1、基于高通量測序技術的無創產 前診斷 染色體非整倍體簡介染色體非整倍體簡介 無創產前基因檢測背景介紹無創產前基因檢測背景介紹 無創產前基因檢測方法學介紹無創產前基因檢測方法學介紹 1. 大規模并行測序法大規模并行測序法 （BGI, BerryGenomics等）等） 2. 目標區域擴增測序法目標區域擴增測序法 （Natera，公司），公司） 小結小結 染色體疾病：染色體疾病： 染色體疾病是染色體遺傳病的簡稱。主要是指由于染色體數目、結構異 常引起的疾病。其中最為常見的是21三體綜合征（T21）、18三體綜合征（ T18）、13三體綜合征（T13）三大染色體疾病。染色體疾病患兒多表現為 智力低下、

2、生長發育遲緩等，目前無有效治療手段，由此給社會造成了沉重 的經濟負擔，對家庭造成的心理負擔和精神痛苦更是無法用金錢來衡量。 疾病名稱 21三體綜合征 （T21） 18三體綜合征 （T18） 13三體綜合征 （T13） 臨床特征 先天性智力障礙、 生長發育遲緩并伴 發多系統畸形 先天性智力低下、 宮內發育遲緩、頭 小畸形、小或高腭、 低耳位、短胸骨、 手呈特殊握狀等 先天性智力低下、 宮內發育遲緩、多 發畸形、小眼、兔 唇、腭裂、前腦畸 形、短頸、多指 （趾）、頭小畸形 發病率 1:600-1:800 1:3500-1:7000 1:5000-1:6000 發病原因 21號染色體三體 18號染色

3、體三體 13號染色體三體 出生缺陷的社會壓力 現有的產前檢測技術現有的產前檢測技術 檢測技術孕周描述 血清學篩查1113周 1420周 5%假陽性 20%40%漏診率 頸項透明帶 （NT）檢測 1114周5%假陽性 20%40%漏診率 絨毛取樣1013周1%3%流產率 羊水穿刺1621周0.5%1%流產率 臍靜脈穿刺2028周0.5%1%流產率 無創DNA產前檢查1226周無流產風險 準確率99% 金標準：核型分析 基于高通量測序的產前診斷 外周血腫瘤游離 DNA 孕婦外周血胎兒 游離DNA 2021-7-14 2021-7-14 游離DNA的發現 高通量測序-定量-定性 無創傷產前診斷 20

4、21-7-14 基于高通量測序的產前診斷 1.全基因組低覆蓋度測序 2.目標區域測序-基因分型 2021-7-14 數據分析： Base Calling以后得到36bp 的短片段 利用Pipeline軟件比對每條 短片段分別屬于幾號染色體 統計各條染色體的讀段數， 計算21號染色體（胎兒+母 體）在所有染色體讀段數中 所占的比例 利用SigmaStat統計學軟件 計算得出診斷結果 無創方法學示意 2021-7-14 發表的無創產前文章 證明性研究 Chiu RSparks A et al,AJOG,2008 WK et al,Proc Nati Acad Sci,2008 Fan Hc et

5、al, Nati Acad Sci,2008 Chiu RWK et al,Clin Chem,2010 Sehnert AJ et al,Clin Chem,2011 大規模驗證性研究 Chiu RWK et al, BMJ,2011 Ehrich M et al,AJOG,2011 Palomaki GE et al, Genet Med 2011 Bianchi DW et al,Obstet Gynecol 2012 Norton ME et al,AJOG,2012 2021-7-14 大規模平行測序法-關鍵點-文獻解讀 1.游離DNA的提取-建庫 2.多少覆蓋度的測序才能將非整倍體

6、準確分離 3.胎兒游離DNA在母血中所占的比例 4.測序的gc 偏向性 5.需要的陰性樣本質控量 6.在不同的平臺上的實現（illumina-life) 2021-7-14 游離DNA的提取-建 庫 將游離DNA最大程度的提 取 2021-7-14 測序所需的reads數 成本準確度 2021-7-14 胎兒游離DNA在母血中所占的比例 real Depth coverage Ideal Depth coverage GC-bias sequencing biases in GC-rich and GC-poor regions with high-throughput sequencing

7、technologies gc矯正法的流程 50kb切割基因組切割基因組 計算計算50kb內內 gc%含量含量 計算計算50kb內的內的 reads數數 Loess 標準化處理標準化處理 計算校正后計算校正后 的的reads數數 計算計算校正后的校正后的z值值 2021-7-14 gc校正的效果 2021-7-14 需要多少陰性樣本庫做質控？ After 100,sd of GR is becoming stable 2021-7-14 可改進的方向： 1.富集胎兒游離DNA 2.改善基因組擴增不均一性 3.精確定量cfDNA的含量 2021-7-14 1.母血離心分母血離心分 離離 2.染色

8、體提取染色體提取3.高通量測序高通量測序4.生物信生物信 息息 5.結果判斷結果判斷 基于目標區域的基因分型方法 2021-7-14 基于目標區域的基因分型方法 10000多個 SNP位點 多重pcr 目標區 域測序 2021-7-14 構造了一個貝葉斯推斷模型 基于目標區域的基因分型方法 2021-7-14 為何需要低風險的研究？ 目前的研究主要是集中于高風險的婦女。 胎兒循環DNA的含量在這部分人群中的含量是比較高的。 因此這種檢驗的方法對低風險的婦女是不夠健壯的。 2021-7-14 為何需要低風險研究？ 我們知道我們知道有些事情， 我們知道我們不知道有些事情， 也有一些事情，我們不知道我們不知道 2021-7-14 未來：胎兒全基因組測序 無創產前診斷的延伸 2021-7-14 未來：胎兒全基因組測序 2021-7-14 觀察狀態 隱藏狀態 隱馬科夫模型（hidden makov model) 無創產前診斷的另一個方向 方向方向原理原理優勢優勢缺點缺點 血液游離DNA基于高通量測序 技術 操作簡單，準確 性高 目前只有21,13,18 非整倍體比較成 熟 母外周血胎兒游離 有核紅細胞 基于細胞捕獲技 術 無母源dna干擾， 診斷項目更多， 更快更便宜 紅細胞分