1、 驗證方案的起草起草人部門日期2、 驗證方案的審批審核人部門日期3、 驗證方案的批準批準人批準日期目 錄1 前言2 職責3 驗證的方法及步驟4 異常情況及偏差處理5. 驗證結果評價及建議6、再驗證周期1. 前言消毒劑主要使用在潔凈控制區域，用于控制生產環境、設備表面等的微生物污染的一種化學劑。由于沒有一種消毒劑是完全理想的，因此有必要在實際工作中使用兩種以上的消毒劑。交替使用在理論上有利于防止形成相同環境的分離菌或抑制細菌的適應性。本實驗方案針對75%乙醇、1%新潔爾滅、3%甲酚皂殺菌劑、3%的過氧化氫溶液共4種消毒劑進行抑制或者殺滅微生物的效果確認。1.1驗證的目的本驗證的目的在于制定方法及可接受標準，來評價消毒劑對微生物的殺滅效果。1.3驗證的范圍75%乙醇、1%新潔爾滅、3%甲酚皂溶液、3%的H2O21.4驗證內容： 本驗證先在實驗室對所使用的消毒劑，用六種控制菌做生物指示劑挑戰性實驗；然后做現場消毒考察實驗，即現場消毒后用棉簽取樣法對消毒后的表面取樣，做表面殘留微生物限度檢查。通過對指示菌的殺滅對數值和現場消毒后潔凈區表面微生物的殘留限度來確認消毒劑的消毒效果。2. 職責2.1驗證小組成員：部 門人員2.2職責2.3驗證進度3. 驗證方法及步驟3.1實驗材料3.3.1 菌株 （1）細菌：金黃色葡萄球菌 (ATCC6538)銅綠假單胞菌(ATCC15442)大腸桿菌(ATCC25922) 傷寒桿菌(ATCC6539)（2）細菌芽孢：枯草桿菌芽孢(ATCC9372)（3）真菌：白色念珠菌(ATCC10231)3.3.2 培養基無菌大豆胰蛋白胨瓊脂培養基(TSA)、營養肉湯培養基。3.3.3 稀釋液：1%蛋白胨-0.03mol/L PBS 溶液 3.3.4 中和劑：0.1%卵磷脂+1%吐溫 80 溶液； 0. 5%硫代硫酸鈉（3%過氧化氫） 3.3.5 無菌試管 3.3.6 無菌平皿(90mm) 3.3.7消毒劑：75%乙醇、1%新潔爾滅、3%甲酚皂溶液、3%的H2O23.3.8移液器及配套無菌吸頭:0-100ul，100-1000ul3.2中和劑效力確認中和劑效力及毒性試驗目的在化學消毒試驗中，達到規定消毒時間終點時，要求立即終止殘留消毒劑的繼續作用，以便準確檢測出消毒體系中殘留存活的微生物及其數量。因為消毒體系中殘留的消毒劑，可能對微生物的生長繁殖具有一定抑制作用，從而可導致對殺菌效果偏高的錯誤判斷，甚至產生假陰性結果。殘留消毒劑的去除，可排除殘留消毒劑對微生物的抑制，從而使試驗獲得正確結果。中和法是指在消毒劑與微生物作用到達規定時間的終點時，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續抑制或殺滅微生物的方法。本試驗中所使用的中和劑必須既能有效抑制消毒劑的殺菌性（中和劑的效力試驗）同時又不削弱微生物活力的恢復（中和劑的毒性試驗）。中和劑效力、毒性確認用稀釋劑將試驗菌制成51055106cfu/ml的的菌懸液備用。準備無菌試管6支，按表一試驗操作步驟表分組進行操作。各組試昝充分震蕩放置于振蕩器震蕩至少20秒或在手掌上振敲80次，然后移取Iml混合液到平皿中做平皿計數，輕輕轉動平皿以使菌落在培養基表面均勻分散開來，每組做兩皿平皿，并做好標記。平皿在層流臺下吹干，倒置于37下培養48小時后計數。具體結果見附件一中和劑中和效力評估測試記錄23表一 中和劑效力、毒性確認試驗操作步驟及結果判斷分組試驗操作試驗目的試驗結果判斷A4.5ml消毒劑+0.5ml菌懸液作用10min 取0.5ml作用液 4.5ml稀釋液試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數。觀察消毒劑對試驗菌有無殺滅或抑制能力。應無試驗菌生長或極少數菌落生長B4.5ml消毒劑+0.5ml菌懸液作用10min 取0.5ml作用液 4.5ml中和劑試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數。觀察殘留消毒液被中和后受到消毒劑作用后的試驗菌是否能恢復生長。B組菌落數比C、D、E組少，并符合下列要求：A組平均菌落數 B組平均菌落數05X(110)X+5Y(10)Y+0.5YC4.5ml中和劑+0.5ml菌懸液 作用10min取0.5ml作用液 4.5ml中和劑試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數。觀察中和劑是否抑菌。D4.5ml中和產物液+0.5ml菌懸液 作用10min取0.5ml作用液 4.5ml中和劑試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數。觀察中和產物，或未被完全中和的殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。E4.5ml稀釋液+0.5ml菌懸液 作用10min 取0.5ml作用液 4.5ml稀釋液試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數。作為菌數對照F分別吸取1ml中和劑和1ml滅菌0.9%氯化鈉溶液于平皿中做活菌計數。作陰性對照應無菌落生長備注若菌落太多不能計數，則移取1ml上述混合物，到9ml滅菌注射的生理鹽水中（稀釋10倍），充分振蕩后再移取1ml做平皿計數。試驗結果符合上述所有條件，所測中和劑才可判為合格。3.3消毒劑殺菌效率確認（定量懸浮試驗）。3.3.1 原理 將定量的細菌懸液加入消毒劑溶液中，作用一定時間。去除殘留的消毒劑影響后，以上液定量接種于營養瓊脂平板上。經培養后計算其菌落數。與未經消毒劑作用的對照菌液平板計數相比較，計算出殺菌效率。3.3.2菌懸液的制備用第三代的菌懸液按1：10用9ml的稀釋劑稀釋5次，計數培養，大約70-80之間，以獲得10-4-10-6數量級的菌懸液。將最終稀釋的10-4、10-5、10-6三個數量級，即三個稀釋梯度的菌懸液，各取2份1ml均勻接種涂布在培養基平板上進行培養計數。將涂布的6塊平板在37進行培養，7天后進行讀數，以確認稀釋濃度。3.3.3試驗方法：4.5ml消毒劑+0.5ml菌懸液，作用10min， 取0.5ml作用液 ， 加到4.5ml中和劑試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數。白色念珠菌2328培養72 h后計數，其它菌液3035培養48 h后計數。記錄每個梯度1.0ml樣品的菌落數（a1,a2），a和a1的平均值都應處于30-300CFU之間。記錄結果見附件二3.3.4陽性對照：用稀釋劑代替消毒劑，進行平行試驗，作為陽性對照。計算每一種挑戰菌種的Log下降值，并記下消毒劑的濃度和各自的接觸時間。3.3.5殺滅對數值計算 殺滅對數值（KL）對照組平均活菌濃度對數值-試驗組活菌濃度對數值3.3.6判定標準 消毒劑對挑戰菌的殺滅對數值3 判為合格。3.3.7結論根據實驗結果進行計算，如果計算結果符合接受標準，即在一定的接觸時間內，消毒劑能夠使挑戰菌水平下降99.9%（下降3個對數單位），則表明消毒劑能夠進行日常消毒使用3.4消毒劑的消毒效果現場考察消毒劑對物體表面消毒模擬現場鑒定試驗3.4.1采樣計劃匯總表試驗位置 試驗采樣時間及頻率風險分析 分裝機臺面消毒前、后，同一平面不同采樣點分別進行3次為保證消毒劑的效果，消毒前試驗應在潔凈室及設備運行之后，人員活動頻繁，設備及潔凈室墻面等最臟的時候進行消毒前的采樣。 分裝間墻面分裝間地面 3.4.2試驗操作程序 (1)隨機取物體表而（設備表面、臺面、門等），用規格板標定2塊面積各為25cm2的區塊，一供消毒前采樣，一供消毒后采樣。 (2)消毒前，將無菌棉拭于含5ml中和劑試管中沾濕，對一區塊涂抹采樣，橫豎往返各8次。采樣后，將棉拭采樣端剪入原中和劑試管內，漩渦混合儀震蕩20s或振打80次，作為消毒前樣本。 (3)將配置好的消毒劑噴霧或涂擦于物體表面，保持濕潤10分鐘進行消毒。消毒后，將無菌棉簽拭于中和劑試管中沾濕，并于試管壁上擠干后，對消毒區塊涂抹采樣，橫豎往返各8次。采樣后，以無菌操作方式將棉簽拭采樣端剪入原中和劑試管內，漩渦混合儀震蕩20s或振打80次，作為消毒組樣本。擦拭法取樣示意圖 (4)試驗結束后，將用過的同批次中和劑各1.Oml接種培養基，作為陰性對照組樣本。每份吸取1Oml，以瓊脂傾注法接種平皿，每個樣本接種2個平皿，放37恒溫箱中培養48h，觀察最終結果。 (5)計算殺滅對數值。 殺滅對數值N=lg消毒前平均菌落數 -lg消毒后平均菌落數。(6)判定標準 消毒劑殺滅對數值3 判為合格。(7)結論根據實驗結果進行計算，如果計算結果符合接受標準，即在一定的接觸時間內，消毒劑能夠使菌落數水平下降99.9%（下降3個對數單位），則表明消毒劑能夠進行日常消毒使用4 異常情況及偏差處理4.1異常情況處理程序4.1.1日常監測過程中，應嚴格按照消毒標準操作程序進行操作。4.2偏差或變更說明驗證過程中的偏差和異常必須詳細記錄和說明，并經過調查分析和處理。5. 驗證結果評價及建議質量保證部負責收集各項驗證、試驗結果記錄，根據驗證、試驗結果起草驗證報告，報驗證領導小組核對。驗證領導小組對驗證結果進行綜合評審，做出驗證結論，發放驗證證書，確認該再驗證周期。對驗證結果的評審應包括：5.1驗證試驗是否有遺漏。5.2驗證實施過程中對驗證方案有無修改，修改原因、依據以及是否經過批準。5.3驗證記錄是否完整。5.4驗證試驗結果是否符合標準要求，偏差及對偏差的說明是否合理，是否需要進一步補充試驗。6、再驗證周期6.1質量保證部根據驗證結果確定再驗證周期。6.2當環境監控的結果出現偏差時，應重新評估目前使用的消毒劑，必要時更換消毒劑的品種以及調整消毒劑的使用周期。新消毒劑使用前均需經效果驗證后方可使用。附件一中和劑中和效力評估測試記錄1.1.工作菌液為金黃色葡萄球菌時，中和劑鑒定試驗結果序號項目類型菌落計數結果（ CFU/ml）75%乙醇溶液1%新潔爾滅溶液3%甲酚皂溶液3%的過氧化氫溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液)+稀釋液2(消毒劑+工作菌液)+中和劑3中和劑+工作菌液4(消毒劑+中和劑)+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標準l 第1組無菌生長，或僅有少數試驗菌菌落生長；l 第2組菌落數比第1組菌落數多，但比第3、4、5組菌落數少；l 第3、4、5組有相似菌落數生長，其每組間菌落數是誤差率不超過15%；l 陰性對照組應無菌生長。結論符合規定111.2工作菌液大腸埃希菌為時，中和劑鑒定試驗結果序號項目類型菌落計數結果（ CFU/ml）75%乙醇溶液1%新潔爾滅溶液3%甲酚皂溶液3%的過氧化氫溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液)+稀釋液2(消毒劑+工作菌液)+中和劑3中和劑+工作菌液4(消毒劑+中和劑)+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標準l 第1組無菌生長，或僅有少數試驗菌菌落生長；l 第2組菌落數比第1組菌落數多，但比第3、4、5組菌落數少；l 第3、4、5組有相似菌落數生長，其每組間菌落數是誤差率不超過15%；l 陰性對照組應無菌生長。結論符合規定1.3工作菌液為銅綠假單胞菌 時，中和劑鑒定試驗結果序號項目類型菌落計數結果（ CFU/ml）75%乙醇溶液1%新潔爾滅溶液3%甲酚皂溶液3%的過氧化氫溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液)+稀釋液2(消毒劑+工作菌液)+中和劑3中和劑+工作菌液4(消毒劑+中和劑)+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標準l 第1組無菌生長，或僅有少數試驗菌菌落生長；l 第2組菌落數比第1組菌落數多，但比第3、4、5組菌落數少；l 第3、4、5組有相似菌落數生長，其每組間菌落數是誤差率不超過15%；l 陰性對照組應無菌生長。結論符合規定1.4工作菌液為傷寒桿菌時，中和劑鑒定試驗結果序號項目類型菌落計數結果（ CFU/ml）75%乙醇溶液1%新潔爾滅溶液3%甲酚皂溶液3%的過氧化氫溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液)+稀釋液2(消毒劑+工作菌液)+中和劑3中和劑+工作菌液4(消毒劑+中和劑)+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標準l 第1組無菌生長，或僅有少數試驗菌菌落生長；l 第2組菌落數比第1組菌落數多，但比第3、4、5組菌落數少；l 第3、4、5組有相似菌落數生長，其每組間菌落數是誤差率不超過15%；l 陰性對照組應無菌生長。結論符合規定1.5工作菌液為枯草芽孢桿菌時，中和劑鑒定試驗結果序號項目類型菌落計數結果（ CFU/ml）75%乙醇溶液1%新潔爾滅溶液3%甲酚皂溶液3%的過氧化氫溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液)+稀釋液2(消毒劑+工作菌液)+中和劑3中和劑+工作菌液4(消毒劑+中和劑)+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標準l 第1組無菌生長，或僅有少數試驗菌菌落生長；l 第2組菌落數比第1組菌落數多，但比第3、4、5組菌落數少；l 第3、4、5組有相似菌落數生長，其每組間菌落數是誤差率不超過15%；l 陰性對照組應無菌生長。結論符合規定1.6工作菌液白色念珠菌為時，中和劑鑒定試驗結果序號項目類型菌落計數結果（ CFU/ml）75%乙醇溶液1%新潔爾滅溶液3%甲酚皂溶液3%的過氧化氫溶液中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液)+稀釋液2(消毒劑+工作菌液)+中和劑3中和劑+工作菌液4(消毒劑+中和劑)+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標準l 第1組無菌生長，或僅有少數試驗菌菌落生長；l 第2組菌落數比第1組菌落數多，但比第3、4、5組菌落數少；l 第3、4、5組有相似菌落數生長，其每組間菌落數是誤差率不超過15%；l 陰性對照組應無菌生長。結論符合規定 附件二 消毒劑效力評估測試記錄2.1 消毒劑殺菌對數值菌落數記錄 挑戰細菌名稱：金黃色葡萄球菌實驗組第一次試驗第二次試驗第三次試驗消毒劑平皿1平皿2平皿1平皿2平皿1平皿275%乙醇平均菌落數殺菌對數值1%新潔爾滅平均菌落數殺菌對數值3%甲酚皂平均菌落數殺菌對數值3%過氧化氫平均菌落數殺菌對數值陽性的對照平均菌落數2.2 消毒劑殺菌對數值菌落數記錄 挑戰細菌名稱：大腸桿菌實驗組第一次試驗第二次試驗第三次試驗消毒劑平皿1平皿2平皿1平皿2平皿1平皿275%乙醇平均菌落數殺菌對數值1%新潔爾滅平均菌落數殺菌對數值3%甲酚皂平均菌落數殺菌對數值3%過氧化氫平均菌落數殺菌對數值陽性的對照平均菌落數2.3 消毒劑殺菌對數值菌落數記錄 挑戰細菌名稱：銅綠假單胞菌實驗組第一次試驗第二次試驗第三次試驗消毒劑平皿1平皿2平皿1平皿2平皿1平皿275%乙醇平均菌落數殺菌對數值1%新潔爾滅平均菌落數殺菌對數值3%甲酚皂平均菌落數殺菌對數值3%過氧化氫平均菌落數殺菌對數值陽性的對照平均菌落數2.4 消毒劑殺菌對數值菌落數記錄 挑戰細菌名稱：傷寒桿菌實驗組第一次試驗第二次試驗第三次