1、生物芯片及其應用,陳 歡,什么是芯片？,內容,介紹目前主要的生物芯片類型 介紹表達譜芯片的實驗過程,一、生物芯片的類型,表達譜芯片 CGH芯片 芯片測序 MicroRNA芯片 ChIP-chip （ ChIP-seq） 蛋白質芯片 組織芯片,核酸水平,非核酸水平,CGH芯片工作原理,CGH芯片應用（I）,精確、定量地研究人類基因組微缺失和微擴增及其定位方面的應用，如腫瘤診斷，發育方面研究的應用。,基因組差異的發現,在雙倍體生物中（假設Ratio=Cy5/Cy3, Cy5標記實驗基因組，Cy3標記正常基因組） log2Ratio0.58 或者 log2Ratio-1則認為有差異 即：Ratio=

2、3/2 或者 Ratio1/2則認為有差異,CGH芯片的應用（II）,微生物進化及功能分析中的應用： 原理：根據已經測序的參考基因組（reference genome）的基因來設計探針，和待測菌株的基因組DNA雜交，就可以檢測出該菌株基因組是否含有某基因。并且可以根據菌株間基因的相似度來反映其進化關系，也就是說兩個菌株共享的基因越多，則兩個菌株親緣關系越近。 優點：方便快捷準確 ；避免了同一物種的重復測序，能夠節省大量的時間和經費,金黃色葡萄球菌不同菌株的致病基因的組合,Joseph L. DeRisi - UCSF,XMRV Detection by DNA Microarrays and

3、RT-PCR,Identification of a Novel Gammaretrovirus in Prostate Tumors of Patients Homozygous for R462Q RNASEL Variant, PLoS Pathogens,芯片測序,基因芯片的測序原理是雜交測序，即通過與一組已知序列的核苷酸探針進行雜交完成核苷酸 序列 測定。用圖5-9說明測序原理。在一塊基片表面固定已知序列的八核苷酸探針，當溶液中帶 有熒光標記的核苷酸序列TATGCAATCTAG與基因芯片上對應位置的核酸探針產生互補雜交時， 通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序

4、列，據此可重組出靶核 苷酸待測序列。DNA芯片測序技術包括芯片制備、樣品制備、分子雜交、檢測分析、序列 分析和組裝等過程。 （Solid測序-35bp）,芯片測序的特點,優點；陜速、成本低、易于自動化。 缺點：第一，由于眾多寡核苷酸的組成各不相同，其最佳雜交條件難于統一，易出現假陽性和假陰性的雜交結果；第二，根據獲得的數據無法準確地排列重疊序列；第三，如果檢測核酸存在重復序列，那么重疊的探針不是唯一的，重組探針無法再繼續。所以，這種方法不能用于含有許多內部重復和簡單序列單元的DNA。但這種方法用于再測序，即確認已知的核酸序列和研究單核苷酸多態性(SNP)的檢測或突變具有其他方法不可比擬的優越性

5、。突變分析、疾病分子診斷、基因分型。,MicroRNA 芯片,MicroRNA芯片檢測可用于發現樣本間差異表達MicroRNA，從而發現調控基因mRNA轉錄后調控的關鍵因素。 樣本間差異基因由mRNA是否翻譯成蛋白質以發揮功能，將受到差異MicroRNA的調控影響。實驗表型的差異將體現在差異基因功能分布中，通過構建差異MicroRNA與差異基因功能間的相互作用網絡,實驗流程,1、小分子量的RNA提取； 2、加Poly(A)尾巴； 3、利用Oligo(dT)的連接作用加入熒光； 4、雜交； 5、圖像，數據獲取。,ChIP-chip(ChIP-seq),ChIP-chip的基本原理是在生理狀態下把

6、胞內蛋白質和DNA甲醛作用下交聯在一起，用超聲波打碎為0.2-2 kb的染色體小片段，然后通過目的蛋白質特異性抗體沉淀此復合物，獲得特異地作用于目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片段的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。其中共沉淀的 DNA和合適的對照用熒光標記，加在載玻片上，用于芯片分析。使用外源性DNA作為背景，免疫沉淀DNA與作為背景的對照進行比較，可以找到特異性蛋白在基因組中的結合位點。,二、表達譜芯片介紹,cDNA芯片的合成方法 樣本的處理方法 數據分析方法簡介 芯片種類及應用介紹,基因芯片的合成方法,原位合成芯片 光蝕刻原位合成法、電化學原位合成法、噴墨式原位合成法

7、 點樣芯片 針點式合成法、噴墨式合成法,原位光刻合成基因芯片原理,array probes,A 33 array,CG,AC,G,AC,ACG,AG,CG,AG,C,Nucleotide Deposition Sequence ACG,探針合成,探針合成,array probes,A 33 array,CG,AC,G,AC,ACG,AG,CG,AG,C,Nucleotide Deposition Sequence ACG,A 33 array,CG,AC,G,AC,ACG,AG,CG,AG,C,Nucleotide Deposition Sequence ACG,AC,探針合成,完成的芯片,點

8、樣芯片,預先合成探針 Oligo探針 （GoArrays） PCR產物探針 （Primegens） 點制芯片 預先合成好的探針通過類似于噴墨打印機的技術噴射到玻璃基片表面，或者用針頭點在片基上。,芯片探針的設計,PCR產物設計軟件（Primegens） /structure/primegens/ Oligo芯片設計軟件 （GoArrays） http:/www.isima.fr/bioinfo/goarrays/,點制過程,點片后檢查,樣本的處理方法,按照樣本分 DNA、RNA、DNA-蛋白復合體 按照標記信號分子劃分 熒光燃料、生物素、放射性元素

9、按照標記方法分 cDNA 直接標記(間接標記)、PCR擴增標記、末端標記,Cy3和Cy5,Cy3激發波長532nm,Cy5激發波長635nm,芯片實驗流程,1、分離RNA（10g） 2、標記 3、雜交 （預雜交） 4、洗片 5、掃描,圖像掃描,Cy5,Cy3,D.radiodurans 全基因組芯片,D.radiodurans whole genome microarray,建議,1、如可取小量修飾好的玻片進行點樣并測試整個后處理和雜交過程。 2、一旦玻片點樣后，應對小量點樣玻片進行后處理，后處理是否成功可用已知應產生良好結果的 RNA制備的探針進行測試來判定。 3、所有陣列在雜交前應掃描一次

10、，棄去那些有明顯污點的玻片，并棄去那些雜交前背景就高的陣列。,簡單的數據分析主要步驟,數值提取 歸一化 差異基因篩選,數據讀取（Genepix Pro）,數據框獲取： 1、人工獲取； 2、Gal文件獲取,Flag=-50,Flag=-100,Genepix Pro一些直觀數據,背景數據的獲取,局部法 全局法 the global background values are either calculated from a mean or median of all local values 陰性對照法 Negative controls are features that are known

11、not to be reactive, so that they can relied upon always to give the same intensity values independent of the experiment,2個像素 其他的信號點 背景取值區,This region has a diameter that is three times the diameter of the corresponding feature-indicator,芯片背景,為什么要歸一化？,由于樣本差異、熒光標記效率和檢出率的不平衡，需對cy3和cy5的原始提取信號進行均衡和修正才能進一

12、步分析實驗數據，Normalization正是基于此種目的。,歸一化的方法,一組內參照基因（如一組看家基因,外參基因）校正Microarray所有的基因、陽性基因、陰性基因、單個基因。 Lowess,Lowess,A=1/2Log2RG M=Log2R/G,歸一化的類型,With-in slide normalization globe normalization print-tip normalization Between slides normalization,Globe normalization,Print-tip normalization,Between slides norm

13、alization,差異基因篩選,原理：采用cy3/cy5的ratio值對差異基因進行 判斷，或采用統計方法對差異基因進行統計推斷。 方法：倍數法：cy3/cy5比值大于2或者小于 0.5 Z值法： Z=(X-)/ 作用：發現兩個樣本間的差異表達基因，便于后續分析。,Z值法,對于處在同一張芯片上的基因，一般我們認為只有小部分基因是有表達差異（在對芯片原始數據做標準化的時候，我們也曾提到過這個假設） ，同時信號比值在經過對數轉換后，整張芯片上的基因比值近似于正態分布。我們計算每個基因的 Z 值，Z=(X-)/，其中，X 表示該基因的表達比值，表示整張芯片上所有基因的比值平均數， 表示整張芯片上所

14、有基因的方差。當 Z 值大于 2 或者-2時表示基因表達值在平均比值加 2 倍方差以外，這樣的差異就具有統計學意義，可以認為是差異表達基因。 雖然 Z 值法可以幫助我們發現差異基因，但是它也有很大的缺點，如果在給定的基因內不存在差異表達基因，當我們利用 Z 值方法來發掘差異基因時，它總能給出 Z 值的絕對值大于或者小于 2 的基因，即增加了假陽性率。同時，當我們關于“整張芯片中只有小部分基因是有表達差異”的假設不成立，既有大量基因有表達差異的時候，Z 值法又會增加假陰性率。,重復實驗的差異基因判別方法,差異基因的篩選(t-test),C D E,小結,芯片數據處理，過程不是越復雜越好（因為每一

15、步處理都會帶進新的誤差）； 不要執迷于軟件的選擇（各式各樣的軟件實在太多），選擇通用的軟件比較好（Limma，TM4）； 不要過分執著于個別基因的情況，應該重視一類基因表達的模式（pattern）情況。,高級數據處理,Clustering and pattern detection（芯片研究往往是一個動態的過程） Discovery of common sequences in co-regulated genes Linkage between gene expression data and gene sequence/function/metabolic pathways databas

16、es,聚類的實例,芯片實驗往往會研究一個動態的過程，如藥物處理的時間段，藥物處理的濃度梯度，還有就是不同的方法處理后的差異，等等。 右圖-電離輻射后的細菌（D.radiodurans出現明顯的生長停滯）,為什么要聚類,芯片數據的聚類分析目前應用較為廣泛，它根據芯片的基因表達數據（通常是經過標準化后的數據），利用相應的算法，將基因分到各個類別中。在這個階段，我們的注意力不是集中為某幾個或者某些基因的表達情況，而是發現整個轉錄組在一定條件下的轉錄模式。 一般認為在同一類中的基因有相同或相似的生物學功能。聚類的基因表達譜為研究人員提供基因表達差異，啟動子分析，表達模式研究等等便利的條件。,Norma

17、lized data,D. radiodurans recovery after ionizing radiation,聚類常用的軟件,聚類的類型,Herarchical Clustering Link similar genes, build up to a tree of all K-means Self Organizing Maps (SOM) Principle Component ( PCA ),Herarchical Clustering中的距離計算,Herarchical Clustering中的聚類的方法,D. radiodurans 實例,Motif,相當有用的一個芯片處理

18、系統,http:/gepas3.bioinfo.cipf.es/,利用已知路徑分析芯片數據,GO（）采用階層系統對基因進行分類，將功能一致的基因放在同一層 KEGG（http:/www.genome.jp/kegg/）建立了蛋白間相互作用的網絡（途徑和復合體），包含各種各樣的細胞過程。 GenMAPP（）提供了與AC號相對應的途徑圖 BIOCARTA（,常用的公共數據庫,PathwayExplorer,GenMAPP,芯片數據的驗證,Real-time PCR 其他一些生化實驗 對于原核生物，還可以參考同一個操縱子基因的變化情況,same operon,multi - subunit complex,常見的芯片數據庫,GEO at the NCBI Array Express at EMBL,浙江加州國際納米技術研究院-分子診斷平臺,基因治療載體的構建； HIV，XMRV病毒的致病機理研究,分子診斷平臺