microRNAs在響應(yīng)植物逆境中的作用Ramanjulu Sunkar, Yong-Fang Li and Guru JagadeeswaranDepartment of Biochemistry and Molecular Biology, Oklahoma State University, Stillwater, OK 74078, USA作為基因調(diào)節(jié)分子 microRNA的發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致了人們對植物和動物轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控認識的轉(zhuǎn)變。miRNA已成為植物生長發(fā)育的主要調(diào)節(jié)分子miR398的靶基因在抗逆性方面起一定的作用，這一發(fā)現(xiàn)表明microRNA在植物逆境響應(yīng)方面有一定的作用。此外， 和植物的生長和發(fā)育相關(guān)的大多數(shù)miRNA表達譜在逆境中顯著改變。這些最新的研究結(jié)果意味著，減輕在脅迫下植物的生長發(fā)育損傷可能收到miRNA的控制。這里我們將概述miRNA介導(dǎo)的植物耐受性方面的研究進展。miRNAs and 植物的脅迫耐受性植物受到脅迫時可以利用多基因調(diào)控機制，包括基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以恢復(fù)和重新建立細胞的動態(tài)平衡。miRNA已經(jīng)成為無處不在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控分子。植物miRNA是約21個核苷酸長的小調(diào)節(jié)分子，更長的初級miRNA采用發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)被剪切得到miRNA。miRNA基于目標(biāo)的mRNA不完善序列的互補性來識別以及通過降解或抑制同源靶mRNA的翻譯來抑制表達。在動物中，蛋白質(zhì)編碼基因的大約60的似乎是由miRNA調(diào)節(jié)。相比之下，植物miRNA的目標(biāo)只占少量（150，少于1）。雖然miRNA的數(shù)量少，但植物miRNA控制基因調(diào)節(jié)的影響不能低估，因為大多數(shù)目標(biāo)是轉(zhuǎn)錄因子2。這些轉(zhuǎn)錄因子可能參與從種子萌發(fā)到種子成熟的發(fā)育過程。因此，miRNA被認為是調(diào)節(jié)了主要發(fā)育流程。直到miR398（它的目標(biāo)是/鋅超氧化物歧化酶），miR395和miR399（這兩個分別針對硫酸鹽轉(zhuǎn)運體（AST68）和磷酸轉(zhuǎn)運體（PHO1）靶基因的鑒定才將植物脅迫反應(yīng)和miRNA建立了直接的聯(lián)系。miRNA與植物脅迫反應(yīng)的聯(lián)系還可以通過以下事實得到提示，thathyl1和帽結(jié)合蛋白80/ABA過敏突變體，被破壞的是miRNA的合成，ABA是幾種脅迫應(yīng)答基因表達的調(diào)節(jié)因子。更令人稱奇的是，大多數(shù)靶向轉(zhuǎn)錄因子的miRNA在應(yīng)激反應(yīng)中表達顯著改變。哪怕是細微和短暫的應(yīng)激過程miRNA表達的瞬時變化可能有著明顯的生理效應(yīng)。例如，miR393略微和瞬時表達上調(diào)來響應(yīng)氮的可用性，但可以有一個強大的效果，通過調(diào)節(jié)AFB3 mRNA的豐度來影響根的建成。同樣，miR393一個微妙的和短暫的變化調(diào)節(jié)FLG-22 miR393的表達暗示miR393在植物抗病能力中的作用。的確，轉(zhuǎn)基因植物中過量表達miR393，抑制轉(zhuǎn)運體response1（TIR1）轉(zhuǎn)錄水平均有所下降，顯示出增強抗細菌感染。這些初步的研究令人信服地建立miRNA在植物應(yīng)激反應(yīng)中的作用，在脅迫下植物的生長和發(fā)育被削弱但對此在分子水平上相對知之甚少。討論最近的研究結(jié)果，增強了我們的理解，這些研究突了miRNA在逆境下載植物生長，發(fā)育，激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為調(diào)節(jié)分子的重要作用。干旱、鹽干旱和鹽是世界范圍內(nèi)制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的兩大因素。過去的20年，植物的耐逆性分子基礎(chǔ)被深入研究，這些研究工作已經(jīng)確定了在干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)的許多基因，希望與過表達脅迫響應(yīng)基因會提高植物抗逆性。然而，這些轉(zhuǎn)基因植物中表現(xiàn)出非常小的提高抗逆性，或沒有任何改善，這主要是因為在植物脅迫下復(fù)雜的基因相互作用不完全被理解。除了編碼蛋白質(zhì)的基因， miRNA在應(yīng)激條件下的表達也被改變（表1）。已確定的miRNA太多因此沒有被全面包含在這個表里（表1）。因此，主要的被應(yīng)激誘導(dǎo)改變的miRNA表達在這里被討論討論。雖然報告結(jié)果各異， miR393，miR160和miR167上調(diào)表達在干旱和/或鹽脅迫下已經(jīng)在幾種植物物種中被普遍觀察到（表1）。這些miRNA在響應(yīng)脅迫的表達變化是植物的減輕脅迫損傷的重要原因（圖1）。miR169是一個在抗旱和鹽脅迫響應(yīng)中Table 1. MicroRNAs responsive to biotic and abiotic stresses in diverse plant speciesAbbreviations: Ath, Arabidopsis thaliana; Bdi, Brachypodium distachyon; Gma, Glycine max; Hvu, Hordeum vulgare; Mtr, Medicago truncatula; Mes, Manihot esculenta; nd, not determined or no change, Pvu, Phaseolus vulgaris; Peu, Populus euphratica; Ptc, Populus trichocarpa; Pte: Populus tremula; Ttu, Triticum turgidum; Osa, Oryza sativa; Vun, Vigna unguiculata; Zma, Zea mays; , upregulated; , initially upregulated then returned to basal level; #, downregulated; miR156a，miR171和miR408在葉被誘導(dǎo)，但在根里表達不變（表1）。同樣，在蒺藜苜蓿，水脅迫下miR398上調(diào)更為明顯較根里。miRNA在不同組織的差異調(diào)控是為適應(yīng)脅迫的重要方式，但是組織特異性調(diào)節(jié)可能在整株植物分析中被遺漏。冷，熱等非生物脅迫溫度波動在每一天和變化的季節(jié)很常見，植物必須重新編寫他們的基因表達譜來適應(yīng)這樣的溫度劇烈變化。轉(zhuǎn)錄的低溫應(yīng)答基因是非常已知，但是miRNA最近才被添加到低溫應(yīng)答基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。比較不同的物種（擬南芥，短柄草和楊樹楊中miRNA表達的概況毛果）冷應(yīng)激過程中miRNA的表達譜發(fā)現(xiàn)有相似性（miR397和miR169的上調(diào)），和差異性（miR172上調(diào)在擬南芥中和短柄但沒有普遍性）。在寒冷脅迫下在不同的植物物種中相反的miRNA調(diào)控模式也有報道。在冷脅迫，在楊樹和擬南芥中miR168水平上調(diào) ，但在水稻下調(diào)。同樣，miR171下調(diào)在水稻中，但響應(yīng)低溫脅迫時在擬南芥上調(diào)。其中的一些相互矛盾的報道可能是真正可以歸因于不同無關(guān)的植物物種的反應(yīng)。但是，不同實驗條件和所采用的方法不能排除是觀察到的差異可能的原因。在世界許多地方增加的溫室氣體排放量，加上降低的年降水量增加了平均生長季節(jié)的溫度。高溫不利地影響植物生長及發(fā)育，其中在花粉活力，灌漿和成熟過程收到最明顯和嚴重的影響。由熱應(yīng)激誘導(dǎo)的幾個miRNA在楊樹和小麥中已經(jīng)鑒定（表1）。此外，從小麥幼苗暴露熱應(yīng)激（408C）下miRNA表達譜，揭示了在耐熱和敏感植株中miRNA動力學(xué)的不同。除了這些脅迫，miRNA的表達在不同的植物物種的其他非生物脅迫下被改變，如缺氧，紫外線B輻射和氧化應(yīng)激（表1），這就表明miRNA是脅迫應(yīng)答基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個組成部分。生物脅迫（細菌致病）與病原體接觸，寄主植物可以基于病原體相關(guān)分子性質(zhì)識別病原體，并在涉及快速變化的基因，激素和代謝物水平啟動防御機制。miRNA 也是這種防御機制的一部分。幾個miRNA，如miR393，miR319，miR158，miR160，miR167，miR165/166和miR159，均上調(diào)，而miR390，miR408和miR398下調(diào)在擬南芥葉細菌丁香假單胞菌，番茄DC3000侵害時，miR393，miR160和miR167再葉片中上調(diào)在挑戰(zhàn)PstDC3000 HRCC病原體時。同樣，在擬南芥中用鞭毛蛋白22可以誘導(dǎo)miR393表達。這些研究表明，靶基因是參與生長素的感知和信號產(chǎn)生的miRNA在細菌感染的發(fā)病過程中上調(diào)。生長素信號的產(chǎn)生的抑制促進植物對這種感染的抗性，說明微RNA在保護植物免受致病細菌侵害中起到至關(guān)重要的作用。 缺磷磷是植物所必需的營養(yǎng)素。主要是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控應(yīng)對磷酸缺乏，但miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)也參與了這一過程。miR399，miR827和miR2111特異的響應(yīng)磷酸鹽缺乏。此外，miR156，miR778，miR828，miR169，miR395，miR398和miR399的豐度磷酸鹽缺乏時也改變，這表明其他的miRNA在磷酸鹽的動態(tài)平衡中的一種參與調(diào)控。這些miRNA中， miR399已經(jīng)得到很好的認識，誘導(dǎo)miR399表達負調(diào)控PHO2/UBC24（一個E2泛素結(jié)合酶），PHO2/UBC24負向調(diào)節(jié)從舊到年輕葉調(diào)動內(nèi)部磷酸鹽。有趣的是，miR827和miR2111，也是針對泛素途徑的E3連接酶（At1g02860和At1g63010由miR827和At3g27150通過miR2111），這表明泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程是一種常用的響應(yīng)缺磷途徑。誘導(dǎo)這三個miRNA ，可能下調(diào)E2和E3酶的表達，從而減輕下游目標(biāo)蛋白酶體介導(dǎo)的降解。鑒定由miR827和 miR2111靶向的E3連接酶的底物將揭示這些E3連接酶是否在缺磷條件下也能調(diào)節(jié)磷酸的動態(tài)平衡。缺硫硫是植物必需的另一種營養(yǎng)素，是在干燥的土壤中以硫酸鹽的形式提供。在吸收方面，硫酸鹽最初融入的氨基酸半胱氨酸，隨后進入谷胱甘肽，植物抗毒素和硫代葡萄糖苷，這下對植物最佳條件以及為在脅迫下生存生長有重要意義。在缺硫期間，硫的吸收和代謝的植物調(diào)節(jié)發(fā)生在不同的水平，miRNA是這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分。miR395，收到缺硫酸鹽特異性誘導(dǎo)，其靶標(biāo)是一種低親和力轉(zhuǎn)運硫酸（SULTR2;1/AST68）和ATP硫酸的三名成員家庭（APS1，APS3，APS4）。 APS1成績單的水平，但不是AST68水平，負相關(guān)miR395的誘導(dǎo)在缺硫時候。在對比之間的負相關(guān)關(guān)系miRNA和其靶mRNA，既miR395和AST68在缺硫期間的擬南芥根系水平的提高。然而，組織特異性譜揭示miR395是誘發(fā)在韌皮薄壁，而AST68被誘導(dǎo)在木質(zhì)部薄壁46,48,49，表明miR395或許在薄壁細胞防止AST68滲漏表達。最近的研究表明miR395的功能在缺硫酸鹽時在擬南芥葉中 被激活，但如何參與這種調(diào)節(jié)機制不清楚。除了miR395。miR156，miR160的水平，miR164，miR167，miR168和miR394的表達在缺硫時也改變，提示這些miRNA可能在缺硫調(diào)節(jié)中起到一定的作用。缺銅銅是作為一個必需的微量營養(yǎng)素，以輔助因子參與了各種植物功能蛋白，包括光合作用，清除活性氧和感知乙烯。在植物中，銅動態(tài)平衡是一個嚴格監(jiān)管的過程，涉及一些保守的銅響應(yīng)的miRNA（miR397，miR398，miR408和miR857）。有趣的是，這些miRNA是靶向已知轉(zhuǎn)錄物的含銅蛋白質(zhì)，例如銅/鋅SODS（碳酸飲料），plantacyanin和幾個漆酶（漆酶-2，3，4，7，12，13和17）。缺銅誘導(dǎo)的miRNA表達下調(diào)靶基因的表達，提示銅響應(yīng)的miRNA可以節(jié)省銅以提供給更多必需的蛋白質(zhì)（如質(zhì)體藍素和細胞色素c的氧化酶）實現(xiàn)的方式是通過沉默CSDs，plantacyanin和漆酶。鏈接氧化應(yīng)激和銅動態(tài)平衡的miR398調(diào)控Figure 2. Dual but opposite regulation of miR398 is dependent on the nature of stress in Arabidopsis.miR398針對兩種不同的基因家族：銅/鋅SODS（CSD1和CSD2）和銅伴侶超氧化物歧化酶（CCS1）（圖2）miR398響應(yīng)氧化應(yīng)激和缺銅，但是一個相反的方式，也就是說，miRNA下調(diào)在氧化應(yīng)激過程，但缺銅時上調(diào)。在最佳生長條件，miR398是在中等水平表達（盡管這個水平可以在不同的組織之間變化），精調(diào)CSD1，CSD2和CCS1轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)豐度。在應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧往往積累，解毒需要增加CSD1和CSD2表達，通過抑制miR398的水平來實現(xiàn)（圖2），而在缺銅，誘導(dǎo)miR398導(dǎo)致了沉默CSD1/CSD2/CCS1以節(jié)省銅為更重要的蛋白質(zhì)提供。總之，miR398水平是上調(diào)或下調(diào)取決于植物的生理狀態(tài);下調(diào)發(fā)生在響應(yīng)降低氧化應(yīng)激，上調(diào)以節(jié)省銅。氮必需營養(yǎng)素氮罐的缺少會對植物生長發(fā)育的多個不同方面產(chǎn)生負面影響。植物利用各種基因調(diào)控機制，包括miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控，以適應(yīng)低氮可用性。miR393/AFB3模塊參與調(diào)控根系構(gòu)型對氮素利用。 AFB3水平是在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控針氮利用，轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)依賴于miR393。miR393上調(diào)響應(yīng)氮化處理，但其上調(diào)是相當(dāng)短暫的，2 h后達到峰值。上調(diào)miR393水平引發(fā)AFB3下調(diào)，這又控制著下調(diào)主根和側(cè)根的生長。另一個氮響應(yīng)的miRNA模塊miR167/ARF8。 細胞特異分析顯示，miR167a被壓抑在中柱鞘和根冠，而它的目標(biāo)是ARF8上調(diào)來應(yīng)對氮處理，后者接著啟動側(cè)根形成在擬南芥中。總的來說，這些研究表明，氮可改變miRNA的表達后者通過靶向AFB3或ARF8再通過生長素信號調(diào)節(jié)根系統(tǒng)的體系結(jié)構(gòu)。miRNA靶標(biāo)受到脅迫特異的調(diào)控在植物，大多數(shù)的miRNA靶向?qū)儆谕换蚣易宓亩鄠€目標(biāo)。數(shù)據(jù)表明，針對特定的條件下，miRNA能夠選擇性地調(diào)節(jié)特定的基因表達。例如，在非生物脅迫下降低miR398表達導(dǎo)致上調(diào)既CSD1和CSD2，而由丁香假單胞菌，番茄DC3000 AvrRpt2或AvrRpm1感染導(dǎo)致表達下調(diào)只影響CSD1但不影響CSD2。同樣，該被上調(diào)響應(yīng)氮的miR393下調(diào)AFB3，但不影響它的三個其他靶標(biāo)。目前還不清楚的其他靶標(biāo)如何逃避miRNA監(jiān)管。這可能因為miRNA和其靶基因的表達以一個非重疊的方式，因為在擬南芥miR395和AST68已經(jīng)顯示出。還有其他的可能性，如包涵miRNA的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）無法識別某些mRNA靶標(biāo)，由于結(jié)合的RNA結(jié)合蛋白，或本地中RNA結(jié)構(gòu)的存在導(dǎo)致miRNA識別位點是不可訪問，如人類RISC的情況。miRNA將脅迫下減緩植物生長和激素信號聯(lián)系在一起復(fù)雜的植物激素響應(yīng)由相互作用的兩種不同的蛋白質(zhì)家族介導(dǎo)，AUX / IAA蛋白（轉(zhuǎn)錄阻抑物）和植物生長素響應(yīng)因子（ARFs）傳導(dǎo)生長素信號在轉(zhuǎn)錄水平主要誘導(dǎo)三組基因：AUX / IAA，GH3和SAUR。幾個轉(zhuǎn)錄因子，如HD-ZIP的成員家庭，AP2型，AS2狀（LBD），MYB類，鋅指狀和許多其他的一樣，也依賴于生長素基因信號62,63。對生長素的感知由TIR1生長素受體，TIR1降低了AUX / IAA蛋白質(zhì)，這是結(jié)合并抑制ARF轉(zhuǎn)錄因子來負調(diào)節(jié)生長素信號。AUX / IAA-介導(dǎo)的負調(diào)控的ARFs反過來激活或抑制生長素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。在23種ARFs中有八個是目標(biāo)的miRNA和TAS3siRNAs：miR160調(diào)控ARF10，ARF16和ARF17和miR167靶調(diào)節(jié)ARF6和ARF8;而的miR390依賴TAS3siRNA調(diào)節(jié)ARF2，ARF3和ARF4。其中，ARF6和ARF8被稱為是轉(zhuǎn)錄激活因子，而其他小RNA靶向的ARFs被認為是轉(zhuǎn)錄阻遏物。 減慢植物的生長和代謝率是常見的生存策略，用轉(zhuǎn)移能量和其他資源以應(yīng)付脅迫。生長素信號對植物生長和發(fā)育至關(guān)重要，最近的研究表明，生長素也參與了植物脅迫耐受性。生長素信號和脅迫的聯(lián)系在miRNA這里被觀察到，miRNA靶向TIR1和ARFs，例如，miR160，miR167和miR393對干旱，鹽，ABA，UV-B，寒熱的上調(diào)響應(yīng)（表1）。這些miRNA也響應(yīng)于細菌感染，這意味著生物和非生物脅迫的信號融合于miR393，miR160和miR167調(diào)控的上游。上調(diào)miR393導(dǎo)致下調(diào)TIR1，這又降低TIR1介導(dǎo)的降解AUX / IAA，導(dǎo)致通過AUX ARF失活/（圖1）。同樣，脅迫誘導(dǎo)miR160和miR167的上調(diào)，這樣下調(diào)五個ARFs的表達，其中的ARF6和ARF8是正調(diào)控因子，ARF10，ARF16和ARF17是成長和發(fā)展的負調(diào)控因子。在對比的miRNA一般會上調(diào)，但是miR390在脅迫下下調(diào)， 因此，他們的目標(biāo)ARF2，ARF3，ARF4上調(diào)。生長素應(yīng)答基因如GH3編碼生長素的綴合蛋白質(zhì)。因此，這些基因的調(diào)控是控制生長素水平的重要機制（生長素的動態(tài)平衡）。ARF17可以作為一些阻遏GH3基因。更多的證據(jù)表明ARF10 ， ARF16和ARF17是抑制生長素信號，來自于對心皮（ FOC ）突變體的花器官的研究。FOC突變導(dǎo)致無法積累miR160a，致使ARF10 ， ARF16和ARF17水平升高，并降低對生長素的響應(yīng)，通過DR5：GUS表達發(fā)現(xiàn)。增加miR160水平導(dǎo)致下跌ARF17，在反過來有助于升高GH3蛋白水平。增加了GH3蛋白可能減少游離IAA含量，在通過增加GH3 - IAA共軛池的細胞。因此，對應(yīng)力響應(yīng)miR160另一個潛在的作用是它可能在脅迫下有助于生長素的動態(tài)平衡。雖然每個植物的ARFs的確切作用未知，看來差各種ARFs的調(diào)控miRNA的很可能是對于抗逆性重要支持的想法，在壓力下植物生長衰減可能介導(dǎo)通過控制生長素感知和信號的miRNA。抗逆作用中miRNA的作用miRNA*成熟功能的互補鏈miRNA，被認為是迅速降解或聚集以只有非常低的水平，這表明它可能并不實用。然而，最近的一些研究表明一定的條件下植物的miRNA*往往會積聚在較高水平。例如，miR393*在擬南芥葉片積累高水平用于挑戰(zhàn)細菌病原體丁香假單胞菌。誘導(dǎo)miR393*促進植物抗細菌感染通過調(diào)節(jié)液泡定位的MEMB12的表達（SNARE）。有趣的是，miR393和miR393*調(diào)節(jié)兩個完全不同的基因表達家族（TIR1和SNARE）從而促進寄主植物的抗病性。在擬南芥缺磷時，miR399*也高水平積累。miR399*也聚集在高水平下的磷酸鹽剝奪在擬南芥39。同樣，miR395*積聚發(fā)生在甜高粱種植中的最佳營養(yǎng)條件，表明miR395*在生物合成過程而不是硫代謝。這些結(jié)果提出了一些有趣的的問題。miR395*和miR399*有功能嗎？如果有，什么是他們的目標(biāo)，而這些靶標(biāo)的作用是以miRNA的對應(yīng)物參與相同的生化過程？結(jié)論，評論和展望全基因組的觀察已經(jīng)確定了植物調(diào)節(jié)miRNA以時空特異性的方式，已經(jīng)出現(xiàn)的一個顯著特點是應(yīng)激過程中植物生長發(fā)育的衰減可能被保守的miRNA靶向轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)，特別是調(diào)控生長素的感知和信號的miRNA。營養(yǎng)缺乏