ELISA試劑的選用和質檢 衛生部臨床檢驗中心王露楠 影響試劑盒質量的因素試劑盒的選用試劑盒的質檢方法目前試劑盒存在的問題 影響試劑盒質量的因素 1 原材料 1 固相材料商品ELISA試劑盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板 其對ELISA試劑盒的影響在于孔間的顯色差異 2 抗原 自然抗原 合成抗原和基因重組抗原 純度 純度不高可致試劑盒的特異性不強 立體結構 合成抗原一般都是多肽抗原 缺乏完整抗原所具有的立體結構決定簇 用于相應的抗HCV和抗HIV抗體的檢測有可能導致結合上述決定簇的抗體漏檢 影響試劑盒質量的因素 3 抗體多克隆抗體 多抗 制備簡單 含針對抗原的多種決定簇 但抗體的親和力和特異性相對要低于單抗 且每次制備的抗體在其親和力和特異性上均有區別 單克隆抗體 單抗 可無限大量的得到針對單一決定簇的抗體 缺點是結合的單一性 當建立雙抗夾心ELISA測定方法時 如包被和指示抗體使用同一單抗 則由于結合位點的缺乏 很容易造成假陰性結果 尤其是在使用一步法時 鉤狀 效應 Hookeffect 的出現 因此 在使用單抗建立雙抗夾心ELISA方法時 包被和指示抗體常使用針對抗原的不同決定簇的單抗 包被抗體可為混合單抗 從而使得固相抗體在免疫測定中能更為完全地結合待測物中的特異抗原 影響試劑盒質量的因素 4 酶結合物ELISA試劑盒的核心部分 通常ELISA試劑盒的有效使用期限即是根據酶結合物的穩定性而定的 辣根過氧化物酶 HRP 易于提取 價格相對低廉 性質穩定 耐熱及有機溶劑的作用 與抗原或抗體偶聯后 活性很少受損失 堿性磷酸酶 ALP 堿性磷酸酶用于ELISA必須注意的是含磷酸鹽的緩沖液對其酶活性的抑制作用F半乳糖甘酶 影響試劑盒質量的因素 5 色原底物 HRP最常用的色原底物有鄰苯二胺 OPD 和四甲基聯苯胺 TMB 鄰苯二胺 OPD OPD被認為是HRP最為敏感的色原底物之一 當pH值降為1 0時 最大吸收波長為492nm 顯色加深 因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應 OPD的缺點是其對機體具有致突變作用 四甲基聯苯胺 TMB 氧化產物聯苯醌在波長450nm處有最大消光系數 試劑盒中常為已配好的A B兩種液態試劑 即一定濃度雙氧水溶液和TMB 它們在溶液中相對不穩定 因此在使用ELISA試劑盒時 如底物A 或 和B出現顏色 或各取一滴混合后顯色 說明該試劑盒的底物溶液已變質或已受污染 必須廢棄 影響試劑盒質量的因素 2 試劑盒的方法學設計雙抗原夾心法測抗體 抗HIV Tp 影響試劑盒質量的因素 間接法測抗體 抗HCV Tp 影響試劑盒質量的因素 雙抗體夾心法測抗原 兩步法 影響試劑盒質量的因素 雙抗體夾心法測抗原 一步法 影響試劑盒質量的因素 3 試劑盒的運輸和貯存ELISA試劑盒的效期一般為6個月 這是指在貯存溫度為2 8 C的情況下 但一個試劑盒從出廠至用戶手中 均要經歷運輸 如送檢 檢定 發貨等 及運輸中的貯存 某一環節的不當 均會影響試劑盒的臨床使用質量 試劑盒的選用 1 根據可能影響試劑盒質量的因素 從以下幾個方面來判斷該試劑盒是否符合我們的要求效期固相材料的來源包被抗體或抗原的性質 單抗 多抗或合成多肽或重組多肽 顯色底物 是TMB還是OPD 測定模式 一步法或二步法 試劑盒的選用 2 同行對有關試劑盒的使用效果個別的使用效果在實際工作中 其它實驗室對某種試劑盒的實際使用效果 往往具有很強的說服力 綜合的使用評價對一種試劑盒的綜合使用評價 是指多個實驗室對這種試盒實際應用效果的綜合分析 ELISA試劑盒的質檢 1 包裝 儲存狀態內外包裝 效期 試劑瓶是否漏液 真空包裝是否破損 試劑是否齊全等等2 采用血清盤 panel 質檢血清盤由一定數量的陰 陽性樣本組成 可用來判斷試劑盒的靈敏度 特異性和符合率 如HBsAg 抗HCV和抗HIV等血清盤 ELISA試劑盒的質檢 ELISA試劑盒的質檢 HBsAg ELISA試劑盒的質檢 抗HCV ELISA試劑盒的質檢 TP ELISA試劑盒的質檢 3 采用弱陽性定值質控血清進行質檢對不同廠家或同一廠家不同批號試劑盒采用同一弱陽性定值質控血清檢測 可比較出不同廠家或不同批號試劑盒的檢測靈敏度 測定下限 的差異 對判斷試劑盒的質量及其穩定性具有重要的參考價值 檢驗結果的正確與否 是試劑盒質量 人員素質 儀器設備狀態和室內質控措施等的綜合反應 任何一個環節出現問題 都會導致檢測的失敗 目前試劑盒存在的問題 抗HCV 目前試劑盒存在的問題 抗HCV 試劑的不足之處1 主要是在低危人群中仍發現大量的不確定和假陽性結果 再則仍有較長的 窗口期 2 核心區抗原的減少程度把握不好的話 有可能會導致漏檢的發生 3 由于這些試劑所使用HCV抗原只是病毒的部份重組多蛋白或合成肽抗原 加之 固相對這些蛋白或多肽的吸附能力的局限性 使得固相上能捕獲抗體的抗原決定基的數量有限 從而影響測定的敏感性 目前試劑盒存在的問題 抗HCV 兩家試劑檢測結果不一致1 不同試劑廠家的ELISA試劑盒所用包被抗原的差異 目前抗HCV檢測ELISA試劑盒均采用HCV的基因工程或合成多肽抗原 核心區 NS3 NS4和NS5等 包被固相 以間接法進行測定 由于上述HCV抗原的組合 來源及用量等方面的差異 2 所用包被抗原成份相互之間抗原決定簇的覆蓋 這種覆蓋將嚴重影響ELISA測定的敏感性 目前試劑盒存在的問題 抗HCV 對策 通常的做法是 初檢陰性的血袋再用與不同廠家的國產試劑復檢 如仍為陰性 血即為合格 或初檢使用國產ELISA試劑 復檢采用進口試劑 對策 應采取的辦法 在血站篩檢獻血員血時 初檢陰性尤其是S CO值較高的血液 最好使用不同ELISA試劑盒復檢 這樣才能最大程度的減少經輸血HCV感染的發生 目前試劑盒存在的問題 抗HCV 抗HCVELISA出現假陽性的主要原因有 1 類風濕因子 RF 的干擾2 高免疫球蛋白血癥3 標本中超氧化物歧化酶 SOD 的干擾4 用于固相包被的HCV基因工程抗原不純 目前試劑盒存在的問題 抗HIV 采用雙抗原夾心一步法檢測抗HIV 鉤狀效應 所致的假陰性問題 1 原因 HIV感染者中有些抗體滴度很高 采用可出現雙抗原夾心一步法檢測 可出現類似雙抗體夾心一步法檢測抗原的 鉤狀效應 現象 2 措施 在血站篩檢獻血員時 應使用二步法試劑盒進行檢測 或是對標本進行雙份同時檢測 一份原標本 一份1 10或1 100稀釋標本 從而避免漏檢 目前試劑盒存在的問題 抗HIV ELISA測定結果的解釋1 一般來說 一個感染HIV的患者 使用商品ELISA試劑盒測定 結果應為陽性 因為在這些試劑盒中所用的包被抗原主要為gag編碼蛋白和病毒包膜蛋白 針對這些蛋白的抗體在HIV感染的機體免疫應答中出現最早 而ELISA的測定敏感性足以將其早期測出 因此如果懷疑有可能的HIV感染 但ELISA測定結果為陰性 則HIV感染的可能性很小 2 實驗操作或試劑有問題或不能確定可能出現感染的確切日期 如果HIV抗體ELISA測定為陰性 就不必立即重復檢測 3 對于處于陽性判斷值 Cut off 邊緣即稍低于Cut off的樣本 難于判斷是否為感染早期 或實際為非感染者的樣本 此時 可以再次取血測定和 或用另一種ELISA試劑盒檢測 從而明確測定結果 這種情況下 如果測定結果仍處于Cut off邊緣 則建議數月后再次測定 如仍無改變 則說明無HIV感染 其它如免疫印跡 PCR測定HIVRNA也為此種情況下的HIV感染驗證實驗 目前試劑盒存在的問題 梅毒螺旋體抗體 檢測方法1 檢測非特異性抗體 使用類脂質抗原的血清學試驗 RPR TRUST2 檢測特異性抗體 使用密螺旋體抗原的血清學試驗