密級 論文編號： 中國農業科學院 學位論文 極細鏈格孢菌糖基化激活蛋白的純化 及其電噴霧質譜的分析 of a 士研究生： 李承雷 指 導 教 師：邱德文 研究員 申請學位類別：理學碩士 專 業：生物化學與分子生物學 研 究 方 向：蛋白質藥物工程 培 養 單 位：中國農業科學院研究生院 植物保護研究所 提交日期 2007 年 6 月 F of a S i 2007 基金來源聲明 本學位論文是國家“863” 計劃（項目編號： 2006國家 “973”計劃（項目編號： 2003部分內容。 獨 創 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農業科學院或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關于論文使用授權的聲明 本人完全了解中國農業科學院有關保留、使用學位論文的規定，即：中國農業科學院有權保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意中國農業科學院可以用不同方式在不同媒體上發表、傳播學位論文的全部或部分內容。 (保密的學位論文在解密后應遵守此協議 ) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導師簽名： 時間： 年 月 日 摘 要 從極細鏈格孢菌（提取出來的激活蛋白具有誘導植物系統抗性的活性，示主要有三個蛋白質條帶，分子量分別為 332 66期研究已證明，分子量為 66右的蛋白為糖蛋白，為了進一步研究該糖蛋白的性質及其作用機理，本文通過層析法等多種方法對該蛋白進行了純化，獲得了銀染電泳級的純品；利用 學法切除了析了其糖基修飾位點；在標準蛋白高效液相色譜- 電噴霧質譜（分析技術體系基礎上，建立了該糖基化激活蛋白的 析體系，獲得了精確分子量，經蛋白數據庫搜索，初步推測該糖基化激活蛋白為一新型蛋白。具體結果如下： 用硫酸銨沉淀法結合乙醇沉淀法去除了影響蛋白純化的真菌多糖，優化了柱層析純化的緩沖液和洗脫條件，通過 離子交換層析技術和梯度洗脫方式，以及 0/300 凝膠過濾層析純化，獲得了銀染電泳純的單一蛋白條帶；利用液相等電聚焦結合 術，測得該糖基化蛋白的等電點為 采用 學法去除了該糖基化激活蛋白 果顯示切除后的蛋白呈現兩條帶，初步推測該糖基化激活蛋白至少存在兩個糖基修飾位點。 建立了標準蛋白溶菌酶和 白分析體系，測定了溶菌酶的精確分子質量 解片段的 圖，并通過 索得到正確鑒定。 建立了 析糖基化激活蛋白的技術體系，測定了該糖基化激活蛋白的相對分子質量為 50270D，獲得了其 圖，經數據庫搜索，沒有發現較高匹配，初步推測其為一新型蛋白。 關鍵詞：極細鏈格孢菌，激活蛋白，分離純化，糖基化，電噴霧質譜 3342kD 6of 6kD to be a To by a a on on is of is S in be a of to is by ES at of a on of is by of on at SA to a of is 4310.7 SA an on is of is 0270 of no be a to be 錄 第一章 緒論 . 1 究概述 . 1 白激發子種類及其在國內外研究進展 . 1 敏蛋白. 1 發素 . 2 活蛋白(. 3 蛋白的結構功能及糖基化分析方法 . 3 白質糖基化的主要類型 . 3 基化發生的特點及其分析技術的難點 . 4 白質糖基化研究的內容、技術和策略 . 5 蛋白鑒定/ 糖基化位點確定方法 . 6 噴霧質譜在生物樣品分析中的應用 . 7 噴霧電離過程 . 8 噴霧電離質譜的分子質量的檢測 . 9 噴霧電離質譜用于多肽與蛋白質分析 . 9 效液相色譜- 質譜聯用在激發子研究中的應用 . 12 究目的和意義 . 13 第二章 糖基化激活蛋白的純化及其理化性質的分析 . 14 料與儀器 . 14 劑與材料 . 14 儀器 . 15 法 . 15 細鏈格孢菌（的培養與激活蛋白粗提液的制備 . 激活蛋白的粗分離 . 15 白濃度測定方法 . 16 基化激活蛋白的等電點分析 . 17 基化激活蛋白柱層析純化方法的建立 . 19 基化激活蛋白的確定與去糖基化 . 21 基化激活蛋白的生物活性測定 . 22 果與分析 . 23 基化激活蛋白的等電點 . 23 基化激活蛋白的柱層析純化結果 . 23 基化激活蛋白的去糖基化 . 26 基化激活蛋白的生物活性測定 . 26 結 . 28 第三章 模式蛋白溶菌酶和 噴霧質譜分析 . 29 料與儀器 . 29 劑、材料 . 29 器 . 29 物樣品 . 30 法 . 30 劑及酸度的選擇和儀器參數的優化 . 30 準樣品的析 . 30 血清白蛋白（的酶解 . 31 準蛋白的質譜分析條件 . 32 果與討論 . 32 劑及酸度的選擇 . 32 器工作條件優化 . 33 準蛋白純品和混合物的析結果 . 33 噴霧質譜測定溶菌酶的相對分子質量 . 35 譜分析結果 . 36 結 . 39 第四章 糖基化激活蛋白的 . 40 料與儀器 . 40 劑、材料 . 40 器 . 40 法 . 40 . 40 譜條件 . 41 基化激活蛋白的酶解 . 41 據分析 . 41 果與討論 . 41 基化激活蛋白的析. 41 用譜測定糖基化激活蛋白的相對分子質量 . 42 基化激活蛋白酶解產物的離及譜分析 . 43 結 . 46 第五章 結論 . 47 參考文獻 . 48 致謝 . 54 作者簡歷 . 55 英文縮寫 英文全稱 中文 二烷基磺酸鈉 壓蛋白液相色譜 效液相色譜 相高效液相色譜 基酸 腈 牛血清白蛋白 丙烯酰胺凝膠電泳 后裂解 撞誘導解離 蒸水 de de 頭測序 噴霧 點聚焦 子阱 道爾頓 質輔助激光解析電離 硫蘇糖醇 氟甲基磺酸 指紋圖譜 MS 譜 S 聯質譜 堿基 合酶鏈式反應 補，N，N，N一四甲基乙二胺羥甲基氨基甲烷 程相關蛋白 肽:中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 第一章 緒論 究概述 蛋白激發子是一類能激發植物防御反應基因表達與過敏性反應的特殊信號蛋白活性物質（王金生， 2001） 。近 20 年來，已經從植物病原菌發現多種具有誘導植物廣譜抗性和促進生長的多功能激發子類蛋白。其中代表性的蛋白類激發子為：過敏蛋白（激發素（激活蛋白（激發子能引起抗病基因的誘導表達，抗病物質的產生，細胞調亡，過敏反應（ 等。這些反應阻止或限制了病害的發生和發展，減小其危害。由于激發子的作用在“ 植物- 微生物” 互作事件中處于上游，是其他反應（如與受體結合，信號傳導，抗病基因誘導表達等）的源頭( 2001) ，因此對其研究就顯得尤為重要。 利用層析、電泳等多種技術手段純化這類激發子蛋白，并采用可與高效液相色譜聯用的高靈敏度的電噴霧質譜對其進行鑒定，序列分析和翻譯后修飾等，可以為分析這類蛋白質的性質，結構與功能的關系，及作用機理等的研究提供豐富的信息，并為更好的將這些能誘導植物廣譜抗性和促進生長的多功能激發子類蛋白應用于生物防治領域奠定理論基礎。 白激發子種類及其在國內外研究進展 目前發現的植物蛋白激發子按照來源與特性，分為過敏蛋白 發素 毒蛋白，病毒蛋白及激活蛋白 。 敏蛋白 992 年 研究表明， 白是由梨火疫病細菌( 基因編碼的蛋白，大小為 44ei et 1992）。突變分析表明 植物病原細菌誘導非寄主過敏性和在寄主上致病所必需的蛋白因子，可在煙草上單獨誘導產生過敏反應。 因雖然是來自于病原菌，但是作為一種非特異性的激發子卻能夠引起非寄主抗病性的增強以及促進植物的生長。 來自梨火疫病的病原菌 而在轉 梨上， 表現出了非常強的抗病。 有以下分子特征(1) 親水性； (2)403 個氨基殘基長度，分子量 44(3)對熱穩定：100 攝氏度處理 10會使其失活；(4) 對蛋白酶 K 和紫外線敏感；(5) 富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(6) 水溶性酸性蛋白；(7) 無四級結構。 1中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 發素 疫霉屬( 腐霉屬( 生的、在煙草上引起過敏反應(和系統獲得抗病性(的一類胞外蛋白類激發子的總稱。雖然這類激發子在化學性質上各不相同，但是都具有引發植物防衛反應的特性( 1994) 。自 1977 年觀察到( P. 菌體提取物和培養濾液能引起煙草葉片壞死性反應以來，從 P. . P. c a p s i c 0多種蛋白類激發子（et 1989）。其中最有代表性的是由隱地疫霉( 分泌的隱地蛋白(。 基酸序列高度相似和保守，蛋白質前體含 19 或 20 個氨基酸的信號肽，成熟蛋白質一般含 98 個氨基酸, 分子量一般為 10 少數 有不同。迄今已發現 17 種疫霉菌中存在 性蛋白，根據等電點和對煙草的激活反應可分為 酸性） 3堿性） 7類。多數卵菌產生的 有或一種類型, 但致病疫霉（等 7 種卵菌分別產生 與 兩種類型的 了致病疫霉產生的兩種 與型誘導能力相同, 其他所有型 極低濃度(100 下就能誘導煙草產生 使植株獲得廣譜抗病性，同時產生與防衛反應相關的物質如乙稀、植保素(、病程相關蛋白(（ et 1999）。 用 理煙草、番茄、萵苣、甘藍、黃瓜、茄子、辣椒和擬南芥等 61 種植物，結果發現兩種 煙草、蘿卜和蕪菁植物上產生 在其它植物上則不能，表明 一種特異性激發子（et 1993） 。研究證明， 通過水楊酸介導抗病信號途徑，激發植物獲得對真菌、細菌等病原物的系統抗性 (同時產生活性氧自由基、脂過氧化物、植保素 (病程相關蛋白等防御反應相關物質（et 1999）。 國內對研究主要集中在基因的克隆和表達上。謝丙炎等在 1998 年系統研究了苧麻疫霉誘抗激發蛋白(的理化特性、功能，并進行了基因結構的分析，發現該蛋白能誘導辣椒對疫病產生抗性，并首次發現因存在斷裂現象。用低濃度的隱地蛋白處理茄科、十字花科等多種非寄主植物可誘導產生并使植物獲得對病原物的系統抗病性（謝丙炎等 , 1999）。 2000 年蔣冬花等研究還發現，隱地蛋白 13 位上的賴氨酸在誘導細胞死亡中起著關鍵的作用（蔣冬花 & 孔世海, 2002 ）。將克隆的隱地蛋白(基因轉化煙草后表現抗黑脛病作用（蔣冬花等, 2002 ）。 張宏明從疫霉菌( 種 片發生過敏性壞死反應。用該蛋白處理煙草葉肉、表皮和保衛細胞，以及懸浮培養細胞在產生過敏性壞死反應之前，均有測這種 激發子（張宏明等, 1999 ） 2中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 活蛋白 物激活蛋白是從葡萄孢菌（ 、交鏈孢菌（ 、黃曲霉菌（ 稻瘟菌（ 青霉菌 （、紋枯病菌（、 木霉菌 （、鐮刀菌（等多種真菌中篩選、分離、純化出的一系列蛋白激發子（邱德文， 2002， 2004）。該類蛋白不激發煙草植株的過敏反應，這與 生物活性均基于植物的過敏反應不同（劉萍萍 & 閏艷春， 2005）。激活蛋白誘導處理種子能夠加快黃瓜種子的萌發，促進幼根的生長；處理多種瓜果蔬菜均能提高其座果率，如處理西瓜和番茄可使瓜果數和果重顯著提高，分別達到 對灰霉病害的防效達 用激活蛋白可濕性粉劑處理桃子與西紅柿，可減少桃子與西紅柿灰霉病的發病率和爛果率，對桃子與西紅柿具有保鮮作用。研究表明交鏈孢菌激活蛋白處理后，水稻幼苗增強了對稻瘟菌的抗性，幾丁質酶和 - 葡聚糖酶活性提高，且酶活性的變化趨勢與稻瘟菌抗性的變化趨勢相仿，它們可能介入了交鏈孢菌激活蛋白誘導的水稻幼苗對稻瘟菌抗性的提高（趙利輝等，2005 ）。 植物激活蛋白主要通過激活植物體內分子免疫系統，提高植物自身免疫力；通過激發植物體內的一系列代謝調控，促進植物根莖葉生長和葉綠素含量提高，從而達到提高作物產量的目的。由此可見該類激活蛋白具有廣泛的應用前景。 植物激活蛋白研究起步較晚，但是已經成功地從 達文庫中篩選到了部分植物激活蛋白的 列。徐鋒（2006）從稻瘟菌（中也純化了一種激活蛋白，并獲得了其 列。趙利輝（2005）和黃麗俊（2005）等也利用激活蛋白處理后的水稻基因芯片研究了激活蛋白對水稻基因的影響。 蛋白的結構功能及糖基化分析方法 糖蛋白(是指由比較短，往往帶分支的寡糖與多肽鏈某些特殊部位的羥基或酰氨基共價連接而成的一類結合蛋白質。它廣泛存在于動物、植物、微生物及病毒中。細胞中的糖蛋白有可溶性的,也有與膜結合的不溶形式,生物體內大多數蛋白質是糖蛋白（ ， 1993）。近 20 年來的研究發現，糖蛋白中的糖鏈在各種生命現象中起著重要的作用，如細胞識別、粘連與融合；信號傳導、免疫與應答；細胞轉化、分化與反分化等都與糖鏈的作用有關。自 19 世紀末人們開始提出糖蛋白的概念并加以研究以來，先后明確了糖蛋白的糖基結構、多糖成分和部分生物學功能，同時，也能夠識別糖蛋白中的糖苷鍵類型。 白質糖基化的主要類型 在糖蛋白的高級結構中,肽鏈折疊卷曲成特定的空間結構,肽鏈上只有某些特殊的氨基酸序列位點才能與糖鏈結合,糖鏈作為側鏈和親水基團暴露在空間結構外面。糖肽鍵是糖鏈和肽鏈的連接鍵,是指糖基異頭碳原子上的羥基與肽鏈氨基酸殘基上的酰胺基或羥基脫水形成的糖苷鍵。3中國農業科學院碩士學位論文 第一章 緒論 可分為 與糖肽鍵的氨基酸殘基主要有:天冬酰胺(、絲氨酸(、蘇氨酸(、羥賴氨酸(和羥脯氨酸(。它們可以與 糖、半乳糖及阿拉伯糖形成 5 種主要的糖肽鍵,分別是:、- 氨酸(、此外,還發現罕見的以 存在于小鼠血紅蛋白 。 且與氨基酸順序有關。帶糖鏈的天冬酰胺殘基附近往往含有一個蘇氨酸或絲氨酸殘基，即它具有順序子結構，稱為天冬酰胺順序子：天冬酰胺天冬酰胺其中 X 可代表除脯氨酸以外的任何一種氨基酸殘基（吳東儒等，1987 ）。 研究表明糖蛋白中能與天冬酰胺殘基相連的寡糖鏈數目是有限的，并非所有天冬酰胺順序中的天冬酰胺都發生糖基化，如雞卵清蛋白。天冬酰胺順序子不僅與糖基化有關，可能對糖鏈的組成與長短也有控制作用，如順序子中的 X 為極性氨基酸時，常生成復雜型寡糖鏈；X 為非極性氨基酸時常形成單純型寡糖鏈。 要有 4 種類型（ 張維杰，1987 ） 。