1、摘要：腫瘤的發生是細胞增殖與細胞凋亡失衡所致,凋亡抑制蛋白（iap）是一類內源性caspases家族抑制因子,其過度表達引起的凋亡不足與腫瘤發生,治療耐藥密切相關。線粒體促凋亡蛋白smac可通過其n端的4個氨基酸與多種iap特異性結合，解除iap的抑制作用。因此基于腫瘤高表達iap, smac多肽可特異性結合iap這一特性，借助nhs-mag3雙功能螯合劑，99mtc標記融合細胞穿透序列的smac 6肽，進行腫瘤顯像，量化iap表達，比較腫瘤治療前后腫瘤攝取顯像劑的差異，評估腫瘤治療療效。該方法的建立，不僅可豐富核醫學腫瘤顯像方法，還可將此多肽用治療性核素如188re標記，以凋亡抑制蛋白為靶點

2、進行腫瘤核素內放射治療，具有極大的研究前景關鍵詞：凋亡抑制蛋白；促凋亡蛋白smac；多肽標記；腫瘤核素顯像報告正文一 立項依據與研究內容立項依據 細胞凋亡是受基因調控的細胞自主死亡的過程，是一系列凋亡相關分子及其正、負調節分子相互作用的結果，這一過程對消除機體內老化細胞及具有潛在異常生長的細胞,保持機體處于穩態起著重要的作用。凋亡中, caspases家族即半胱天冬酶家族具有重要地位。caspases按其在凋亡過程中的功能分為啟動酶和效應酶。啟動酶包括caspase2,8,9,10；效應酶包括caspase3, 6,7。效應酶通過切斷細胞間的信號傳遞,重組細胞骨架,關閉dna 復制和修復,破壞

3、dna和細胞核結構,誘導凋亡小體形成來執行凋亡功能1。 caspases家族以無活性的前體形式存在,該前體需經級聯性的蛋白水解作用而被激活。而凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins, iaps)是caspases家族的內源性抑制因子，其成員包括xiap,c-iap1,c-iap2,survivin,livin,naip,apollen/bruce,ilp2。該家族成員均含有13個桿狀病毒iap重復序列( baculoviral inhibitor of apoptosis repeats,bir)，利用此結構區與caspase3,7, 9結合而發揮凋亡抑

4、制作用。比如xiap含有3個bir結構區，其中bir1,2 連接區抑制caspase3,7，bir3特異性地抑制caspase9。livin含有一個bir區，可特異性抑制caspase9;survivin也通過其bir區直接抑制caspase3,72,3。同樣，iaps抗凋亡的能力也受到調節。線粒體促凋亡蛋白smac( second mitochondrial activator of caspase) /diablo(direct iap binding protein with low pi) 可與多種iaps包括xiap,c-iap1,c-iap2, survivin,livin的bir

5、區特異性結合，解除iap的抑制作用,釋放活化的caspases。smac，25kda大小，前體存在于正常細胞線粒體,在凋亡信號刺激下, 其n端55個氨基酸被剪切，形成成熟的smac釋放到細胞質而發揮作用4。x線晶體衍射成像顯示成熟的smac通過n端前4個氨基酸：丙氨酸纈氨酸脯氨酸異亮氨酸（avpi）與iap家族的bir結構域表面凹槽結合，從而解除對caspase的抑制，發揮促凋亡作用5。（圖1：caspases，iap和smac相互作用關系示意圖，圖2：smac解除iap抑制caspase作用示意圖）利用此特性， arnt等分別將成熟smac 氨基端的4個氨基酸（avpi）、6個氨基酸(avp

6、iaq)、8個氨基酸(avpiaqks)與果蠅觸角轉錄因子穿透序列（rqikiwfqnrrmkwkk）相連接，合成可穿透細胞的融合多肽，與一些上皮來源的腫瘤細胞如乳腺癌細胞株mcf-7,t47d孵育，通過免疫共沉淀的方法證實各種融合多肽的確能穿透細胞膜，與內源性的xiap,ciap1結合，并能提高化療藥物如依托泊苷、紫杉醇誘發的凋亡，其中smac 6肽能力最強6。vucic等也合成了含有果蠅觸角轉錄因子穿透序列smac 9肽（avpiaqkse），利用極化熒光分析技術證實smac9肽不僅可以和xiap的bir3區結合，同樣也可和livin的bir區結合7。sun等利用核磁共振分光法證實smac

7、多肽也可類似結合xiap與survivn結合 8。iap家族成員在多種人類惡性腫瘤中表達明顯增高，以survivin, xiap，c-iap1,c-iap2,livin為著。如肺癌（85.5）、胰腺癌（88）、食道癌（70%）、結腸癌（53%）、乳腺癌（60）、結腸癌（53.2）、膀胱癌（58）和胃癌（68）表達survivin，且其表達與腫瘤的惡性程度和預后顯著相關 9-12 。在惡性黑色素瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌、絨毛膜癌中有livin表達，尤其在惡性黑色素瘤組織中的陽性率可達47.6%70.6%，明顯高于黑色素細胞痣（21.4 25.0%）13。xiap也在白血病、肝癌、肺癌、子宮頸癌等多

8、種惡性腫瘤中表達增高。本課題負責人所在之研究小組利用組織芯片及免疫組化技術對1100余例人類腫瘤中iap家族成員的表達情況進行分析，也得到了相似結果。腫瘤治療過程中, 許多抗腫瘤藥物及放療均是通過啟動細胞凋亡機制完成的, 而凋亡過程的抑制常常導致腫瘤細胞耐藥14。iap在腫瘤細胞中過表達是腫瘤細胞逃避免疫監督的主要原因,iap基因表達增高,細胞凋亡受抑,導致腫瘤耐藥。如kato等的研究表明,食道癌survivin的高表達能夠對抗抗癌藥引起的凋亡,在化療效果好的患者的腫瘤組織中survivin表達水平明顯低于化療效果差的患者,提示survivin表達量能夠預測腫瘤對化療的反應12。li等檢測了卵

9、巢癌細胞中xiap的表達情況,發現耐藥細胞株xiap的表達水平明顯強于對化療藥物敏感細胞株,敏感細胞株經順鉑處理后, xiap的表達下降,凋亡指數上升,而對耐藥細胞株, 順鉑未能影響xiap的水平及細胞凋亡15。因此，定量分析iap 表達對評估腫瘤的惡性程度、預后及治療反應有極大的幫助。大多數腫瘤高表達iap，smac多肽可特異性結合iap。多肽具有組織滲透迅速、血液中清除快、免疫原性低和合成方便的特性。因此, 若用某些可被探測的物質如放射性同位素標記該多肽，注射入體內，采用spect或pet則可進行腫瘤顯像，同時還可以進行定量分析，量化iap的表達，為臨床醫生評估腫瘤的惡性程度及預后，制定疾

10、病的治療方案提供重要的幫助，同時還可為治療藥物的篩選提供有力的幫助。99mtc是目前運用廣泛的純核素，具有優良的理化性質，能標記多種化合物，在核醫學臨床診斷和實驗研究中得到了廣泛的運用。巰基乙酰三甘氨酰-n-羥基丁二酰亞胺酯(nhs-mag3) 作為一種有效的雙功能螯合劑, 在90 年代中后期被用于人多克隆免疫球蛋白、抗體、小分子肽、dna 寡核苷酸及肽核酸等的99m tc 標記16。通過nhs-mag3 得到的標記產物, 血漿蛋白結合率低, 特別適合小分子物質的標記。因此本研究選擇nhs-mag3作為螯合劑，對融合了穿透序列的成熟smac氨基端的前6個氨基酸avpiaq-rqikiwfqnr

11、rmkwkk 進行99m tc 標記, 探討用于腫瘤診斷，預后以及腫瘤耐藥評價的可行性。試圖通過基于凋亡抑制基因進行的顯像，擴展腫瘤核素顯像方法，為臨床評估腫瘤預后、治療療效提供有用信息。如該方法的確可行，還可對其進行188re標記，以凋亡抑制蛋白為靶點進行腫瘤核素內放射治療，具有極大的研究前景。圖1 凋亡信號傳導通路示意圖（fuentes-prior p，2004）圖2 smac/diablo 解除iap蛋白抑制caspase作用示意圖（verhagen am ，2001）a caspase 9通過其p10 亞單位與xiap的bir3結構域凹槽緊密結合b capase3的催化部位同bir2上

12、游的連接體區結合（capase7也類似）c smac/diablo n端氨基酸 與caspase9 類似，可競爭性結合bir3凹槽，解除iap對caspase9的抑制d smac/diablo 可與bir2上游的連接體區結合，解除對caspase3，7抑制參考文獻1: jacobson md, weil m, raff mc, et al. programmed cell death in animal development. cell. 1997;88(3):347-54. .2: verhagen am, coulson ej, vaux dl. inhibitor of apoptos

13、is proteins and their relatives: iaps and other birps. genome biol. 2001;2(7):reviews3009. 3: shi y. mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. mol cell. 2002;9(3):459-70. 4: du c, fang m, li y, et al. smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase

14、activation by eliminating iap inhibition. cell. 2000;102(1):33-42. 5: wu g, chai j, suber tl, et al. structural basis of iap recognition by smac/diablo. nature. 2000;408(6815):1008-12. 6: arnt cr, chiorean mv, heldebrant mp, et al. synthetic smac/diablo peptides enhance the effects of chemotherapeut

15、ic agents by binding xiap and ciap1 in situ. j biol chem. 2002;277(46):44236-43. 7: vucic d, deshayes k, ackerly h, et al. smac negatively regulates the anti-apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis (ml-iap). j biol chem. 2002;277(14):12275-9. 8: sun c, nettesheim d, liu z, et al. solut

16、ion structure of human survivin and its binding interface with smac/diablo. biochemistry. 2005;44(1):11-7.9: kennedy sm, odriscoll l, purcell r, et al. prognostic importance of survivin in breast cancer. br j cancer. 2003;88(7):1077-83.10: sarela ai, verbeke cs, ramsdale j, et al. expression of surv

17、ivin, a novel inhibitor of apoptosis and cell cycle regulatory protein, in pancreatic adenocarcinoma. br j cancer. 2002;86(6):886-92.11: ku jh, kwak c, lee hs, et al. expression of survivin, a novel inhibitor of apoptosis, in superficial transitional cell carcinoma of the bladder. j urol. 2004;171(2

18、 pt 1):631-5. 12: kato j, kuwabara y, mitani m, et al. expression of survivin in esophageal cancer: correlation with the prognosis and response to chemotherapy. int j cancer. 2001;95(2):92-5.13: gong j, chen n, zhou q, et al. melanoma inhibitor of apoptosis protein is expressed differentially in mel

19、anoma and melanocytic naevus, but similarly in primary and metastatic melanomas. j clin pathol. 2005;58(10):1081-5.14: johnstone rw, ruefli aa, lowe sw. et al. apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy. cell. 2002;108(2):153-64. 15: li j, feng q, kim jm, et al. human ovarian cancer

20、and cisplatin resistance: possible role of inhibitor of apoptosis proteins. endocrinology. 2001;142(1):370-80.16: winnard p jr, chang f, rusckowski m, et al. preparation and use of nhs-mag3 for technetium-99m labeling of dna. nucl med biol. 1997;24(5):425-32.項目的研究內容、研究目標以及擬解決的關鍵問題研究內容 99m tc標記mag3-s

21、mac及其性質鑒定 人工合成融合了細胞穿透序列的smac 6肽avpiaq-rqikiwfqnrrmkwkk，對照肽為smac n端6肽反向排列qaipva- rqikiwfqnrrmkwkk；以及不含穿透序列的smac 6肽avpiaq 四步法合成nhs-mag3，偶聯合成肽，99mtc標記； 標記物純化、測定放化純以及檢測標記物的穩定性和血漿蛋白結合率。 99m tc-smac體外生物學性質鑒定. 檢測腫瘤細胞攝取99m tc-smac的能力； 利用大腸桿菌表達xiap、survivin、livin蛋白；表面等離子體共振技術測定標記物與xiap、survivin、livin蛋白結合的kd值

22、。 動物模型的建立與動物體內顯像的研究研究99m tc-smac 在動物體內的生物學分布、血液清除、體內代謝；荷瘤裸鼠建立，將99m tc-smac注射入動物模型后spect顯像，分析腫瘤細胞內放射性強度；通過注射顯像劑后不同時間顯像結果分析，確定最佳顯像時間； 荷瘤裸鼠放療或化療后，比較腫瘤攝取顯像劑的差異；評價治療療效；腫瘤組織xiap、survivin、livin染色陽性細胞數與腫瘤攝取顯像劑強度的相關性分析。研究目標 (1) 借助nhs-mag3雙功能螯合劑，使用99m tc標記可和腫瘤高表達的凋亡抑制基因結合的smac多肽，實現腫瘤顯像的可能性，從而建立一種新型腫瘤顯像方法；(2)

23、該顯像方法除了可對腫瘤進行多次顯像外，還能定量測定凋亡抑制基因的表達水平，對評估腫瘤預后、治療療效提供有用信息，充分體現分子核醫學與臨床應用中的價值。擬解決的關鍵問題 99m tc標記mag3-smac，要有優良的標記特性，保持與iap蛋白的結合力，確能進入腫瘤細胞，實現腫瘤顯像、評估腫瘤預后、治療療效的可能性。擬采取的研究方案及可行性分析研究方案合成99m tc-smac，經純化、性質鑒定后測定其與iap蛋白親和力、靶特異性、生物穩定性。其在動物體內生物學分布、體內代謝、血液清除速率等將通過荷瘤裸鼠加以研究。注射99m tc-smac后進行spect顯像，定量分析放射性強度,并比較治療前后放

24、射性強度變化；顯像結果通過腫瘤組織免疫組化加以驗證。99m tc-smac的合成以及性質鑒定1合成smac多肽融合了細胞穿透序列的smac 6肽avpiaqrqikiwfqnrrmkwkk（smac a），對照肽為smac n端6肽反向排列qaipva- rqikiwfqnrrmkwkk（smac b）；以及不含穿透序列的smac6肽avpiaq（smac c），可交于公司合成。2合成nhs-mag3, 偶聯smac多肽 參照hnatowich 提供方法（nucl med biol. 1997）合成nhs-mag3, 溶于無水二甲基甲酰胺，將smac多肽分別溶于hepes緩沖液（ph8.0），

25、邊振蕩邊逐滴加入nhs-mag3溶液，使nhs-mag3和smac的摩爾比為10201，采用不同的連接時間進行偶聯，用活化的sep-pak c18反相柱純化smac-mag3,甲醇或醋酸胺溶液洗脫，紫外分光光度計測260nm的吸光度，合并峰管，即為目的標記物，分裝、冷凍干燥，-20保存。 3 放射性標記 將smac-mag3溶于醋酸胺溶液，用新鮮配制的0.5m酒石酸鈉溶液調節ph值至7.6,使酒石酸鈉最終濃度為67g/l。依次加入99mtco4- 新鮮淋洗液74mbq和新鮮配制的1g/l氯化亞錫溶液，混勻后在室溫下反應15min，依上述方法分離純化。通過hplc方法測定標記率。紙層析測定放射化

26、學純度。4 99m tc-smac穩定性檢測室溫下將99m tc-smac洗脫液分別放置1h，2h，4h, 紙層析測定其放化純; 將99m tc-smac加入2 倍體積新鮮人血清中, 37 分別孵育1h，2h，4h, 進行紙層析, 測定其放化純。5 99m tc-smac 兔血漿蛋白結合實驗新鮮兔血漿中分別加入37 74 kbq 99m tc-smac a,b,c, 37 孵育1.5h,三氯醋酸沉淀法測定血漿蛋白結合率。 99m tc-smac體外細胞實驗1細胞攝取6 孔板接種肺癌a549細胞，前列腺癌lncap，pc-3，du145細胞，惡性黑色素瘤a375，a875，sk，m14細胞,子宮

27、頸癌hela細胞,臍靜脈內皮細huvec304細胞，常規培養24h 后吸棄培養基,每3 孔為1 組,分別加入含74 kbq 99m tc-smac a,b,c的無血清培養基2ml ,37 繼續孵育10,20,40,60 和120min，收集、清洗細胞,分別測定細胞及清洗液中的放射性,計算攝取率= 細胞中放射性計數/(細胞中放射性計數+ 清洗液中放射性計數) 100 %。2表面等離子體共振技術測定標記物與iap蛋白結合的kd值利用rt-pcr法,從惡性黑色素腫瘤細胞a375，,擴增xiap, survivin, livin cdna的編碼序列,克隆至pmd-t載體, dna序列測定后再克隆到原核

28、表達載體pgex-2t中,轉化感受態大腸桿菌bl21后經iptg誘導表達獲得包涵體融合蛋白,并經western印跡鑒定。通過超生霧化將80%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸-l-絲氨酸(dops),19%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸膽堿(dopc)制成單層小囊泡（suv）。suv的結合通過表面共振儀測定。將sa芯片安裝在儀器上，以5-l/分的流速將suv均勻鋪在sa上以形成磷脂膜模型。當膜表面的共振單位達到2000以上并穩定以后，磷脂膜模型即做好。將未標記的mag3-smac a,b,c和99m tc標記smac a,b,c的用hepes-p緩沖液（0.1m的hepes

29、,0.15mnacl,0.005%的p20）以及5mm的cacl2稀釋成不同的濃度，然后將50l的蛋白注射到膜表面（固定相），隨即用250l的緩沖液洗脫（解離相）。測量spr角的變化監測蛋白與多肽分子間相互作用。由spr曲線可獲得哪些分子發生了相互作用,相互作用的強度,結合和解離的速度,樣品中分析物濃度,是否存在異構效應,結合位點分析,復合物中不同成分對結合的影響等。 99m tc-smac動物體內顯像的研究1動物模型的建立將1106 的人惡性黑色素細胞a375和前列腺癌du145細胞接種于裸鼠的雙側后腿皮下。腫瘤長到直徑為5-7mm大小后進行裸鼠體內分布和顯像的研究。2動物體內生物學分布 尾

30、靜脈注射4mg/kg的99m tc-smac后于不同時間將小鼠殺死，分別取出腦、心、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、肌肉、腫瘤組織、尿、大便等，分別稱重，記錄60s放射性計數，計算每克組織的放射性強度，得出各器官的時間放射性曲線。3血液半清除速率 尾靜脈注射4mg/kg的99m tc-smac 后，分別于不同時間取血，經稀釋后測定放射性計數。畫出時間放射性曲線，計算半清除時間。4動物體內顯像 spect顯像 尾靜脈注射4mg/kg的99m tc-smac，注射前（本底）及注射后0，0.3，1，2，4，6，12，24小時,采集圖像，窗寬15%，能量140kev，采集像素為128128。通過注射顯像劑后

31、不同時間顯像結果分析，確定最佳顯像時間。框畫roi，分別計算每個roi的放射性計數。 評價腫瘤放化療的療效將荷惡性黑色素瘤的裸鼠用2gy/次，共7次，3周后顯像，分別比較放射治療的腫瘤與未放射治療腫瘤內放射性強度的差異。將荷前列腺癌lncap、du145的裸鼠用康士得（非甾體類的雄激素受體拮抗劑，其中lncap為激素治療敏感性，而du145為激素非依賴）1mg/kg/d,治療46周后顯像，比較激素治療前后放射性強度的差異，評價腫瘤治療的療效。 組織學染色顯像后，將每只小鼠的腦、心、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、肌肉、腫瘤組織取出，固定，石蠟包埋，做成組織芯片，xiap，survivin，livin

32、免疫組化染色。對各組織染色陽性細胞數與體內相應組織攝取顯像劑強度的相關性分析。 數據分析 采用spss統計分析軟件分析數據。兩組均數的比較用t 檢驗，多組間的比較用方差分析, 兩兩比較用lsd 法，相關性分析采用線性相關與回歸法；p0.05有統計學意義 可行性分析1 課題思路是申請者對凋亡及其凋亡相關家族進行細致深入學習和研究，參閱了大量文獻，并結合自己核醫學專業優勢提出的。smac49肽均被證實可以和凋亡抑制蛋白中的xiap，survivin，livin結合，而這些凋亡抑制蛋白又在大多數腫瘤中高表達，因此利用smac多肽作為標記對象對腫瘤進行顯像，具有很好的立論基礎。加之多肽具有組織滲透迅速

33、、血液中清除快、免疫原性低、合成方便以及核素標記方法成熟的特性，技術上具有較高的可行性。 課題組成員均是具有豐富研究經驗的研究者，課題組所在研究機構具有較好的研究條件與完善的研究設備，為研究工作提供了堅實的硬件基礎。特色與創新 基于smac多肽能與腫瘤中高表達的凋亡抑制蛋白結合的特性，首次提出對smac多肽標記，針對凋亡相關家族進行腫瘤顯像。不僅可以反復多次顯像，還可量化凋亡抑制蛋白表達水平，評估療效，提示預后。該方法的建立可擴展腫瘤核素顯像方法，并可繼續深入研究，進行腫瘤靶向治療，因此有很好的研究前景。年度研究計劃2007.1-2007.6 合成99m tc-smac a，b，c及其標記物放

34、化性質測定2007.6-2007.12 大腸桿菌克隆xiap，survivin，livin，表面等離子體共振技術測定標記物與iap蛋白結合的kd值2008.1-2008.3 蛋白99m tc-smac a，b，c腫瘤細胞攝取2008.4-2008.12 測定99m tc-smac a，b，c在動物體內的生物學分布、血液清除、體內代謝。動物體內顯像，研究腫瘤的最佳顯像時間2009.1-2009.5 評價腫瘤治療后的療效2009.6-2009.12 數據處理及論文撰寫與發表預期研究結果利用99m tc標記smac穿透肽，實現腫瘤顯像，量化凋亡抑制蛋白表達水平，評估療效，提示預后。通過理論探索和技術

35、研究，使之可達到下一步開展臨床應用研究的目的。顯像方法可申請技術發明專利，被開發為臨床應用產品。通過省部級鑒定，申請科技成果獎。在sci收錄雜志發表論文23篇，研究結果在國際、國內會議上交流。二研究基礎與工作條件工作基礎 本課題申請者在博士期間承擔國家自然基金課題nis和tpo基因轉染腫瘤細胞介導131i靶向治療的研究工作，具有扎實的核醫學實驗基礎,并熟練掌握分子生物學相關技術，發表相關論文3篇 ，并參加了第八屆亞太核醫學和生物學大會，口頭交流該課題研究結果。在前期的工作中，參加了實驗室對神經系統、泌尿系統和惡性黑色素腫瘤中caspase和iap家族等凋亡調控蛋白的表達模式和水平及生物學意義研

36、究的工作，并獨立承擔構建重組人smac基因的腺病毒載體，在惡性黑色素瘤、前列腺癌細胞株中進行生物學行為的研究，因此對凋亡信號轉導機制與腫瘤發生有較深入的理解和研究。本課題申請人和研究小組成員熟悉課題相關的學術前沿和動態，具有豐富的研究工作經驗和研究技術。工作條件已具備的實驗條件spect 2臺beckman hplc 1臺超速低溫離心機 1臺icon核醫學專業計算機 2臺超凈工作臺 1臺質譜儀 1臺表面共振儀 1臺超低溫冰箱 1臺生物搖床 1臺co2 孵箱 1臺lkb-自動層析分離儀 1臺beckman 純水儀 1臺pcr儀 1臺-80超低溫冰箱 1臺紫外分光光度儀 1臺、自動色層掃描儀 1臺

37、紫外可見自動掃描分光光度計 1臺登記序號： 項目編號：中醫藥、中西醫結合科研項目課題設計書課題名稱：痛痹顆粒對骨關節炎細胞凋亡和增殖的機理研究申報單位： 江蘇省中醫院課題負責人： 朱萱萱計劃年限：郵政編碼： 210029 聯系電話： 8661714130306申報日期：江蘇省中醫藥局制填寫提綱一、立項依據：與選題直接相關的國內外現狀、水平和發展趨勢；選題的理論和實踐依據；研究目的、意義；本研究達到的科學技術水平，預期社會經濟效益和應用推廣前景。二、科研假說或技術構思，主要研究內容、關鍵技術、目標（達到的主要技術指標或技術經濟指標），技術特征及創新之處，開發項目應說明開發規模。三、研究試驗方法及

38、技術路線（工藝路線）。四、現有工作條件和基礎：開展本項研究的技術優勢，現有的主要儀器設備及應用合格實驗動物的基本條件等；已有工作基礎，預試驗情況。五、計劃進度：根據總的研究期限、年度計劃進度，分別列出具體的目標和進度的考核指標。六、參加（協作）單位意見及具體分工（附協議書）。七、經費概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據，以及分年度使用計劃。填寫說明一、內容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報要求上報。二、填寫提綱所列內容，要全面詳細、如實填寫。三、封面上“登記序號”“項目編號”請勿填寫。1、 立項依據1.1 研究目的、意義骨關節炎（osteoa

39、rthritis，oa）又稱退行性關節病，以關節軟骨發生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進行性關節疾患。該病發病率隨年齡增長而升高，據調查，在美國目前2億多人口中，就有骨關節炎4500萬，發病率占總人口的20%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，oa的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據流行病學調查顯示，5564歲的人群中發病率達40%，而65歲以上人群的患病率達60%90%。隨著計劃生育政策的長久實施及經濟發展，我國已進入老齡化社會，oa的發病率還將越來越高，這不僅嚴重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負擔。

40、同時世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而oa引起了國際、國內醫學界的相當重視。近年來對oa的研究頗多，在發病機制、檢測手段以及治療方法上均取得較大進步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進展。西藥治療oa的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點。雖然中藥治療oa也取得了一些經驗，但對其具體的作用機制有深入研究的卻很少，因此在中醫理論的指導下，運用現代科學技術，對療效確切的中藥復方進行深入的機理研究，使中藥治療oa的療效在國際先進行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國內外現狀水平和發展趨勢近十年來，國內外對oa進行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.

41、1 流行病學研究已廣泛開展在近100種不同類型的關節疾病中，oa是影響人類健康最常見的關節疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢。felson等報道70歲以下人群膝oa患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學膝oa70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。butter等報道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血oa 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內陳順樂等隊13541名鋼鐵工人的調查結果顯示，癥狀

42、性oa患病率2.2%；無癥狀性oa患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學醫學院統計551例，結果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關節oa易感性不同。美國在衛生統計中心調查結果，oa患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內陳順樂等調查結果oa是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖oa均以女性較多，且女性骨關節炎的遺傳易感性較男性高。在framingham的研究中，felaon等發現女性體重減少11磅，骨關節炎形成的風險相應減少50%

43、。 saase等調查結果，膝oa患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據1994年統計，在美國，骨關節炎的消耗為155億美元，約為類風濕關節炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會進程的不斷加快，oa的發病率會越來越高，這必將給家庭、社會帶來沉重負擔。1.2.2 病因、發病機制有了巨大突破目前基礎研究認為軟骨的損傷與退變是oa的根本，隨著分子生物學免疫學的發展，近年來眾多學者對oa關節軟骨退行性改變的原因從不同角度進行了大量研究，其發病機制仍未完全明了，又提出了許多學說，如軟骨下骨內高壓學說：由于骨血液動力學的改變，在骨髓腔容積不變的前提

44、下增加內容物引起壓力增高，即表現為骨內壓力增高。骨內高壓持續增高存在下關節滑液ph值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細胞的正常代謝導致細胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復，最終產生骨性關節炎。自由基學說：認為自由基對軟骨細胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細胞后，引發膜脂質過氧化，使脂質過氧化代謝產物丙二醛增多，丙二醛可與dna發生交聯，自由基也可直接攻擊軟骨細胞dna即合成dna所需的酶，使dna鏈斷裂、堿基損傷從而影響了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障礙。骨關節炎時，滑膜、滑液、血管翳內常有中性白細胞、巨嗜細胞浸潤，其表面受免疫復合物、補體等作

45、用能釋放大量o2-和h2o2；細胞因子學說：細胞因子對骨關節炎的發生、發展起了重要作用，如白細胞介素-1（il-1）、白細胞介素-6(il-6)、腫瘤壞死因子（tnf）等在oa中水平明顯增高。il-1具有刺激軟骨細胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時il-1也是軟骨基質降解的主要驅動因子；軟骨酶降解學說：oa軟骨細胞的基質降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關節炎的嚴重程度密切相關。參與降解基質大分子的降解酶類可以增加達到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白?；|金屬蛋白酶，尤其是基質溶素和膠原酶，參與關節軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細胞外基質的所

46、有成分，與循環系統中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細胞和軟骨細胞產生的il-1和tnf的作用下，軟骨細胞以酶原的形式分泌大量的基質金屬蛋白酶，而對金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進行性破壞；一氧化氮學說：no是一種細胞間信使分子，可介導許多生物學現象。nos可催化重要炎性介質no的產生，oa患者血清、滑液中no含量明顯高于正常。no可通過抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時使軟骨細胞分泌透明質酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細胞合成軟骨基質，促進軟骨細胞糖

47、酵解，使軟骨破壞。細胞凋亡學說：細胞凋亡是細胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發現凋亡，但凋亡亢進與不足則會引起相關疾病，在骨關節炎患者軟骨中軟骨細胞的凋亡有異常表現，且凋亡細胞數目與骨關節炎嚴重程度明顯相關。凋亡小體存在于軟骨細胞小孔或間隙內，其產生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細胞修復過程失敗，而逐漸發展成關節軟骨的完全丟失。oa軟骨細胞凋亡主要通過兩種相互獨立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關的途徑,由no介導;另一種是同滑膜炎癥相關的途徑,由fas介導。典型

48、的oa不存在明顯的炎癥反應,此時軟骨細胞凋亡以no途徑為主;當產生炎癥反應時,則通過as途徑加劇軟骨細胞凋亡和關節破壞。no通過兩種方式造成組織及細胞損傷。一是高濃度的no能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統及檸檬酸循環有關的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是no與超氧化陰離子2-反應,生成氧化亞硝基陰離子onoo-,在酸性條件下(如病理條件)迅速分解為oh-和no2自由基,這兩種自由基具有很強的細胞毒性,可造成組織細胞損傷。在oa患者中,受損區軟骨細胞的凋亡比例明顯高于未受損區。fas表達的結果與其相符,oa受損區的fas表達遠高于未受損區,提示fas表達可誘導軟骨細胞凋亡。除no途徑和f

49、as途徑外,還有一些因素可導致軟骨細胞凋亡、關節破壞,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1區等。1.2.3 治療方面有了不少新方法目前中西醫治療oa的藥物較多，西藥治療oa主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點是發揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，oa多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且由于過分的鎮痛，導致病人失去警惕過分運動，以致出現“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點認為乙酰氨基酚應作為治療oa的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發揮作用慢，療效不確切，價格昂貴

50、，臨床上尚未廣泛運用；第三類為軟骨保護劑，尚未問世。關節清理術、膝關節置換術，適應癥較少，費用高，創傷大，病人難以接受。中哦藥治療oa的研究取得了可喜的進步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬臨床經驗，無對照組，特別是西藥對照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國際公認的、量化的臨床觀察指標及療效判斷標準為手段來尋找治療oa的中藥。未針對oa發病機制進行臨床及動物試驗從生化、免疫、病理、細胞分子水平來探討中藥的藥物作用機理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫認為oa屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風寒濕邪有關，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養為oa

51、的發病基礎，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產物。周尊謙等人在傳統中醫理論基礎上，闡述了膝oa骨內高壓血瘀證氧自由基之間的密切關系；謝林等論述了膝oa與血瘀證之間的內在聯系，旨在為運用活血化淤藥治療oa提供理論依據。治療方面從古到今絕大部分醫家皆針對其病因病機采用益肝腎、強筋骨、補氣血治其本；散寒通絡、化痰勝濕治其標。獨活寄生湯是用于治療風寒濕痹、關節疼痛和腦血管后遺癥的傳統固防，具有補肝腎、活血通絡之功，臨床常見本方加減治療oa，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關節炎24例，有效率為87.5%。陸智報道用本方加減治療104例，總有效率91.

52、3%。1.2.4 實驗研究方面有了較大的進展隨著對oa發病機理的不斷深入認識，對oa的實驗研究方面也開始了向多層次多角度的方向發展。動物實驗不再只局限于微循環和一般抗炎、鎮痛試驗，現已使用針對oa的動物實驗，并采用相關的指標進行檢測。目前實驗研究內容主要有以下幾個方面，研究最多的是oa的血液流變學、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗一般均可通過建立骨關節炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關指標來進行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學指標，使用老齡動物通過檢測體內sod及mda含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在no對oa影響的實驗中，一般采用硝酸還原酶法來測定no含量，運用p

53、t-pcr技術測定nos基因表達。il-1、il-6、tnf等細胞因子、軟骨降解酶尤其是基質金屬蛋白酶、誘導關節滑膜炎癥的物質如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素pge2、軟骨細胞的細胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測指標使用到實驗研究中來。1.3 選題的理論和實踐依據祖國醫學并無骨關節炎的病名，從歷代文獻來看本病應歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認為oa病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般oa病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關節腫脹畸形、活動受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質之于痰淤?；诂F代醫學對oa發病機理的深入研

54、究，我們在補益肝腎、活血通絡基礎上，結合中藥對緩解軟骨降解，增加軟骨細胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對備急千金要方中的獨活寄生湯進行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝oa，方中以獨活為君藥，以祛下焦與筋骨間風寒濕邪；威靈仙舒筋通絡止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補肝腎，強筋骨，通經絡，其中懷牛膝為引經藥；當歸養血柔肝、舒筋活血；川芎則通達四肢關節，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時防諸藥辛燥太過。諸藥合用共起補肝腎、祛風濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護軟骨。通過36例的臨床研究、觀察，結果表

55、明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對痛痹顆粒治療骨性關節炎的作用機制尤其是該方對軟骨細胞的細胞凋亡與增殖機理做進一步的研究，冀能證實痛痹顆粒的臨床療效，明確其作用機制，并初步探討本病發病的可能機理，為新藥問世提供客觀的依據，所以進行設計并立題。1.4本研究達到的科學技術水平，預期社會效益和應用推廣前景1.4.1繼承和發揚祖國醫學，保持中醫特色，以臨床療效為前提，以實驗研究為基礎，制造規范化大鼠的膝oa模型，從發病機理探討本藥的作用機制。本實驗采用可靠地國際公認的方法復制動物模型，并采用最新的檢測指標il-1、tnf、sod、mda、no等，總之本研究基于現代醫學對oa發病機制的最新研究成果，

56、從生化、免疫等多個角度多個層次，系統觀察并進行歸納總結，確保本課題不但可行而且先進，冀能填補省內外運用中藥治療oa的空白，并希望以此為基礎，進一步從細胞水平（包括本藥對軟骨細胞及細胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對oa的長久作用及影響，從而達到擠身國際先進水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療oa的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規范化的研究很少，中醫中藥治療機理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評價體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫藥治療學整體研究思路與方法，使中藥復方治療oa的療效機理尚未能全面揭示，影響了該領域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫理論指導下選用千金要方中獨活寄生湯進行加減所得，并采用可靠的實驗模型及最新的國際公認的相關指標進行實驗研究，觀察其對oa的確切療效及作用機理，這必將對oa的中醫理論產生較大影響，同時對臨床治療也起到更好的指導作用，從而產生較好的社會經濟效益。隨著改革開放的形勢發展，以及中國加入wto與國際接軌的進程的不斷完善，祖國醫學國際地位不斷的提高，我