍爾（F

2、riedrich MiescherFriedrich Miescher） 從膿球分離出細從膿球分離出細胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名為胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名為“核核素素”(nuclein)”(nuclein)。 1944 1944 美國微生物學家埃弗里（美國微生物學家埃弗里（O.T. Avery O.T. Avery ）等的肺）等的肺炎球菌轉化實驗。炎球菌轉化實驗。 1953 1953 沃森和克里克（沃森和克里克（WATSONWATSON，CRICKCRICK）-DNA-DNA雙螺旋雙螺旋Francis Crick Francis Crick 核酸研究的歷史 1960196

3、0年代中期桑格年代中期桑格(Sanger)(Sanger)的的DNADNA測序法測序法 1972 1972 伯格伯格(Paul Berg) (Paul Berg) 重組重組DNADNA技術技術 引起人腫瘤的猴病毒基因與噬菌體lambdalambda的重組的重組 1973 1973 博耶（博耶（Herbert BoyerHerbert Boyer）和科恩（）和科恩（Stanley CohenStanley Cohen）- -使用重組使用重組DNADNA技術首次得到了重組技術首次得到了重組DNADNA微生物微生物( (基因工程技基因工程技術術) ) 1983 1983 穆利斯（穆利斯（Kary M

4、ullis) PCRKary Mullis) PCR技術技術核酸的種類DEOXYRIBONUCLEICACID（DNA）RIBONUCLEIC ACID（RNA） ribosome RNA(rRNA) transfer RNA(tRNA) messenger RNA(mRNA)核酸的分子組成元素組成 C H O N P C H O N P （恒定，（恒定，910%910%）基本結構單位核苷酸核苷酸 磷酸 核苷（核苷（戊糖 、堿基）、堿基）核酸的理化性質核酸分子具有強烈的紫外吸收DNA變性是雙鏈解離為單鏈的過程 DNA的增色效應 Tm值變性的核酸可以復性或形成雜交雙鏈 復性 退火 核酸分子復性和

5、雜交示意圖磁珠提取的原理：第一步：細胞的裂解：破碎細胞，并向溶液中加入磁珠第二步：結合核酸：pH較低，在高鹽環境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與 優化試劑中的核酸結合第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復多次）第四步：核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環境下，核酸被洗脫下來核酸檢測基本原理核酸檢測：一系列直接檢測病原體核酸的技術的總稱，對靶核酸直接擴增或對其附帶的信號擴增，使看不見的極微量的核酸變成直觀的光電或可視信號。NAT檢測技術方法PCR擴增技術轉錄介導的擴增方法（TMA 、NASBA）其它NAT技術（bDNA、LAMP、LCR、SDA等）PCR 原理DNADNA

6、TMA的原理的原理Transcription-Mediated Amplification 轉錄介導轉錄介導的擴增技術的擴增技術模擬DNA 轉錄成轉錄成mRNA 的的自然過程自然過程DNA模板在反應中作為中模板在反應中作為中介介利用2個引物和個引物和2種酶種酶(RNA聚合酶和逆轉錄酶）聚合酶和逆轉錄酶）RNA聚合酶與聚合酶與DNA 模板的模板的啟動子序列結合啟動子序列結合等溫擴增（41.5）轉錄翻譯逆轉錄TMA的原理的原理特異性靶標捕獲特異性捕獲探針與病毒核酸分子及內標物雜交結合，并將其固定在磁珠表面。對體系進行重復的洗滌，去除血液樣品中除病毒核酸外的其他成分。轉錄介導的擴增借助逆轉錄酶和RN

7、A多聚酶的共同作用，在等溫條件下，經過一小時的擴增得到約10億個目標產物片斷。雙動力學化學發光檢測 試劑消除未結合的檢測探針，雙動力學化學發光檢測，分別檢測內標與病毒分子信號。理想的核酸擴增實驗室設計A理想的核酸擴增實驗室設計B核酸擴增檢測實驗室設計的一般原則各區獨立注意風向因地制宜方便工作關于“區域”合并如使用擴增和產物分析同時完成的實時熒光PCR儀進行核酸擴增檢測，擴增區和產物分析區可以合并。如使用核酸提取、擴增及產物分析等均在一臺儀器上完成的全自動核酸檢測分析儀，標本制備區、擴增區和產物分析區可合并。符合基本要求的核酸擴增檢測實驗室的條件 （1）試劑準備區、標本制備區和擴增及產物分析區等

8、三個或四個區域在物理空間上，必須是完全相互獨立的，各區域無論是在空間還是在使用中，應始終處于完全的分隔狀態，不能有空氣的直接相通。（2）各區的可移動的儀器設備及各種物品包括實驗記錄本、記號筆、試管架及清潔用具等必須專用。（3）應在標本制備區、擴增及產物分析區等相對有可能出現“污染物”的區域安裝排風扇或其它排風和有效的裝置，以使空氣按試劑準備區標本制備區擴增（及產物分析）區方向流動。核酸擴增實驗室的工作流程 試劑準備區 標本制備區 擴增區及擴增產物分析區試劑貯存準備區 核酸擴增實驗室中最為“潔凈”的區域，不應有任何核酸的存在，包括試劑中所帶的標準品和陽性對照。所有實驗用潔凈物品如離心管、吸頭等的

9、存放和準備處。商品試劑盒自制試劑：一次較大量配制，然后分裝成小瓶保存，每次檢測時，取出一小瓶使用，未用完的即棄掉，不再使用。儀器設備主要有加樣器、天平、離心機和冰箱等，最好配備超凈工作臺。標本制備區 儀器設備主要有混樣設備、核酸提取儀、生物安全柜、加樣器、高速臺式（冷凍）離心機、加熱模塊或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不應放在實驗室門口等易受人員走動影響的地方，也不應直對分體式空調。主要是用于血液樣本的混樣、核酸樣本的提取。加樣器吸頭必須帶濾芯。使用加熱模塊時，如在模塊孔中填入二氧化硅細砂，然后將標本管置于細砂中溫育，可得到較為一致的溫育溫度。擴增及產物分析區 擴增反應體系的配制和提取核酸的加入，

10、可在標本制備區也可在本區內進行，關鍵是要防止產物的污染。如果空間允許的話，也可在一個獨立的區域內進行。加樣時，先加提取的核酸模板樣本，每加完一個即蓋好蓋子，然后加陽性質控核酸模板，再就是標本制備陰性質控和僅含按樣本一樣稀釋的主反應混合液的擴增陰性質控，這樣做的目的是，最大可能地測出以前擴增產物的交叉污染。擴增及產物分析區熱循環儀的電源應專用，并配備一個不間斷電源（UPS）或穩壓電源。每次擴增后，可使用可移動紫外燈對擴增熱循環儀進行照射。擴增儀應定期進行校準。工作流程關注采集、保存、運輸的關鍵點留樣方式、采血管采血后什么時間離心采血后保存溫度、時間離心后保存溫度、時間（運輸）檢測前的保存溫度、時

11、間長期保存的樣本第一步：標本的采集-采血管無菌真空采血管一、血清管普通血清管帶分離膠的血清管二、抗凝管EDTA 2K或3K抗凝管EDTA 2K抗凝間分離膠（PPT)枸櫞酸鈉抗凝管第一步：標本的采集-留樣方式 最佳方式：旁袋1管 5ml用于核酸檢測 2管 5ml用于酶免疫測定等 3管用于長期保存留樣 旁路采樣1管 5ml用于核酸檢測 2管 5ml用于酶免疫測定等 3管用于長期保存留樣 小辮留樣(不可取)1管 5ml用于核酸檢測 2管 5ml用于酶免疫測定等第二步：標本的采集-離心離心條件 800-1600g 20min離心時間 4小時以內 以免RNA的降解第三步：標本的運送應采用不易破碎的容器裝

12、載標本溫度2-8 C符合生物安全標準第四步：標本的接收保存確認標本數量 運輸狀態 標本狀態：溶血、脂血保存： 用于檢測的樣本管：檢測前保存 4小時內離心，離心后2天內進行檢測的可存放2-8 C。 用于留樣備查的樣本：3個月以內存放于-20 C以下，3個月以上置于-70 C以下。樣本匯集在Star上進行準備工作：將采血管開蓋后裝載到專用32孔樣品架上。采血管上條形碼一律面向條碼掃描器，以方便掃描條碼。按照要求，將TIP頭、PCR板、24深孔板、洗脫管、磁套、廢棄管放置于平臺相應位置。樣本匯集樣本匯集樣本匯集核酸提取同樣在Star核酸提取儀上進行，緊跟Pooling之后，利用自動移液配置裂解液、結

13、合液、洗液、洗脫液等，利用磁性分離功能自動完成核酸樣本的裂解、提取、純化、PCR試劑配制、PCR上樣等實驗操作。核酸擴增結果確認陰性反應：進入合格血液的放行程序。陽性反應：單檢分項目檢測呈陽性反應單檢混合項目檢測呈陽性反應混樣分項目檢測呈陽性反應1.混樣混合項目檢測呈陽性反應混樣分項目檢測呈陽性反應按照試劑說明書進行雙孔拆分檢測檢出陽性標本陽性反應標本陰性反應標本進入血液的隔離程序，填寫相關報表，將標本及血液篩查檢測報告送衛生部臨床檢驗中心進入合格血液的放行程序全部標本為陰性反應進入合格血液的放行程序，實驗室需查找原因并完成分析報告質量控制室內質量控制室間質量評價遼寧省血液中心 實驗室工作調整

14、工作模式:早8晚4標本接收-采血當天 EIA檢測-采集后第2天,當天出最終結論報告.核酸檢測:全血EIA(合格)NAT(第3天)血小板:EIA與NAT平行檢測(第2天)采用依據:快篩、陽性率低確保報告時限 血小板30小時 全血54小時7+1檢測模式檢測模式標本質量的控制采血管選擇采樣方式 旁袋采樣（理想） 血袋導管采樣(被稀釋的可能、規定順序-風險降到最低)標本正確標識 措施： 動作連續不能中斷 清場 計算機控制（PDA實物核查、及時傳輸采集信息）離心時間 4小時內計算機控制保證標本、血液同源標本采集人員采用PDA 對血袋、標本管等實物進行核查離心處理一、標本采集后離心離心處理二、標本接收后實

15、驗室再離心江蘇省血液中心 核酸檢測實驗室的設置應關注的細節各實驗區可以移動的物品最好用不同顏色進行標記。以防各區混用。樣品制備室最好多配備一臺44樣品冰箱，用于樣品冰箱，用于混樣后樣品的臨時保存；陰陽性對照試劑盒的保混樣后樣品的臨時保存；陰陽性對照試劑盒的保存。存。樣品制備室最好配備開蓋機，用于真空采血管的去帽。在樣品制備室，實驗耗材、試劑準備區域和樣品處理區域最好分開。核酸檢測實驗室的設置應關注的細節各區還需配備：無粉手套，專用工作服，一次性鞋套、口罩，一次性吸水紙，紗布塊。55.5g/100ml的的次氯酸鈉溶液，的乙醇溶液等。次氯酸鈉溶液，的乙醇溶液等。在樣本制備區，生物安全柜不應放在實驗

16、室門口等易受人員走動影響的地方，也不應直對分體式空調。混樣儀的加樣吸頭必須帶濾芯。樣品制備區和核酸檢測區的儀器還應配備電源。核酸檢測實驗室的設置江蘇省血液中心核酸檢測實驗室簡介實驗分區：分4個室個室(區區)：試劑準備室：試劑準備室(區區)，為，為藍色藍色標記；標本制備室標記；標本制備室(區區)，為，為綠色綠色標記；核酸擴增檢測標記；核酸擴增檢測室室(區區)，為，為黃色黃色標記；全自動核酸檢測室標記；全自動核酸檢測室(區區)，為，為灰灰色色標記。標記。采用的檢測系統：科華和羅氏兩套檢測系統,兩者共兩者共用試劑準備室用試劑準備室(區區)和標本制備室和標本制備室(區區)，核酸擴增檢測，核酸擴增檢測分

17、別在各自的擴增檢測區。分別在各自的擴增檢測區。核酸檢測樣品的質量保證應注意的細節首先要制定樣品采集手冊，并對采血人員進行全員培訓。采血管的選擇：最好選擇EDTA 2KEDTA 2K或或3K3K抗凝帶分離抗凝帶分離膠的抗凝管。膠的抗凝管。注意樣品采集后的充分混勻，一般顛倒次以上。樣品離心：應采用大容量低溫離心機，離心要充分，離心條件最好g g、分鐘。、分鐘。樣品的開蓋：應在離心后，放冰箱靜置minmin后，再開蓋。應在生物安全柜中進行。后，再開蓋。應在生物安全柜中進行。混樣至拆分檢測其間, ,將樣品放將樣品放冰箱臨時保存。冰箱臨時保存。核酸檢測樣品的質量保證標本的采集: 采用無采用無DNA酶、無酶、無RNA酶、帶分離膠、酶、帶分離膠、EDTA-K2抗凝、無菌真空采血管抗凝、無菌真空采血管( BD PPTTM血漿制血漿制備管）。備管）。為保證標本采集后能