1、第一節(jié) 吸光光度法的基本原理 第二節(jié) 光吸收的基本定律 第三節(jié) 吸光光度法分析條件的選擇 第四節(jié) 分光光度計 第五節(jié) 吸光光度法的測定方法 第十三章 吸光光度法 第十三章吸光光度法 吸光光度法是基于物質對光的選擇性吸收而 建立的一種分析方法，包括比色法、可見吸光光 度法、紫外吸光光度法和紅外光譜法等。 吸光光度法屬于儀器分析方法，它所測定的 是物質對光的吸收程度。 吸光光度法主要具有以下特點： （1）測定的靈敏度高。常用于測定質量分數(shù) 為 10-3 1 的微量組分，甚至可測定質量分 數(shù)低至 10-5 10-4 的痕量組分。 （2）測定的準確度較高。一般吸光光度法測 定的相對誤差為 2 5，若使

2、用精密儀器，相 對誤差可降至 1 2，完全可以滿足微量組分 測定的要求。 第十三章吸光光度法 （3）儀器設備簡單，操作簡便、快速，選 擇性好。由于新的顯色劑和掩蔽劑不斷發(fā)現(xiàn)， 提高了選擇性，一般不需分離干擾物質就能進 行測定。 （4）應用廣泛。幾乎所有的無機離子和具 有共軛雙鍵的有機化合物都可以直接或間接地 用吸光光度法進行測定。 第十三章吸光光度法 第一節(jié) 吸光光度法的基本原理 一、光的基本性質 二、物質對光的選擇性吸收 三、吸收曲線 第十三章吸光光度法 一、光的基本性質 波譜名稱 波長范圍 分 析 方 法 射線 0.005 0.17 nm 中子活化分析，穆斯堡爾譜法 X 射線 0.1 10

3、 nm X 射線光譜法 遠紫外 10 200 nm 真空紫外光譜法 近紫外 200 400 nm 紫外光譜法 可見光 400 750 nm 比色法，可見吸光光度法 近紅外 0.75 2.5紅外光譜法 中紅外 2.5 50紅外光譜法 遠紅外 50 1000紅外光譜法 微 波 1 1000 mm 微波光譜法 射 頻 1 1000 m 核磁共振光譜法 m m m 表 13-1 電磁波譜 第十三章吸光光度法 光具有波粒二相性。光的波長、頻率 、速率 c、能量 E 之間的關系為： 不同波長的光具有不同的能量，光的波長越短， 光的能量就越大；光的波長越長，光的能量就越小。 /Ehvhc 第十三章吸光光度法

4、 二、物質對光的選擇性吸收 人的眼睛能感覺到的光稱為可見光，其波長 在 400 760 nm 范圍內。通常將具有同一波長的 光稱為單色光，由不同波長的單色光組合得到的 光稱為復合光。 物質之所以呈現(xiàn)不同的顏色，是由于物質對 不同波長的單色光選擇吸收而產(chǎn)生的。當一束白 光通過一有色溶液時，某種波長的單色光被溶液 吸收，而其他波長的單色光透過溶液。因此，溶 液呈現(xiàn)的顏色取決于透過光的顏色。 第十三章吸光光度法 物質的 顏色 吸 收 光 物質的 顏色 吸 收 光 顏色 /nm顏色 /nm 黃綠 紫 400 450紫 黃綠 560 580 黃 藍 450 480 藍 黃 580 600 橙 綠藍 48

5、0 490 綠藍 橙 600 650 紅 藍綠 490 500 藍綠 紅 650 760 紫紅 綠 500 560 如果將兩種單色光按適當?shù)谋壤旌虾蟮玫桨坠猓?則這種單色光稱為互補色光。顯然，透過光和吸收光是 互補色光。 表 13-2 物質的顏色與吸收光顏色的關系 第十三章吸光光度法 三、吸收曲線 如果將不同波長的光通過一定濃度的某一溶 液，分別測定溶液對各種波長的光的吸光度。以 入射光的波長為橫坐標，相應的吸光度為縱坐標 作圖，可得到一條吸光度隨波長變化的曲線，稱 為吸收曲線或吸收光譜。 吸收曲線中吸光度最大時所對應的波長稱為 最大吸收波長。當溶液的濃度不同時，其吸收曲 線的形狀和最大吸收

6、波長的位置不變，只是吸光 度隨濃度的增大而增大。 第十三章吸光光度法 KMnO4 的吸收曲線 第十三章吸光光度法 第二節(jié) 光吸收的基本定律 一、朗伯-比爾定律 二、偏離朗伯-比爾定律的原因 第十三章吸光光度法 一、朗伯-比爾定律 吸光度和透光率分別定義為： 0 lg I A I 0 I T I 吸光度與透光率的關系為： def def A =lgT 第十三章吸光光度法 1760 年， 朗伯指出： 一束平行單色光通過 有色溶液后，光的吸收程度與溶液液層的厚度成 正比。 A = k1 d 1852 年，比爾指出：一束平行單色光通過有 色溶液后，光的吸收程度與溶液的濃度成正比。 A = k2 cB

7、將朗伯定律和比爾定律合并起來，就得到朗 伯-比爾定律： B =Ad c 例題 第十三章吸光光度法 例 13-1 用鄰菲咯啉法測定鐵，已知 Fe2+ 的 質量濃度為 1.010-3 g L-1。用 2 cm 吸收池在波 長 508 nm 處測得吸光度為 0.38，計算鐵() -鄰菲 咯啉配離子的摩爾吸收系數(shù)。 解：Fe3+ 濃度為： 2+3 2+51 2+ (Fe )1.0 10 (Fe )1.8 10 mol L (Fe )55.85 c M 配離子的摩爾吸收系數(shù)為： 5 B 521 0.38 1.8 100.20 1.1 10 dmmol A c d 第十三章吸光光度法 若溶液的組成用質量濃

8、度表示，朗伯 - 比爾 定律可表示為： 摩爾吸收系數(shù)與吸收系數(shù)的關系為： 溶液中含有多種吸光物質時，若吸光物質之 間沒有相互作用，則溶液吸光度等于各吸光物質 的吸光度之和： B Aa d B a M 121 122 =+= () iii AAAAdccc 第十三章吸光光度法 二、偏離朗伯-比爾定律的原因 根據(jù)朗伯-比爾定律，以 A 為縱坐標，以 cB 或 B 為橫坐標作圖，應得到一條通過原點的直線。 但在實際測定中，常會出現(xiàn)標準曲線偏離直 線的現(xiàn)象，曲線向上或向下發(fā)生彎曲，這種現(xiàn)象 稱為偏離朗伯-比爾定律。 第十三章吸光光度法標準曲線 第十三章吸光光度法 標準曲線的偏離 第十三章吸光光度法 1

9、. 非單色光引起的偏離 假設入射光僅由波長為 和 的兩種單色 光組成，其強度分別為 I01 和 I02 ，當通過濃度為 cB、厚度為 d 的吸光物質溶液后，透射光的強度 分別為 I1 和 I2。 （一）物理因素引起的偏離 1 2 對波長為 的單色光： 01 11B 1 lg I Adc I 1B 10110 dc II 1 第十三章吸光光度法 對波長為 的單色光： 02 2 2 lg I Adc I 2B 20210 dc II 2B 2 實際測定的是它們的總吸光度 A總。總入射 光強度為 I01I02，總透射光強度為 I1I2 ： 01020102 120102 lglg 1010 dcdc

10、 IIII A IIII 1B2B 總 若12，則有： B 0102 0102 lg ()10 dc II Adc II B總 即總吸光度與濃度仍服從朗伯-比爾定律。 第十三章吸光光度法 上述討論可能對應以下兩種不同的情況： （1） 很小，可近似認為 ， 入射光近似為單色光，故 A 與 cB 仍成正比。 （2）盡管 較大，但在所選擇的入射光波長 范圍附近吸收曲線較平坦，因此變化較小，故 A 與 cB 仍保持較好的線性關系。 如果 較大時， 不等于 ，則 A 與 cB 不成正比而偏離朗伯-比爾定律， 與 相差越 大，偏離就越顯著。通常在最大吸收波長處附近 一小范圍內吸收曲線較為平坦， 較小。因此

11、 選擇 為入射波長，既有較高靈敏度，又可減 小由非單色引起的偏差。 21 12 1 2 1 2 max 第十三章吸光光度法 2. 非平行入射光引起的偏離 若入射光束為非平行光，就不能保證光束全 部垂直通過吸收池，可能導致光束通過吸收池的 實際平均光程大于吸收池的厚度，使實際測得的 吸光度大于理論值，從而導致與朗伯-比爾定律產(chǎn) 生正偏離。 第十三章吸光光度法 3. 介質不均勻引起的偏離 若溶液中生成溶膠或發(fā)生渾濁，當入射光通 過該溶液時，除一部分光被吸光物質吸收外，還 有一部分光被溶膠粒子和粗分散相粒子散射而損 失，使透光率減小，實測的吸光度偏高，從而對 朗伯-比爾定律產(chǎn)生正偏離。 第十三章吸光

12、光度法 1. 溶液濃度過高引起的偏離 若吸光物質溶液的濃度較高時，吸光粒子之 間的相互作用較強，改變了吸光粒子對光的吸收 能力，使溶液的吸光度與溶液濃度之間的線性關 系發(fā)生了偏離。 （二）化學因素引起的偏離 第十三章吸光光度法 2. 化學反應引起的偏離 朗伯 - 比爾定律中的濃度是指吸光物質的平 衡濃度，而在實際工作中常用吸光物質的分析濃 度來代替。當吸光物質的平衡濃度等于其分析濃 度或與分析濃度成正比時，A 與 cB 的關系仍服從 朗伯-比爾定律。 被測吸光物質在溶液中常發(fā)生締合、解離、 互變異構、逐級配位等反應，形成新的化合物而 改變了其平衡濃度與分析濃度之間的正比關系， 從而導致偏離朗伯

13、-比爾定律。 第十三章吸光光度法 第三節(jié) 吸光光度法分析條件的選擇 一、顯色反應及其條件 二、測定波長的選擇 三、吸光度范圍的選擇 四、參比溶液的選擇 第十三章吸光光度法 一、顯色反應及其條件 可見光區(qū)的吸光光度法只能用于測定有色 溶液。對無色溶液和顏色較淺的溶液進行測定時， 必須加入一種能與被測組分反應生成顏色 較深的有色化合物的試劑，然后再進行測定。 將被測組分轉變成有色化合物的化學反應稱為 顯色反應，能與被測組分反應使之生成有色化 合物的試劑稱為顯色劑。 第十三章吸光光度法 顯色劑必須滿足下述條件： （1）靈敏度要高：可見吸光光度法一般用 于微量組分的測定，要求選擇的顯色劑能與待 測組分

14、生成摩爾吸收系數(shù)較大的有色化合物。 生成的有色化合物的摩爾吸收系數(shù)越大，對入 射光的吸收程度越大，測定的靈敏度就越高。 （2）選擇性要好：選用的顯色劑最好只與 待測組分發(fā)生顯色反應，而與溶液中共存的其 他干擾離子不顯色，或者顯色劑與被測組分所 生成的有色化合物的顏色和顯色劑與干擾離子 所生成有色化合物的顏色有明顯的不同。 第十三章吸光光度法 （3）顯色劑與被測組分生成的有色化合物 要有足夠的穩(wěn)定性，不易受外界條件的影響而 發(fā)生變化。 （4）顯色劑與被測組分生成的有色化合物 的組成要恒定，符合一定的化學式，否則測定 的再現(xiàn)性就較差。 （5）有色化合物與顯色劑的最大吸收波長 的差別要足夠大，一般要

15、求相差 60 nm 以上。 第十三章吸光光度法 （二）顯色條件的選擇 1. 顯色劑的用量 顯色劑的適宜用量常通過實驗確定，其方 法是取 7 10 個相同濃度的被測組分的溶液， 并固定其他條件，然后分別在溶液中加入不同 量的顯色劑，逐一測定吸光度，繪制吸光度 A 與顯色劑濃度 cB 的關系曲線。 第十三章吸光光度法 吸光度與顯色劑用量的關系 cB 第十三章吸光光度法 2. 溶液的酸度 溶液的酸度對顯色反應的影響： （1）對被測組分存在狀態(tài)的影響：大多數(shù) 被測金屬離子易水解，當溶液 pH 增大時，可 能生成各種類型的氫氧基配合物，甚至生成氫 氧化物沉淀，使顯色反應不能進行完全。 （2）對顯色劑平衡

16、濃度和顏色的影響：大 多數(shù)的顯色劑是有機弱酸或有機弱堿，當溶液 的 pH 變化時，將影響顯色劑的平衡濃度，并 影響顯色反應的完全程度。另外，有一些顯色 劑本身就是酸堿指示劑，它們在不同 pH 的溶 液中具有不同的結構，而產(chǎn)生不同的顏色，所 以對顯色反應也有影響。 第十三章吸光光度法 （3）對有色化合物組成的影響：在不同 pH 的溶液中，顯色劑與待測離子形成的有色化合物 的組成往往不同，其顏色也不同。必須控制合適 的 pH，才能獲得好的分析結果。 不同的顯色反應的適宜 pH 是通過實驗確定 的。具體方法是: 固定溶液中被測組分和顯色劑 的濃度， 改變濃度的 pH ，測定此 pH 下溶液的 吸光度

17、， 以 pH 為橫坐標， 以吸光度為縱坐標， 作出 pH 與吸光度的關系曲線，從中可找出適宜 的 pH 范圍。 第十三章吸光光度法 吸光度與溶液 pH 的關系 第十三章吸光光度法 3. 顯色溫度 顯色反應一般在室溫下進行，但有些顯色反 應需要加熱到一定溫度時才能完成，而有些有色 化合物當溫度較高時又容易發(fā)生分解。對不同的 顯色反應，應通過實驗找出其最佳溫度范圍。 4. 顯色時間 可通過實驗來確定合適的測定時間。實驗的 方法是配制一份待測溶液，從加入顯色劑起計算 時間，每隔幾分鐘測定一次吸光度，繪制 A-t 關 系曲線，根據(jù)曲線選擇合適的測定時間。 第十三章吸光光度法 二、測定波長的選擇 選擇溶

18、液具有最大吸收的波長 max 作為入 射波長。在max處 最大，使測定具有較高的靈 敏度；同時，在max處的一個較小范圍內，吸光 度變化較小，不會偏離朗伯 - 比爾定律，也使測 定具有較高的準確度。如果干擾物質在max處也 有強烈吸收時，可選用非最大吸收處的波長，但 應盡可能選擇吸光度隨波長改變而變化不大的區(qū) 域內的波長。 第十三章吸光光度法 三、吸光度范圍的選擇 在吸光光度分析中，分光光度計的讀數(shù)誤 差也是測定誤差的主要來源之一。對于同一臺 儀器，透光率讀數(shù)的絕對誤差 基本上為一 定值。 由于透光率 T 與試樣溶液濃度 cB 之間為 對數(shù)關系，因而在不同的透光率讀數(shù)范圍內， 這一恒定誤差 所

19、引起的濃度 cB 的測定的相 對誤差是不同的。 T T 第十三章吸光光度法 B 0.434d dlgd T Td c T 以上兩式相除： B B d0.434d lg cT cTT 上式可改寫成： B B 0.434 lg cT cTT 根據(jù)朗伯-比爾定律： B lgTAdc 當 d 為定值時，將上式微分： 第十三章吸光光度法 測定誤差與透光率的關系 T/% 第十三章吸光光度法 在 T = 36.8 % (A = 0.434) 時，濃度測定的相對誤 差最小。 在實際測定時，常將吸光度控制在 0.2 0.7 (T = 20% 65%) 之間，以減小濃度測定的相對誤差。 表 13-3 不同透光率時

20、測定濃度的相對 誤差cB/cB(T = 0.01) T/% 9590 80 70 60 50 36.83020 10 5 2 20.6 10.7 5.6 4.0 3.3 2.9 2.7 2.8 3.2 4.3 6.5 13.0 BB (/)/% c c 第十三章吸光光度法 四、參比溶液的選擇 選擇參比溶液的原則如下： （1）如果僅待測組分與顯色劑的反應產(chǎn)物有 吸收，可用純溶劑作參比溶液。 （2）如果顯色劑或其他試劑略有吸收，可用 不含待測組分的試劑溶液作參比溶液。 （3）如果試樣中的其他組分也有吸收， 但不 與顯色劑反應，則當顯色劑無吸收時，可用試樣 溶液作參比溶液；當顯色劑略有吸收時，可在試

21、 液中加入適當掩蔽劑，將待測組分掩蔽后，再加 入顯色劑，以此溶液作參比溶液。 第十三章吸光光度法 第四節(jié) 分光光度計 一、基本部件及性能 二、幾種常用的分光光度計 第十三章吸光光度法 一、基本部件及性能 分光光度計的基本組成部件為： 光源 色器吸收池 指示器 在可見光區(qū)測定時，常用鎢燈或碘鎢燈作光源，它 發(fā)出波長為 320 2500 nm 范圍內的連續(xù)光譜。 （一）光源 單檢測系統(tǒng)讀數(shù) 第十三章吸光光度法 單色器是將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單 色光的裝置。單色器由棱鏡或光柵等色散元件 及狹縫和透鏡等組成。 （1）棱鏡：棱鏡是根據(jù)光的折射原理，將 復合光色散分為不同波長的單色光，然后再讓 所需波

22、長的光通過一個很窄的出射狹縫照射到 吸收池上。 （2）光柵：光柵是根據(jù)光的衍射和干涉原 理來達到色散目的。光柵的分辨率比棱鏡高， 適用波長范圍寬 ，而且色散均勻。 （二）單色器 第十三章吸光光度法 （三）吸收池 吸收池是用光學玻璃或石英制成的無色透 明的長方體容器，用于盛放參比溶液或待測溶 液。在可見光區(qū)測定時，使用玻璃吸收池。 利用光電效應將透射光強度轉換為電流進 行測定的光電轉換部件稱為檢測器。可見分光 光度計常用的檢測器有光電池、光電管和光電 倍增管。 （四）檢測系統(tǒng) 第十三章吸光光度法 （1）光電池：常用的光電池是硒光電池， 當光照射在光電池上時，半導體硒表面就有電 子逸出，被收集于金

23、屬薄膜上，因此帶負電， 成為光電池的負極。由于硒的半導體性質，電 子只能單向移動，使鐵片成為正極。通過與電 阻很小的外電路連接，能產(chǎn)生 10 100 的光 電流，可直接用檢流計測定，電流大小與照射 光強度成正比。 A 第十三章吸光光度法 （2）光電管：光電管是由一個陽極和光敏 陰極組成的真空（或充有少量惰性氣體）二極 管，陰極表面鍍有堿金屬或堿金屬氧化物等光 敏材料，當它被具有足夠能量的光照射時，能 夠發(fā)射電子。當兩極間有電位差時，發(fā)射出的 電子就流向陽極而產(chǎn)生電流，電流的大小取決 于入射光的強度。 第十三章吸光光度法 （3）光電倍增管：光電倍增管中有一個光敏 陰極和若干個倍增光敏陰極，當光照

24、射光敏陰極 時發(fā)射出電子，由于外電場的加速作用，這些電 子高速轟擊相鄰的第一陰極，該陰極經(jīng)電子轟擊 后又產(chǎn)生次級電子，其數(shù)目較入射的電子多，這 些電子再次被加速轟擊第二陰極，從而發(fā)射出更 多的電子。通常使用 9 12 個這種陰極，可將電 流放大幾百萬倍以上。最后倍增了電子射向陽極 形成電流，光電流通過負載電阻變成電壓信號， 經(jīng)放大后將信號輸入讀數(shù)指示器。 第十三章吸光光度法 （五）讀數(shù)指示器 讀數(shù)指示器的作用是把光電流放大的信號 以適當方式顯示或記錄下來。通常使用懸鏡式 光電反射檢流計測定產(chǎn)生的光電流。檢流計光 點偏轉刻度直接標為吸光度和透光率，測定時 可直接讀出。 第十三章吸光光度法 二、幾種