1、第八章 基因克隆基因克隆(gene cloning )或分子克隆,又稱為重組DNA技術，是應用酶學方法，在體 外將不同來源的 DNA 分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當的宿 主細胞中進行擴增，形成大量的子代 DNA 分子的過程?？寺?cione) 指含有單一的 DNA重組體的無性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細胞建立無性繁殖系的過程 (cloning) 。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟：1、獲得待克隆的 DNA片段(基因)；2、目的基因與載體在體外連接；3、重組DNA分子導入宿主細胞；4、篩選、鑒定陽性重組子；5、重組子的擴增與/或表達。第一節 重組 DNA 中常

2、用的工具酶包括限制性核酸內切酶、 DNA 連接酶、 DNA 聚合酶、逆轉錄酶等，一、限制性內切酶的定義、命名和分類 限制性核酸內切酶是識別并切割特異的雙鏈 DNA 序列的一種內切核酸酶。 限制性核酸內切酶的來源：細菌的限制修飾系統。分子克隆中所用的限制性核酸內切酶屬于第n類。 限制性核酸內切酶的命名。二、限制性核酸內切酶的作用特點1、識別位點的 DNA 序列呈二重旋轉對稱(即具有迥文結構) ；2、切割DNA均產生含5-磷酸和3-羥基的末端；3、 錯位切割產生具有 5-或3-突出的粘性末端；而沿對稱軸切割雙鏈DNA產生平頭末 端，也稱鈍性末端。4、 少數不同的限制酶可識別和切割相同的位點，這些酶

3、稱為同切酶，如Mbol I和Sau3A。三、其它工具酶參考“分子克隆” ( Sambrook,J et al . molecular cloning )第二節 載體宿主系統 一、概述載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA,它們一般是通過改造質粒、噬菌體或病毒等構建的。載體應具備以下條件：1、能在適當的宿主細胞中復制；2、具有多種限制酶的單一切點(即所謂多克隆位點)以便外源DNA插入；3、具有篩選標志以區別陽性與陰性重組分子；4、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA 與宿主 DNA 便于分離；5、對于表達型載體還應具有與宿主細胞相適應的啟動子、增強子、

4、加尾信號等基因表達元件。宿主細胞是基因克隆中重組 DNA 分子的繁殖場所， 適當的宿主細胞， 必須符以下條件：1、對載體的復制和擴增沒有嚴格的限制；2、不存在特異的內切酶體系降解外源DNA ;3、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；4、重組缺陷型，不會產生體內重組；5、容易導入重組 DNA分子；6、符合重組 DNA操作的安全標準。二、質粒載體質粒（plasmid）是存在于細菌染色體外的小的共價、閉環雙鏈DNA分子，能自主復制，并在細胞分裂時遺傳給子代細胞。 質?？少x予宿主細胞一些遺傳性狀如抗藥性等， 通過質粒 賦予細菌的表型可識別質粒的存在，這是篩選重組轉化子的基礎。作為載體的質粒一般具

5、有以下特點：1、分子相對較?。?siokb）；2、松馳型復制；3、具有適當的多克隆位點以便外源DNA 插入；4、具有插入失活篩選標志，便于從平板上直接篩選陽性重組子；5、質粒能攜帶的外源 DNA 片段一般較小（ 15kb）三、入噬菌體載體入噬菌體是一種雙鏈 DNA噬菌體，基因組約為 50kb+。線性入噬菌體DNA分子的兩端各有12堿基的互補單鏈序列，是天然的粘性末端，稱 為 COS 位點。入噬菌體的生活周期：溶菌（裂解）生長時在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生長。入噬菌體的基因組：左臂長約20kb,含噬菌體頭、尾蛋白編碼基因；中央片段長約12-24kb, 對噬菌體為非必需區；右臂長約10kb,

6、含入噬菌體復制和溶菌相關蛋白的編碼基因。所有入噬菌體載體均為通過切除非必需的中央區， 并增減某些限制性酶切位點和插入適當的篩選標 記基因改造而成。已構建的入噬菌體載體分為兩類：1、置換型載體：有兩個酶切位點或兩組排列相反的多克隆位點，其間的DNA 片段可被外源 DNA 置換。這類載體適于克隆 5-20kb 的外源基因片段， 常用于構建基因組 DNA 文庫。2、插入型載體： 只有一個限制性內切酶位點或一組多克隆位點可供外源基因插入。這類載體允許插入5-7kb的外源DNA,適于構建cDNA文庫。如入gt噬菌體載體。 一般將噬菌體 DNA 在體外包裝成病毒顆粒后再用于感染受體菌，這樣能大大提高轉染效

7、率。四、M 13絲狀噬菌體載體M 13基因組大小為 6407bp，它是一種閉環的單鏈 DNA分子，在感染細菌后呈雙鏈復 制型 DNA 。因此用作克隆載體的雙鏈 DNA 可從細菌中分離得到。在細菌中，雙鏈 DNA 復 制 100-200 拷貝后就大量產生單鏈 DNA, 后者包裝成子代噬菌體顆粒，分泌到細胞外，而不 裂解細菌。在 M13 基因組中含 507 個核苷酸的非必需區， 在這個區域插入外源 DNA 不會影響 M13 的繁殖和生存，現在使用的 M13 載體如 M13Mp18 等均為對此區域進行改造而獲得。M13克隆的最大問題是不能插入較大的外源DNA片段（一般 1000bp），但M13載體

8、的優點是從細菌中釋放出來的噬菌體顆粒中含有一條與克隆的模板DNA 互補的單鏈，所以最適合于制備 DNA 測序時用的單鏈模板，另外也可用于制備單鏈特異性 DNA 探針。五、粘粒載體粘粒（柯斯質粒）是指含有 入噬菌體粘性末端的雜種質粒，由入DNA的COS區（約20-數百bp）與質粒重組而成，在宿主細胞中可作為正常噬菌體進行復制，但不表達任何噬菌體 的功能。粘粒的結構特點：1、含有抗藥性標記和質粒復制起始位點；2、一個或多個單一限制酶切位點；3、帶有入噬菌體粘性末端；4、分子?。?-6kb），可容納大到40-50kb的外源DNA片段，因此適于構建真核生物 基因組 DNA 文庫。六、酵母人工染色體載體

9、酵母人工染色體由酵母染色體的著絲粒 （cen4）、自主復制序列（ARS1）和來自四膜蟲的端 粒（Tel）等功能性DNA序列組成。它可攜帶長達 200-1000kb的DNA片段，因此在人基因組 DNA 大片段的克隆中非常有用，是染色體克隆排序的主要工具。用酵母人工染色體克隆 DNA的過程與入噬菌體相似，將 DNA大片段與載體的兩臂相 聯，然后將連接混合物轉化進酵母細胞中，利用載體上的選擇性標記進行篩選。第三節 目的基因的獲取一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫和 cDNA 文庫，兩種文庫的建庫過程不同，產生的基 因結構也不同，因此應用范圍也不相同。（一）、基因組文庫是含有某

10、種生物體（或組織、細胞）全部基因的隨機片段的重組DNA 克隆群體。用入噬菌體載體構建基因組文庫的基本步驟：1、準備載體 DNA（如置換型入噬菌體載體），用適當的限制酶消化并分離得到載體的 左右兩臂；2、純化真核細胞高分子量 DNA，并用適當的限制酶部分消化；3、分離適當大小的基因組 DNA片段（20-24kb ）；4、連接載體與外源DNA;5、連接產物體外包裝及感染；6、基因組文庫的擴增。由于基因組文庫包含了染色體的所有隨機片段形成的重組DNA 克隆，因此，利用適當的篩選方法，就可以從中找出攜帶所需目的基因片段的重組克隆。（二）、 cDNA 文庫cDNA 是指以 mRNA 為模板，在逆轉錄酶的

11、作用下形成的互補 DNA. 以細胞的全部 mRNA 逆轉錄合成的 cDNA 組成的重組克隆群體稱為 cDNA 文庫。 從 cDNA 文庫可以獲得較完整的連續編碼序列（不含內含子） ，便于表達成蛋白質。 構建 cDNA 文庫的主要步驟：1、mRNA 分離；2、cDNA 第一鏈合成；3、cDNA 第二鏈合成；4、載體與 cDNA 的連接 ;5、噬菌體的包裝及轉染；6、CDNA文庫的擴增和保存。二、化學合成法制備 DNA 片段主要用于一些小的 DNA 片段的合成。三、聚合酶鏈反應法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應（PCR），以基因組DNA 或 CDNA 模板擴增得

12、到目的基因片段。第四節 DNA 分子的體外連接DNA 片段的體外連接是重組 DNA 技術的關鍵。 DNA 連接是由 DNA 連接酶催化完成 的。一、DNA 連接酶DNA 連接酶催化兩年雙鏈 DNA 片段相鄰的 5-磷酸和 3-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的 DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA連接酶：T4 DNA連接酶，該酶需要 ATP 作為輔助因子。T4 DNA 連接酶在分子克隆中主要用于：1、連接具有同源互補粘性末端的DNA片段；2、連接雙鏈 DNA分子間的平端；3、在雙鏈平端的 DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。二、粘性末端連接如果載體和插入片段具有相同的粘性末端，則

13、很容易用 DNA 連接酶連接成環狀的重 組 DNA 分子，但是要注意當載體和插入的兩個末端均為同源的粘性末端時，連接后可能出 現以下問題：1、載體自身環化， 造成假陽性背景克隆， 為避免此問題， 可在連接前， 用堿性磷酸酶 將載體 DNA 5- 端去磷酸化，這樣只有載體和插入片段之間才能發生連接；2、插入片段可雙向插入；3、插入片段可多拷貝插入。當 DNA 片段兩端為非同源的粘性末端時，可實現定向克隆，這時的連接效率非常高， 是重組方案中最有效、簡捷的途徑。三、平端連接平端連接的優點是可用 T4 連接酶連接任何 DNA 平端，這對不同 DNA 分子的連接十分 有利。 因為除了相同或不同限制酶酶

14、切產生的平末端分子外，含 3-或 5-突出的粘性末端也可以被補齊或削平，實現平端連接。（一）、 5-突出粘性末端的補齊限制酶降解產生的5-端突出的粘性末端，可用大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段（ klenow 片段）補齊。（二）、 3-突出粘性末端的削平含3突出的粘性末端可用 T4 DNA聚合酶的3宀5外切核酸酶活性補平。 平端連接的主要問題是， 它的連接效率比粘性末端低， 因此需較多的 T4 DNA 連接酶和 較高的底物濃度，聚乙二醇（PEG ）可促進平端連接反應。四、人工接頭連接對平端DNA片段，可借助人工合成的接頭來方便連接。所謂接頭是人工合成的至少8 個核苷酸長的一段迥文序列。 接頭是平

15、端， 在磷酸化后通過 T4 DNA 連接酶可與大多數平端DNA 連接。連接后用相應的限制性內切酶切割，可產生所需要的粘性末端。五、利用適配子連接適配子是人工合成的具有一個以上限制酶識別位點的短序列， 它具有一個平端， 可與其 它 DNA 的平端連接， 同時它還有某種限制酶的突出端， 可與含互補的限制酶突出端的 DNA 片段連接，連接后，用適當的限制酶切割又可產生所需要的突出粘端。第五節 重組 DNA 導入宿主菌體外連接的重組 DNA 分子必須導入適當的受體細胞中才能大量的復制、增殖和表達。 根據所采用的載體的性質，將重組 DNA 分子導入受體可有不同的方法。一、轉化指以細菌質粒為載體， 將外源

16、基因導入受體細胞的過程。 轉化時， 細菌必須經過適當的 處理使之處于感受態即容易接受外源 DNA 的狀態，然后利用短暫熱休克使 DNA 導入細 菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉化細菌，它的優點是操作簡便、轉化效率高、適用于任何菌株。二、轉染和感染利用噬菌體 DNA 作為載體時可經兩種方式導入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌 體 DNA 包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉染，即在 DNA 連接酶作 用下使噬菌體 DNA 環化，再象重組質粒一樣地轉化進受體菌。 但習慣上常把以噬菌體 DNA 為載體構建成的重組子導入細胞的過程統稱為轉染。第六節 重組克隆的篩選與鑒定基因克隆的最后一步

17、是從轉化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落， 并鑒定重組子 的正確性。 通過細菌培養以及重組子的擴增， 獲得所需的基因片段的大量拷貝。 進一步研究 該基因的結構、功能，或表達該基因的產物。一、抗藥性標志的篩選如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr 或 tetrr ，轉化后只有含這種抗藥基因的轉化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落， 這樣就可將轉化菌與非轉化菌區別 開來。如果重組 DNA 時將外源基因插入標志基因內，該標志基因失活，通過有無抗菌素培 養基對比培養，還可區分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉化菌落。二、3 半乳糖苷酶系統篩選很多載體都攜帶一段細菌的 lacZ基因

18、，它編碼3 半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸， 稱為a 肽，載體轉化的宿主細胞為lacZ 15基因型，它表達3 半乳糖苷酶的 C-端肽鏈， 當載體與宿主細胞同時表達兩個片段時， 宿主細胞才有 3 半乳糖苷酶活性， 使特異的底物 X-gal 變為蘭色化合物， 這就是所謂的 a 互補，而重組子由于基因插入使 a 肽基因失活， 不能形成a -互補，在含 X-gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質粒大小，判斷有無插入片段存在， 該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內切酶圖譜鑒定經初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養后，再分離出重組質粒或重組噬菌體DNA用相應的內切酶切割， 釋放出插入片斷； 對于可能存在雙向插入