丁香園免疫學技術討論版 膠體金文獻翻譯活動論文集 第一輯 僅供內部交流 請勿外傳 二 OO 七年九月二十日 免疫金文獻翻譯活動參譯人員名單 免疫金文獻翻譯活動參譯人員名單 策劃 策劃 waynepionnet lzsgxl 翻譯 翻譯 20021108 backtoheart fengzhizi33 jevens lee joni keling2006 liu903 liu wei lone king lurenquan phy128 Rainlylily rapidtest ruimufang Tombacon 幾凡木木 校對 校對 waynepionnet lzsgxl Tombacon Rapidtest lone king 編輯 編輯 quatrefoil dayu1979 byd123 聲明聲明 本論文集僅供丁香園戰友內部交流學習使用 雖然我們對譯文 作了反復校對 但由于譯者水平有限 譯文中疏漏 錯誤在所難免 因此 對有爭議的地方以原文為準 也歡迎大家在論壇中討論交流您 的意見 目 錄 目 錄 綜述篇 綜述篇 1 膠體金在快速檢測中的地位 1 檢測技術開發篇 檢測技術開發篇 2 膠體金在快速檢測中當前及未來的應用 3 加工工藝 加工工藝 3 開發靈敏度高 重復性好的側向層析診斷產品 第一部分 對于老問題的新方法 21 4 開發靈敏度高 重復性好的側向層析診斷產品 第二部分 新方法帶來的新挑戰 29 5 核酸膜免疫 第三部分 共價連接及生產 38 6 膠粘劑遷移對層析檢測的影響 44 7 基于蛋白質原料的體外診斷產品的穩定性問題 54 8 濕氣處理 62 9 硝酸纖維素膜吸附蛋白的常見問題處理 第一部分 基本原理 69 法規與標準篇 法規與標準篇 10 出口管理條例 體外診斷產品的相關問題 81 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 綜述篇 膠體金在快速檢測中的地位 膠體金在快速檢測中的地位 John Chandler Tracey Gurmin and Nicola Robinson 文 rainylily 戰友 譯 聲明 本文僅供丁香園戰友內部交流使用 著作權屬原文作者 優良的穩定性 靈敏度 精確度及制造過程中的可重復性 使得膠體金適合基于膜 的檢測技術 快速膜檢測需求廣泛 可應用于諸多領域 見下表 隨著靈敏度和特異性 的提升 大量的潛在應用可能是作為替代昂貴儀器檢測方法的低成本選擇 快速檢測的應用快速檢測的應用 臨床醫用 變態反應 心梗標志物 退行性病變 藥物濫用 生殖 法醫 免疫分型 感染性疾病 血清學試驗 性傳播疾病 應激反應 毒理學 腫瘤標記 農業應用 食品安全 植物及農作物疾病 環境應用 生物學污染 環境污染 獸醫學應用 與多數人類臨床應用領域相似 這篇文章重點講述此種檢測方法中極為重要的組成部分 檢測標記物的生 產制造對整個檢測系統的性能及可靠性的影響 尤其是強調了膠體金標記物在此 檢測功能中的優勢 什么是快速檢測 什么是快速檢測 快速檢測是一種廉價的 一次性的 基于膜的檢測方法 它能提供分析物存 在于液體樣品的視覺證據 這種檢測可以以獨立的試紙條 也可以以裝在塑料盒 中的形式進行 總的來說 做此項檢測至少需要 200ul 的液體標本 可在 2 至 5 1 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 分鐘內完成 在臨床檢測中 樣品可能有尿 血液 血清 唾液或其他體液 在非臨床檢測中 樣本可能是由土壤 粉塵 植物或者食品制備的微量溶液 它們同樣可以直接應用膜試紙條檢測 這種檢測方法無需儀 器操作 可應用于臨床 實驗室 室外或者家庭 通常為 無操作經驗人員使用 快速檢測法有兩種形式 層析和滲濾 層析是最普通 的形式因為其制造及使用都比較簡易 這兩種形式所涉及的 原理雖然相同 但我們這里將要討論的是層析檢測法 一個快速檢測的底層一般是硝酸纖維素膜 在它上面固 定了檢測蛋白 通常是抗體或抗原 圖 1 連接著膜的是包含有干燥金標的金標墊 通常是玻璃 纖維 對于目前大多數可做的檢測項目 這種結合墊含有吸附了針對待檢分析 品的特異性抗體或抗原的 金粒子 樣品墊通常為紙 質 附著著結合墊 當使用 樣品墊時 液體樣品通過 毛 細擴散作用穿移過結合 墊 再水化金交聯物 使待 分析樣品與交聯物相互作 用 然后金交聯物與待分析 樣品復合物轉移至膜條帶上再移向蛋白結合物 復合物在此處被固定后以一條細 細的紅線的形式產生明顯的信號 第二條線是控制線 由余下的金交聯物形成于 膜上 表明測試完成 燒瓶中的金標液 Hugh Burden攝 courtesy BB International 圖 1 側向層析快速檢測試紙條的結構圖 顧名思義 快速檢測應在短時間內提供結果 準確的說是在幾分鐘內 這 種檢測法必須方便 精確 可靠 廉價 是一次性的而且操作簡易的 它們也必 須容易和清楚的說明書 甚至是沒有經驗的使用者也能操作 從生產廠家的觀點 來看 這種快速檢測將會帶來巨大的附加值 且容易向世界各地的使用者推廣 而無論使用者其有無此項檢測的經驗 見文后附言 快速檢測功能廣泛 改變抗體或者對條帶的化學配方作微小的變動 同樣的 設計應能用于多種檢測 2 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 為何使用金標記 為何使用金標記 早期的快速檢測使用有色膠乳形成可視信號 目前的某些檢測仍使用此手 段 過去和現在 乳膠法一直是凝集反應主要的標記方法 這是因為它在結合 成分的存在下易于凝集 對于快速檢測而言 交聯物的穩定性是避免假陽性的關 鍵 而易于凝集可能就是其產生假陽性的主要問題 因為具有更好的潛在穩定性 20 世紀 80 年代末 金標記被引入膜快速檢測 中 在適當的生產條件下 任何被精確大小的金顆粒都可以被重現性制造出來 不同的大小可用于不同的用途 其優良的穩定性 敏感性 精確性及可重復生產 性等特點使得金適合于在快速檢測中的應用 金本性屬惰性元素 被適當加工可 形成完整的球形顆粒 當正確連接時 蛋白質能牢固地結合在金顆粒表面 無論 是液態或固態都能保持長久的穩定性 而且 若是在制造過程中蛋白被精確固定 其與金交聯物的非特異性結合可被減至零 標記抗體和抗原的不同標記物優缺點的比較如表 1 所示 表 1 快速檢測中常用標記物的特征比較 特征 金 銀 碳 乳膠 燃料 酶 重復性 放大性 一步 敏感性 多重分析檢測 穩定性 結果清晰 易于制備 使用簡單 適應性 低成本 應用受限 適于部分檢測 效果顯著適于大部分檢測 膠體金的制造膠體金的制造 當膠體金被大量生產時 為保證批間重復性及避免不穩定性 成熟的工藝方 法是必須的 為獲得最終穩定敏感的產品 生產 100 升高質量的膠體金就需要極 度的細心與仔細以獲得最終穩定及高靈敏度的產品 在生產過程中的每一步都需 要使用電鏡檢查來進行質量控制 3 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 在過去的 20 年里 生產商們引進了各種不同的方法來合成膠體金 目的就是為 了獲得直徑一定且均一的單分散性的膠體 盡管所有的生產方法都是依賴于還原 HAuCl4 來形成金原子 但其物理條件還是有相當大的差異 如反應物添加的次 序 還原劑使用的多寡 以及最終生產出的膠體的質量 大小 形狀 變異系數 等 大體來說 所有的生產方法 都是使用還原劑提供電子給溶 液中帶正電荷的金離子而產生 金原子 如下所示 圖 金離子還原形成金顆粒 氯金酸 還原劑 膠體金 HAuCl4 e Au0 通常使用的還原劑包括檸 檬酸鈉 黃磷 硼氫化鈉 硫氰 酸鈉 圖 所示為不同離子水平 還原過程 在加入還原劑之前 溶液中所含為 100 金離子 曲線的縱坐標代表在加入還 原劑時金離子轉變為金原子的進程 加入還原劑之后 溶液中金原子的含量立即 出現急劇的上升 直到其達到過飽和 緊接著在一個被稱作核化的過程中發生凝 集作用 在核化位點形成由 11 個金原子構成的中央的二十面體金核心 核化位 點的形成是為了減少溶液中金原子的過度飽和 其形成極其迅速 此過程一旦完 成 溶液中剩余的金原子在遞減的能量梯度下繼續結合核化位點直到所有的原子 從溶液中移除 最初形成的核數目決定了最終將有多少顆粒形成于溶液中 而這個數目又反 過來取決于所加入的還原劑的量 還原劑越多產生的晶核越多從而產生的金顆粒 也越多 顯而易見 在一個含既定數目氯化金的溶液中 形成的核化位點的數目 越多 最終形成的每個金顆粒的尺寸就越小 因而微粒的大小可通過所加入的還 原劑的量來精細調控 如果生產條件經過優化 所有的核化位點都可以在瞬間同 時發生 使得所形成的金顆粒大小都完全一致 即單分散型 要做到這一點是 很困難的 大多數的生產方法都無法使所有金離子于瞬間同時得到還原并形成核 化位點 從而造成核化過程的不均一及多分散性膠體的產生 最終導致產品的重 4 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 復性低下 交聯物不穩定 每個膠體金粒周圍都包繞著來源于溶液中殘留陰離子的負電荷層的金顆粒 懸液構成 見圖 3 這種被稱作 zeta 電位 的電子層使得金顆粒之間相互排斥并在懸 浮液中任意分布 zeta 電位可以通過改變 周圍溶液中離子的濃度而被壓縮或擴張 圖 3 被包繞雙電子層的膠體金顆粒 高質量的膠體金和定制加工完好的交 聯物方便用于商業用途 通過從信譽度較好 的供應商購買這些成分而非試圖自己加工 大批量的金不僅可以節省生產廠家的時間 還可以減少他們的制作風險 好膠體金和不好的膠體金好膠體金和不好的膠體金 膠體金及交聯物的生產制造表面看似簡易 若掉以輕心則可導致生產出劣 質 性能差及重現性極差的產品進而影響其商業用途 將這樣的產品應用于快速 檢測中可能導致結果的低穩定性 低敏感性及低特異性 為防止這樣的結果出現 應使用透射電子顯微鏡 TEM 來評價膠體金的超細微結構 這種檢測能使生產 者對照標準比較膠體的直徑 得到顆粒球狀 顆粒不規則性和顆粒直徑的變化 如果還原過程中核化作用及形成速度沒有得到很好控制 粒子的形成就會不 均一 見圖 所見的粒子可能具有不同的大小及形狀 如橢圓形 三角形 長方形 菱形等等 這樣的粒子在與蛋白的結合過程中將無法被均勻包被 也 不能在溶液中均勻分布 最終將影響產品的顏色 敏感性 特異性及穩定性 僅 僅 5 形狀不均一的粒子都會影響測試的 結果 使其完全不具重現性 與代表著 制作精良的 40nm 的單分散性膠體粒子的 櫻桃紅色相比 由 劣質金 所形成的 信號?？梢姷降{色或紫色 雖然在檢 測系統中白色背景膜上較暗的顏色更容 易辨別 但暗示著潛在的不穩定性 而這種不穩定性更容易造成錯誤的結果 更 嚴重的是 粒子形狀及尺寸的不均一會導致蛋白包被的不均一 這樣會導致交聯 圖 4 優質膠體金與劣質 不穩定 膠體金 5 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 物長時間的積聚與凝集 儲存于溶液中的交聯物可能于幾天甚至幾個小時內就出 現這樣的變化 即使立即將交聯物干燥于固相基質上也無法完全克服這個問題 在干燥過程 中 由于粒子形狀而未穩定結合的表面蛋白很容易分離 造成假陽性及高背景 快速檢測操作過程中一個最常見的問題就是金交聯物不能以適當的速度及 完整形式從玻璃纖維結合墊上釋放 這個問題常常是因為未完全包被的金顆粒直 接暴露在玻璃纖維材料上而不能釋放 這必然意味著表面蛋白或者永久地附著在 纖維基質上或離開金顆粒自由飄浮 開始就具備包被均一的單分散性球形粒子再 加上制備完好的金交聯物 可大大減少這種危險問題的發生 盡管 TEM 檢測是決定膠體質量的唯一正確方法 但鑒定膠體或交聯物是否包 含融合的 凝集的或者不均一粒子亦或含有不同大小粒子群體的快速方法就是目 測它的顏色 優質的 40nm 診斷應用中最常使用的粒子大小 的膠體應該顯示 櫻桃紅色 如果膠體或交聯物出現紫色 很有可能說明其質量低劣且不穩定 金顆粒大小的選擇金顆粒大小的選擇 檢測信號是由金顆粒聚集于測試線或控制線而出現的信號 這些粒子必須足 夠大到能被看見 粒子的尺寸越大 這 些粒子聚集后就越容易被看見 例如1nm 直徑的粒子 無論其聚集數量多少幾乎 都是不可能被看見的 因為 1nm 的粒子 沒有更大粒子所具有的亮紅色 只有直 徑達到 20nm 的粒子才會出現可見的信 號 隨著粒子尺寸的增大 位阻現象又 成了一個問題 見圖 5 例如 如果 IgG 160 000 道爾頓 分子僅僅 8nm 長 大約 4nm 從金顆粒表面伸展開 那么 100nm 的粒子將會使這些小的表面分子顯 得更小而很難與特異性的蛋白相互作用 此外 這些粒子的尺寸越大 它們在既 定體積溶液中存在的數量越小 圖 5 因優化信號選擇金粒子的大小 這種可見度的需要與位阻現象之間的矛盾現象表明 對于大多數的免疫檢測 應用而言 最適的粒子大小是 40nm 在某些情況下當位阻現象成為較大問題時 如針對較小的抗原 20nm 的粒子則更為合適 當希望出現更深顏色或當分子 6 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 表面較低的曲率提高了抗原抗體分子間的交互作用 較大一點的粒子則更為可 取 應該由實驗決定確定多少顆粒大小能帶來高靈敏度 淺背景色和高穩定性 膠體金的制造膠體金的制造 制造者必須了解讓他們的蛋白與膠體金持久結合的物理及化學進程 具備了 這些知識之后 要進行從小批量制造到大規模生產就變得輕而易舉 而無須以犧 牲產品的敏感性 穩定性 特異性或重現性為代價了 僅僅把交聯物揉合到一起 雖然成本低廉且簡易 卻通常會導致聚集體的形成 通過 TEM 可以觀察到 每一 個聚集體都是由 4 個或更多金交聯物分子組成的群體 這種聚集體的存在通常預 示著產品的不穩定性 其性能會隨著時間而改變 雖然比較未聚集的產品剛開始 具有更高的靈敏度 但這些產品很快會出現穩定性和特異性的問題 一種好的交聯物表現為蛋白吸附于金的表面上 與膠乳不同的是 蛋白是被 動地吸附于交聯物表面 因而不會出現共價結合 然而 由于某些小分子與金表 面沒有足夠的結合位點 像激素 藥物及其他小分子 10KD 在被動交聯之前 必須先結合到大分子載體上 多為 BSA 在任何情況下 位阻現象都會阻礙小分 子升至 zeta 電位 載體應該是惰性的 這樣就不會影響檢測蛋白質的活性 抗體的 Fc 片段緊緊吸附在金顆粒表面上 這樣圍繞著金顆粒的雙電子層表 面的 Fab 片段就突出在外面 這樣 Fab 就能吸附分析物 見圖 6 膠體金上標 記抗體時 不能有過量的待標記抗體存在 因為過量的游離的抗體會跟膠體金上 的抗體與抗原發生競爭反應 導致出現假陰性 而且過量的抗體蛋白會影響到標 記物的穩定性 蛋白質和膠體金結合的最佳條件在蛋白質的等電點附近 蛋白通過以下機制于幾秒之 內吸附于金表面 金粒子所帶負電荷與蛋 白內氨基酸 如賴氨酸 所帶陽性電荷的最初的 相互吸引 蛋白通過某些氨基酸殘 基包括色氨酸與金粒子 表面之間的疏水吸附作用 圖 6 抗體與金粒子的結合力 7 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 蛋白中的半胱氨酸的硫基與金粒子間的配價結合 交聯物的穩定交聯物的穩定 隨著特異蛋白的結合 交聯物必須用適當的試劑進行穩定 通常使用 BSA 明膠 PEG 聚乙二醇 或酪蛋白 使用穩定劑有雙重功能 一是它可通過封閉 膠體表面未和特異性蛋白結合的位點而減少了非特異性反應 二是它可有助于更 穩定的懸液的形成 一旦結合 金即被調整至預期的濃度 并混懸于相應的緩沖液中 這種緩沖 液應可使液體交聯物穩定 商業生產者常會使用低摩爾濃度緩沖液以使得工業客 戶能簡單重懸交聯物于自己所選的緩沖液中 總的來說 最終的儲存緩沖液不應 含有高鹽緩沖液和表面活性劑 因為它們有可能通過水解或置換抗體造成損傷 含有硫基或汞的防腐劑會造成交聯物的完全毀壞 膠體金最常用的防腐劑為 0 1 疊氮化合物 專業制作出的膠體金的儲藏幾乎是無限期的 通過計算有多少結合劑可吸附 到金粒子的表面 可能會減少批間差 其形成的交聯物比單獨的抗體可更長久的 儲存 恰當干燥于固相組分的金標蛋白則可保存數年之久 膠體金的大規模制造膠體金的大規模制造 盡管已經有技術及科學的資料來描述出簡單的小量膠體金和交聯物的生產 過程 但應用于大批量商業生產 譬如 100 升的量 時的方法仍舊存在著所有權 的問題 假設從氯金酸至膠體金的還原過程必須于微秒之內完成 那么 100 升或 更大量產品的生產則需要非常精細的技術而不是僅僅遵循著小量產品生產的同 一原則 由于這些技術僅僅為用于商業生產的金交聯物企業中的專家所熟知 所以大 多數生產者不會試圖在企業內部選擇這種艱巨的任務生產大批量的膠體金 相 反 快速檢測試劑的生產商會與膠體金專家合作 籍此來減少費用的成本和失敗 的危險 同時也可以使得他們的產品盡快走向市場 這樣的合作安排通常由生產商進行內部的實驗開始 這些實驗使用小量商業 用途的膠體來決定何種抗體最適于其應用 隨后 一些企業內部進行更大量的膠 體交聯實驗來決定按比例放大 10 倍或 100 倍的產品是否能生產出相同質量的交 聯物 在提高溫度和應用不同緩沖液以及干燥狀態下進行此階段的嚴格的金交聯 8 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 物穩定性實驗操作是尤其重要的 質量控制應包括使用 TEM 檢查有關聚集產生的 情況 光密度 敏感性及特異性 在進行大批量快速檢測產品的生產之前 多批 次地進行這種大量的實驗來決定生產的重現性是很有必要的 定量的可能性定量的可能性 大多數的快速檢測只是定性的 只能用于檢測臨床樣本中是否含有超過檢測 濃度的特定生物成分存在 然而 有許多的檢測則需要一種定量的元素 例如監 控臨床指標的變化或確定特定分析物的相對或絕對濃度 這樣的檢測包括三種形式 第一種形式是 當進行測試時 許多內在的信號 可出現測試結果在視覺上的對比 這種測試僅僅能提供半定量的結果 結果可分 為陰性 弱陽性 中陽性和強陽性 第二種類型 檢測線的反應劑設計成只能結 合已知一定量的分析物 任何過量的分析物將會和下一條檢測線結合 產生一個 溫度計式的條帶梯度 在第三種測試類型中 測試樣品所產生的信號由一個小型的 便攜式的分析 儀讀取 并由分析儀將有色的測試線轉換為數字信號 許多這樣一般的條帶測試 讀取儀將于近期應用于商業用途 金標記尤其適合于這種定量或半定量的測試 因為測試產生的信號既精確又 具有高度可重復性 大多數的信號是利用光電二極管通過反射標定的刻度尺產生 數字 精確度取決于可被讀取得測試結果的準確程度以及測試條帶產生的可重現 性信號的可靠程度 由于金標記的精確度 相對于許多其他類型的標記 其可產 生的可重現性信號具備更高的可靠性 金標信號的銀增強作用金標信號的銀增強作用 無論以層析還是滲濾模的形式 快速檢測法通常都可提供與 ELISA 試劑盒相 似或更高的敏感性 對大多數的待分析物而言 檢測水平達到 1ng ml 或更小的 量是可能的 然而 也有許多待分析物對這種直接標記系統無法達到足夠的敏感 度 要用肉眼在清晰背景的白色膜條上發現金產生的信號 其敏感度則要受到使 用者能力的局限 使用光反射技術的定量方法常常無法達到人類肉眼視覺更大的 敏感性 使用銀來增強金標記強度是一種有價值和前途的技術 它可獲得增加 100 倍的檢測敏感性 用這種方法將銀溶液應用到測試線 來源于金標記的初期 9 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 信號 有時候是肉眼可見的 即可被增強 在應用較小粒子 約 5nm 的金交聯 物的位置 使用這種間接方法可獲得更大的總體敏感性 通過在一步測試法中摻 入銀試劑就有可能無需任何其它步驟就使信號得到增強 這樣液體樣品的應用便 能推進整個反應的進程 見圖 7 所有的反應物 包括金交聯物及增強劑銀鹽 都被干燥于測試條帶上僅 由樣品溶開 這種間接的增強技術 有望在 pg ml 的范圍內對 待分析物進行檢測 被干燥 后的反應物是穩定的并有 可能在聚集之前被引入測 試裝置中 由于敏感性的增強 比目前用于直接標記的測試系統中更小量的樣品 也可被檢測出 鑒于銀的增強效果 使得為從前的交聯檢測法無法檢測出的待分 析物而研究開發出基于金的一步檢測法成為可能 圖 7 層析快速檢測中銀對金標 附言附言 快速測試要求快速測試要求 基于膜上的快速檢測法可廣泛的應用于臨床 雖然在臨床環境中大多數檢測是 由專業的醫療保健人士操作 但越來越多的檢測方法被批準由相對無經驗的家庭使 用者操作使用 為創造可成功應用于這個特殊市場的快速檢測法 生產商必須為這 些有或無經驗的使用者周全考慮 除此之外 生產商為了獲得加工處理的效率而控 制成本必須有自己的一套需求 以下是目前快速檢測產生的關鍵要求 操作簡易操作簡易 或許操作上的簡易是使得快速檢測在商業上可行的最重要特色 一般而 言 這種檢測都是應用多功能且簡單的生化技術而無需或僅需極小的操作經驗即可 完成的 面向使用者 提高操作性簡易性的特色包括一步操作法及測試結果易識別 的特色 樣品量小樣品量小 臨床醫生和家庭使用者都鐘愛測試中僅需極少量樣品這一點 此特色具 有眾多優點 收集樣品時無需較多經驗 通常操作速度較快 給患者造成的潛在傷 害及疼痛也會較少 同時還能減少浪費 10 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 快速快速 快速檢測正因這一點而得名 在許多臨床檢測應用中會使用到快速檢測 速 度是其根本 根據臨床醫生需求 這種檢測的理想目標就是在 3 分鐘內提供結果 而許多快速檢測都可滿足這種要求 靈活靈活 對大多數的檢測而言 若要滿足臨床醫生需要即時出結果就可能要以犧牲檢 測結果的質量為代價 對生產商而言 應為快速檢測選擇那些可獲得定性 半定量 或者定量結果而無需大幅置換基底物或反應物的理想的原材料 臨床應用臨床應用 要使得快速檢能在臨床環境中得到廣泛應用 它取得的結果必須可與臨 床實驗室儀器檢測所提供的相媲美 快速檢測的理想特征包括高敏感性 的假陰 性 高特異性 的假陽性 及長期穩定性 12 個月以上 結合良好的檢測設 計 既有助于減少金交聯物的應用時產生的假陽性和假陰性 又能增加測試 交聯 物 的長期穩定性 商業用途的金交聯物可達到長達 個月的穩定性 可靠性可靠性 快速檢測的發展造就了大量多樣化的測試片或試劑盒式檢測模式的產生 適用的環境范圍從緊急車輛到家庭環境不等 快速檢測除了對物理條件不能苛刻 外 更要求其能提供變異系數在 5 或更小范圍內的可靠結果 若嚴格地控制生產 條件 金交聯物將有助于通過最小化批量生產中的變異提升測試的可靠性 低廉低廉 欲用于臨床檢測的快速檢測遭到同臨床實驗室檢測一樣全面降價的定價壓 力 欲用于家庭使用的快速檢測又遭到同其他廠商相同產品的價格競爭 面對這兩 種情形 廠家必須面對每種測試結果都達到低成本的市場需求 高附加值高附加值 為了能在以低價出售的一次性快速檢測中獲利 生產商必須不斷生產以 降低產品成本 理想的測試應使用易獲取的高質量的原材料 部件易于大量組裝 這樣才能達到原料及勞動力成本均低廉 要取得這種平衡 原料和試劑則適于使用 比手工操作優勢大得多的自動加工處理 商業接受度商業接受度 無論是由臨床中受過訓練的專業醫療人士還是毫無經驗的家庭使用 者使用 快速檢測的設計必須關注消費者的可接受度 相比令操作者毫不費力操作 的產品 令人棘手的儲存及操作形式 難以識別的顏色都是產品難在商業上取得成 功的弊端 11 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 結語結語 當乳膠普遍用于結合物時 快速檢測從 20 世紀 80 年代中期開始沒有太大的 變化 但自那以后 由于在大量快速檢測法設計中對更高敏感性 可靠性及重現 性要求的增加使得金作為交聯物的首選 制作精良的金試劑無論以液體還是干燥形式存在都具有極大的穩定性 如果 繼續有對基于金的快速檢測有更大敏感性和特異性的需求 唯有對膠體金的生產 和使用進行嚴格的操作才有可能取得成功 參考文獻參考文獻 1 J Chandler Assay device and method 96901447 1 European patent application British Biocell International 2 John Chandler PhD is the managing director and Tracey Gurmin and Nicola Robinson are part of the custom consultancy team at BBInternational Cardiff Wales UK 12 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 檢測技術開發篇 膠體金在快速檢測中當前及未來的應用 膠體金在快速檢測中當前及未來的應用 James Carney Helen Braven Joanna Seal and Emma Whitworth 文 Rainylily 戰友 譯 聲明 本文僅供丁香園戰友內部交流使用 著作權屬原文作者 在過去的 5 年中 應用金顆粒及層析的檢測法日益確立了其在床旁檢測中的 地位 針對不同分析物的簡易層析檢測法的出現簡化并 加速了檢測體系 也對諸多企業產生重大影響 例如 可以在臨床問診過程中利用病人的一滴血液 尿液或者 唾液做出精確的診斷結果 這樣當病人仍在場時就可以 立即開始治療了 同樣地 食品生產公司可以在食品加 工的不同階段運用質控檢測而無需專門的實驗室人員也 無需中斷生產加工過程 另外 層析檢測還可應用于獸 醫行醫 食品貯藏和環境監測等領域 而無需專門德操 作設備和培訓以及結果的闡釋 再加上反應的快速 使得層析成為一種理想的自 我檢測手段 用于制作膠體金的溶液成分 穩定性 靈敏度及大批量重復性使得膠體金成為快速檢測中一種理想的檢 測標記物 但它的應用并不僅僅局限于層析檢測 用于制造層析檢測的材質在不斷改進 也伴隨著試驗設計的不斷改善 這些 進步使得更多可產生定量結果的層析檢測使用量的需求有所增加 隨著數十億元 全球性的體外診斷檢驗市場的不斷增加 這些促進因素同樣可以導致快速檢測手 段的多樣化和實驗室分析的便利 這篇文章討論了這種多樣化的起因 并概括了 一些膠體金可適用于各種診斷應用的特性 膠體金在層析檢測中的使用膠體金在層析檢測中的使用 層析檢測常采用兩種顆粒 染色乳膠和膠體金 許多最近開發的層析檢測 包括 Phadia AB 公司 瑞典 Uppsala 的 Immunocap Rapid 快速試驗和 Merck KgGA 公司 德國 Darmstadt 為檢測食源性病原體開發的Singlepath和Duopath試驗 都選用納米金作為標記物 13 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 顆粒大小顆粒大小 用于層析檢測中納米金顆粒要比膠乳顆粒小 用于檢測中硝酸 纖維素膜的孔徑為 8 10 微米 可一次容納大量納米顆粒 這種檢測形式的敏感 性取決于顆粒和被分析物在沿著膜向吸附線移動時的混合程度 見圖 1 而另 一個重要的因素就是小顆粒在吸附線上緊密堆集從而更易識辨 IDV 制造商必須從聲譽良好的供應商處購買膠體金以確保滿足嚴格的質控標 準使得顆粒的大小和尺寸均一 這些也是保持診斷產品能自由凝集及穩定儲存的 主要因素 膠體金是一種均質的顆粒溶液 顆粒具有均一的表面積和電荷 滿足 了蛋白附著的兩個主要標準 顆粒大小范圍顆粒大小范圍 用于層析檢 測的膠體金顆粒的大小范圍為 5 200nm 顆粒尺寸的范圍使得其 可應用于不同領域 較小的顆粒 可應用于生命科學領域 為了利用層析檢測應用中大 顆粒的強可識辨特征 顆粒的均 一性是關鍵的 優質的膠體金顆 粒必須是單分散性的 球形的 而且形狀不均一的粒子數應少于 5 其他規格的膠體金會使得實驗結果不佳 并造成時間和資源的浪費 而優質的膠體金每升可以產生更多的實驗結果 圖 1 層析快速檢測示意圖 可辨識性可辨識性 范圍在 20 120nm 的膠體金可散發綠光因而可出現鮮紅色 即使 顆粒小于透射光波長由于表面等離子共振作用它仍可以發光 被散發出的可視光 波長因顆粒尺寸的大小而異 蛋白結蛋白結 不同于用于膠乳中的共價結合 蛋白質如抗體是被動結合于膠體金 上的 這種結合是一種相對簡單的過程無需使用其他試劑 有三種常用的金顆粒 結合模式存在 標準的膠體金顆粒被一層負電離子包被著 在離子結合過程中 所有蛋白質 上的正離子可以牢牢結合在顆粒的表面 當使用檸檬酸制作金顆粒時 顆粒會與 氨基酸如賴氨酸結合 14 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 具有高度疏水性的氨基酸 如酪氨酸和色氨酸 通過疏水作用結合到金等顆 粒的表面 對于疏水性氨基酸含量很高的蛋白質 如免疫球蛋白 來說 疏水結合 起著重要的作用 這也是結合顆粒長時間接觸含有洗滌劑的緩沖液后反應性降低 的原因 金硫鍵是由金和硫共用一個電子對而形成的牢固連接 金微粒與蛋白內的半 胱氨酸殘基的連接可能是吸附于顆粒上抗體或抗原的最重要部分 因此 應避免 使用硫柳汞等含硫緩沖液或防腐劑 可調控性可調控性 經過嚴格的質控程序可持續生產出尺寸符合要求的均一圓形膠 體金顆粒 多年的發展經驗已經消除了批量生產中的變異因素及大批量供應的難 題 如圖 膠體金的連接方式簡單 僅僅涉及到蛋白 稀釋液及微粒而無需 反應劑 根據規定的原材料 生產者可以計 算出每粒膠體金所需要的能做出最佳檢測結果的精 確的抗體數量 從而節約成本減少原材料的浪費 層析檢測中原材料的改進層析檢測中原材料的改進 用于層析檢測的原 材料質量的改進已經提高了檢測的性能 顆粒顆粒 工藝上的改進可以不斷生產出大量大尺 寸 圓形膠體金顆粒 可作為市場上 多種標記物 40nm 大小的顆粒被認為是最適于層析檢測的 這種大小的尺寸既 足夠大到易于識辨又足夠小到不會對蛋白結合到膠體金表面產生空間位阻從而 優化標記原材料的性能 隨著顆粒尺寸的增加 其辨識性也有所增加 最初的研 究表明 應用 60nm 的膠體金可以增加某些檢測中末端信號的辨識性 從而有可 能提高測試的敏感性 圖 2 優質的圓形納米金變異系數 低 形態一致 具有最佳的抗體吸 附力和靈敏度 硝酸纖維素膜 硝酸纖維素膜 這種硝 酸纖維素膜的一個重要特征 就是其孔徑的大小可以控制 蛋白結合的有效表面積及樣 品通過測試條帶的毛細管流 速 劣質膠體金易于聚集 不 能自由通過纖維素膜 因而膠 體金顆粒的大小必須均一 IDV 制造商還必須保證膠體金尺寸的規格 尺寸分布 圖 3 尺寸分布對比數據表明標記 40 nm 的膠體金平均直 徑達 143nm 15 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 比較顯示 生產粗劣的膠體金標記為 40nm 可能包含不同尺寸的顆粒 其平均 直徑可以達到 143nm 而導致錯誤的結果 如圖 新型硝酸纖維素膜被制成 可濕水的 不影響蛋白質吸收和測試功能 利用表面活性劑和某些阻滯劑進行產 品的后期處理可提高顆粒的流動性 消除測試組份間的非特異性相互作用 樣本墊樣本墊 樣本墊可以被化學藥品浸漬減少樣品成分差異 提高檢測靈敏度 去污劑 增稠劑 阻滯劑和鹽通?？梢越浉稍锖蠹尤霕颖緣| 此工藝可以避免使 用復雜的顯影 追蹤緩沖液 實現真正的一步檢測 其他膜其他膜 如今的血液分離膜可以有效地分離靜脈或毛細血管中未溶血的血紅 細胞及血漿 直流膜和測流膜均已上市 可以分離 10 110ml 全血樣品 這樣可 以對血清或血漿進行直接檢測而無需進行樣品處理和 離心 核苷酸層析檢測核苷酸層析檢測 層析檢測法已經發展至可以用多 種形式檢測核苷酸 該測 法可以檢測出如聚合酶鏈反應 PCR 及結螺旋霉依賴 性擴增等擴增技術的產物 結螺旋霉依賴性擴增是一 種類似于 PCR 的等溫擴增法 其 DNA 鏈的分離是通過 酶作用而不是加熱來完成 這些技術無需昂貴的設備就可以進行檢測 圖4 劣質40nm膠體金形態非圓 形 不均一 易聚集 顆粒間變 異系數高 非序列特異性檢測非序列特異性檢測 這是一種以層析形式并應用抗體或半抗原標記的核苷酸檢測核苷酸分析物 的存在或缺失 應用這種檢測方法 兩種半抗原 DNP 和生物素 通過與 固定于 層析帶上的 抗 DNP 抗體和 結 合于納米金顆粒上的 抗生物素 抗體結合捕獲并檢測分析物 半 抗原具有在高溫下穩定的 圖 5 a 作為PCR擴增引物 檢測雙鏈PCR或tHDA產物 b 以 固定的吸附抗體 抗體 膠體金結合物及半抗原標記的序列特 異性寡核苷酸探針 檢測未標記的單鏈核酸靶標 c 使用固 定的寡核苷酸吸附探針和寡核苷酸結合膠體金 進行無抗體檢 測 優勢 并且不會影響核苷酸 修飾酶的活性 半抗原還可以通 過商業方式獲得合成的寡核苷 酸 該方法適合于使用生物素和 DNP 標記的試劑檢測雙鏈擴增產 物 如圖 5a 序列特異檢測 序列特異檢測 許多分子診斷應用需要應用序列特異性檢測 這種檢測法可 16 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 以了解核苷酸分析物的序列從而區別于其他分析物和非特異性擴增產物 通過使 用寡核苷酸探針與目的序列的退火復性完成序列的特異性 有多種方法可以確保 信號的產生是依賴于通過使用探針固定靶標或者通過標記納米金的探針 靶標退 火來實現 如圖 5b 和 5c 無抗體核苷酸層無抗體核苷酸層 無需抗 體的檢測系統可以減少成本并 增加檢測的重復性 靈敏度及 特異性 無抗體的核苷酸層析 檢測系統是基于通過固定寡核 苷酸探針的靶標捕獲和通過直 接結合到納米金的探針的檢測 如圖 5c 序列特異性寡核 苷酸探針可以利用斑點印記檢 測法原理類似的方法固定于層 析條帶上 捕獲探針的靈敏度和特異性與使用抗體的方法相當 并且在多重分析 如在每個條帶上使用多條吸附線 方面有明顯的優勢 如圖 6 人們使用多 種技術開發將核苷酸結合到納米金的方法以得到穩定堅固的結合物 圖 6 以固定的寡核苷酸吸附探針和寡核苷酸 膠體金結合物檢測 多核苷酸序列 檢測不同序列的固定探針在硝酸纖維素膜上形成 測試條 含有各個序列的核酸物吸附在各個位置 然后以另一與 膠體金結合的探針進行檢測 產生一組譜線 膠體金的其他應用膠體金的其他應用 膠體金在那些需要儀器辨別最終結果的快速檢測中同樣 有效 這些檢測利用的是膠體金的光散射特性 盡管 20 120nm 的膠體金比可見 光波長小 但由于具有表面等離子共振特性其在光散射方面仍有效 表面等離子 共振是特定波長的投射光和存在于納米金中傳導電子交互作用的結果 光散射的 強度取決于投射光的波長和粒子的大小 這種表面等離子共振特性可以作為檢測 用于標記的粒子的方法而被開發 由于其具有的表面等離子共振特性 膠體金還可用作微陳列中的熒光標記替 代物 與熒光標記測定相比 利用共振光散射檢測納米金顆粒測定細菌 RNA 靈 敏度要高 50 倍 使用金顆粒還有一個優點 它不會發生光致漂白 光散射的強度和最大波長與納米金顆粒的大小成正相關 通過混合不同直徑 的膠體金顆粒 選擇出不同的顆粒用于不同的分析物 將可能開發出多重檢測法 若再加上對不同尺寸粒子等離子共振峰加以區分的話 這樣就可以擴大應用于層 析或者其他檢測形式的測試范圍 17 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 納米金顆粒的使用使得 Pointcare Technologies 公司 美國麻省 Marlborough 應用簡化電流細胞計數原理開發出一種 CD4 檢測法 這種開發的檢 測法免除了各種不同的熒光標記和錯綜復雜的檢測衡量手段 這種 CD4 淋巴細胞 計數法使用可特異性結合到這些淋巴細胞表面的膠體金抗 CD4 抗體結合物 它可 以在特定的方向散發出光從而區別于其他類型的細胞 例如表達 CD4 的單核細 胞 這種簡易 小巧 輕便的細胞計數設備還可以計數白細胞和淋巴細胞 它還 可以用來監測 HIV 和 AIDS 病人的療效 膠體金在光散射診斷中的應用膠體金在光散射診斷中的應用 人們對開發涉及到膠體金和納米銀的其他光散射技術一直有著濃厚的興趣 表面強化拉曼光譜技術 SERS 中的目前已應用于多種領域 納米金在 SERS 檢測 方面的應用也日益廣泛尤其是在生物分析領域 拉曼光譜技術 SERS 方法 拉曼光譜技術 SERS 方法 拉曼散射指的是對投射光在不同波長處的光散 射 由于每一種物質都有其獨特的拉曼光譜 使得 SERS 成為一項極好的鑒別工 具 然而 拉曼信號也有其特有的弱點 約 107 個入射光子中就有 1 個在出現 散射時波長偏差 這些信號可以通過兩種方式來增強 其中一種方法是共振拉曼 散射 即將激光調至檢測物質的吸收波長 另一種方法就是 SERS 它要求檢測 物質緊密靠近金屬 金或銀納米顆粒 的表面 等離子共振特性可使信號增強放大 至 105 106 倍 將兩種方法融合后即稱作表面強化共振拉曼散射技術 surface enhanced resonance Raman scattering 它是一種十分靈敏的技術 可將信號放大 1014 倍 并能夠進行單個分子的檢測 應用納米金屬作為 SERS 基質 應用納米金屬作為 SERS 基質 膠體金和納米銀的光學特性使得它們成為 SERS 檢測的良好表面和基質 納米金屬適于液相檢測 并且在現有的多種生物 檢測領域應用廣泛 顆粒的大小 形態 間隙等因素對信號的增強非常關鍵 因 而必須使用優質顆粒 開發一種穩定的檢測系統依賴于優質納米顆粒生產出的能 與生物分子相互作用的穩定產物 生產出球形顆粒的替代物 如三角形或桿狀 與未來 SERS 的應用密切相關 并有利于其應用 SERS 標簽 SERS 標簽 盡管 SERS 可用于無標簽檢測 但某些情況下 也需要在檢測系 統中引入一個 SERS 活性標記或報告基團 從而產生出強大的 易于檢測的特征 18 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 性拉曼信號 每個樣本 可以檢測不同的標記物 而且 SERS 光譜特征在多重分析方 面比熒光技術潛能更大 該標 記可以只需將部分納米顆粒 例如 Nanoplex Technologies 公司 美國加州 Mountain View 生產的 SERS 納米標記 物 包括一個包被著一層 SERS 活性標記分子和玻璃的金屬 納米顆粒 這些顆粒可以代替傳統的基于顆粒的檢測以及具有金屬標記復合物的 定量 SERS 檢測 用于聯合 SERS 檢測和免疫測定形式的診斷領域 如圖 7 圖 7 在免疫夾心測定法中通過檢測結合在金屬納米顆粒上的 SERS 活性標記物運用 SERS 方法 均相測定均相測定 類似于 SERS 的檢測方法也可以應用于分子診斷領域 由于核酸 可以用多種可購買到的熒光基團標記 這種標記無需被引入為納米顆粒的一部 分 但相反卻可以用來標記核酸分析物 例如 將一個寡核苷酸吸附探針固定于 金屬表面 與標記的靶 DNA 一起 退火反應 將染料引至金屬表 面 造成熒光淬滅 產生 SERS 信號 如圖 8 此外 應用結 合納米基質和染料標記的分析 物具有均相檢測形式的優勢 通 過控制膠體銀的凝集 以氨基酸 基團和熒光基團修飾的核苷酸 已被應用于 DNA 的定量檢測 通 過擴增阻礙突變系統等位基因 特異 PCR 多重檢測 明確樣本的基因類型 尤其具有臨床診斷價值 圖 8 SERS 法檢測熒光標記的核甘酸退火靶標通過巰基基團結合 到金屬的表面 結論結論 由于其能滿足快速檢測中靈敏度 穩定性 可靠性的增加需求 優質的成品 膠體金依然是快速檢測發展和生產中的常用標記 膠體金的尺寸范圍使得其在多 19 丁香園免疫學技術討論版 IVDT 翻譯活動文獻集 第一輯 種領域中具有廣泛的用途 如果生產得當 它可以帶來精確 穩定的結果 產生 成本效益和可靠的快速檢測 可運用多種方法來開發膠體金在快速檢測中的應 用 甚至可以加速新的應用領域的開發 由于市場對更加精密和使用簡易的快速 檢測法的需求 加上診斷工具需要和特定治療相配合 因此膠體金的多功能性將 有助于促進未來快速測定的開發 展望未來 隨著目前基質開發和新的標記物的設計合成等領域研究的深入 SERS 作為一種檢測手段將受到更多的關注 同時 與此相匹配的儀器設備的發 展將會增加其在診斷領域的實用性 金納米顆粒在 SERS 這個新的應用領域中會 發揮更大的作用 參考文獻 參考文獻 1 J Alter One Step Separation of Plasma from Whole Blood for In Vitro Diagnostics Genetic Engineering News 16 no 5 1996 28 2 J Alter Single Step Vertical Plasma Separation of Whole Blood for Tests and Sample Prep Genetic Engineering News 16 no 20 1996 30 3 M Vincent X Yan and H Kong Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification EMBO Reports 5 no 8 2004 795 800 4 P Francois et al Comparison of Fluorescence and Resonance Light Scattering for Highly Sensitive Microarray Detection of Bacterial Pathogens Journal of Microbiological Methods 55 no 3 2003 755 762 5 CL Haynes et al Surface Enhanced Raman Spectroscopy Analytical Chemistry 77 no 17 2005 338A 6 LR Allain and T Vo Dinh Surface Enhanced Raman Scattering Detection of the Breast Cancer Susceptibility Gene BRCA1 Using a Silver Coated Microarray Platform Analytica Chimica Acta 469 no 1 2002 149 154 7 K Faulds et al Quantitative Detection of Dye Labelled DNA Using Surface Enhanced Resonance Raman Scattering SERRS from Silver Nanoparticles Talanta 67 2005 667 671 從左至右 James Carney博士 技術總監 Helen Braven博士 核酸研究的主要科學家 Joanna Seal博士 核酸研究小組 的主要項目負責人 Emma Whitworth博士 研發部的主要科學家 他們都工作于英國biocell國際公司 位于英國加地夫 聯系方式分別為 jimcarney britishbiocell co uk helenbraven britishbiocell