第八章 細胞核與染色體1Nuclear EnvelopeNuclear Envelope,位于間期細胞核的最外層，是細胞核和細胞質之間的界膜。 生物學意義：一方面構成核、質之間的天然選擇性屏障；避免生命活動的彼此干擾；保護DNA不受細胞骨架運動所產生的機械力的損傷。另一方面介導核質之間的物質交換與信息交流 。 是包在核外的雙層膜結構。它將DNA與細胞質分隔開，形成核內特殊的微環境，保護DNA分子免受損傷；使 DNA的復制和RNA的翻譯表達在時空上分隔開來；此外染色體定位于核膜上，有利于解旋、復制、凝縮、平均分配到子核，核被膜還是核質物質交換的通道。 1.1核被膜是雙層膜結構1.1.1Structure外核膜outer nuclear membrane，附有核糖體顆粒 內核膜inner nuclear membrane，有特有的蛋白成份（如LBR） 核纖層nuclear lamina 核周間隙perinuclear space 核孔nuclear pore 核纖層：位于內核膜的內表面的纖維網絡，可支持核膜，并與染色質及核骨架相連。 核纖層由核纖層蛋白（lamin）構成， lamin是一類中間纖維，分為A、B兩型。 核纖層的作用： 1保持核的形態： 2參與染色質和核的組裝：核纖層在細胞分裂時呈現出周期性的變化，在間期核中，核纖層提供了染色質（異染色質）在核周邊錨定的位點。在前期結束時，核纖層被磷酸化，核膜解體。其中B型核纖肽與核膜殘余小泡結合，A型溶于胞質中。在分裂末期，核纖肽去磷酸化重新組裝，介導了核膜的重建。 1.1.2核被膜在細胞周期中的崩解與裝配新核膜來自舊核膜，且核被膜的去組裝是非隨機的，具有區域特異性domain-specific。 1.2Nuclear Pore Complex,NPC內外核膜在某些部位相互融合，形成環狀開口，稱為核孔Nuclear pore,在核孔上鑲嵌著由多種蛋白質構成的復雜結構，稱為核孔復合體Nuclear Pore Complex,NPC。 一般哺乳動物細胞平均有3000個核孔。 細胞核活動旺盛的細胞中核孔數目較多，反之較少。 Fish Trap Model 1.胞質環cytoplasmic ring，外環； 2.核質環nuclear ring，內環； 3.輻spoke,可分三個結構域 柱狀亞單位（column subunit） 腔內亞單位(luminal subunit) 環帶亞單位（annular subunit） 4.中央栓central plug，又稱transporter。 電鏡下觀察，核孔是呈圓形或八角形，一般認為其結構如fish-trap，主要包括以下幾個部分：胞質環（cytoplasmic ring），位于核孔復合體胞質一側，環上有8條纖維伸向胞質；核質環（nuclear ring），位于核孔復合體核質一側，上面伸出8條纖維，纖維端部與端環相連，構成籠子狀的結構；轉運器（transporter），核孔中央的一個栓狀的中央顆粒；輻（Spoke）：核孔邊緣伸向核孔中央的突出物。 1.2.1The composition of NPC構成核孔復合體的蛋白統稱為“核孔蛋白” nucleoporin，Nup。 核孔復合體主要由蛋白質構成，其總相對分子質量約為125106，推測可能含有100余種不同的多肽，共1 000多個蛋白質分子。 Nup的兩類代表： gp210：結構性跨膜蛋白； p62：功能性的核孔復合體蛋白,具有兩個功能結構域。 1.2.2The function of NPCNPC的功能：核質交換的雙向、雙功能、選擇性親水性通道。 雙向：入核、出核； 雙功能：被動運輸、主動運輸。 (一)通過NPC的被動運輸 根據資料推測，NPC的中央通道在介導被動運輸時直徑約為9nm，相當于可以允許60kDa以下的球形蛋白自由通過； 由于各種因素的影響，并不是所有直徑10nm以下的分子在核被膜兩側均勻分布； (二)通過NPC的主動運輸 1.選擇性和雙向性 對運輸顆粒大小的限制：有效功能直徑可被調節約1020nm，甚至可達26nm； 主動運輸是一個信號識別與載體介導的過程，需要消耗能量，并表現出飽和動力學特征； 主動運輸具有選擇雙向性，即選擇性地對不同的物質進行核輸入或核輸出 。 2.親核蛋白與核定位信號 親核蛋白（karyophilic protein）: 在細胞質內合成后，需要或能夠進入細胞核內發揮功能的一類蛋白質. 核定位信號（nuclear localization signal，NLS）：引導蛋白質進入細胞核的一段信號序列。受體為importin。 第一個被確定的NLS是病毒SV40的T抗原，序列為：pro-pro-lyslys-lys-Arg-Lys-val。 NLS對連接的蛋白質無特殊要求，完成輸入后不被切除。 Ran蛋白，一類G蛋白，調節貨物復合體的解體或形成。 3. 出核轉運和核輸出信號 不同RNA的出核轉運： RNApol I轉錄的rRNA分子：以RNP的形式離開細胞核，需要能量； RNApol III轉錄的5s rRNA與 tRNA的核輸出由蛋白質介導； RNA pol II轉錄的hn RNA，在核內進行5端加帽和3端附加PolyA序列以及剪接等加工過程，然后形成成熟的mRNA出核； 核輸出信號（nuclear export signal, NES），引導RNP輸出細胞核，受體為exportin。 mRNA的出核轉運過程是有極性的，其5端在前，3端在后。 2ChromatinChromatin VS Chromosome 染色質（chromatin）: 指間期細胞核內由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量 RNA組成的線性復合結構, 是間期細胞遺傳物質存在的形式。 染色體(Chromosome): 指細胞在有絲分裂或減數分裂過程中, 由染色質聚縮而成的棒狀結構。 染色質與染色體是在細胞周期不同的功能階段可以相互轉變的的形態結構染色質與染色體具有基本相同的化學組成，但包裝程度不同,構象不同。 2.1Chemical composition組成：DNA、組蛋白Histone、非組蛋白Nonhistone、少量RNA。 DNA:Histone較為穩定，約1:1；DNA:Nonhistone變化較大；DNA:RNA約為10:1。 2.1.1DNA凡是具有細胞形態的所有生物其遺傳物質都是DNA。在真核細胞中，每條未復制的染色體包裝一條DNA分子。 Genome：一個生物貯存在單倍染色體組中的總遺傳信息，稱為該生物的基因組。 （一）DNA分子一級結構具有多樣性 1.單一序列； 2.中度重復DNA序列 ； 短散在重復元件（short interspersed elements，SINEs） 長散在重復元件（long interspersed elements，LINEs） 3.高度重復DNA序列 衛星DNA（satellite DNA），主要分布在染色體著絲粒部位； 小衛星DNA（minisatellite DNA），又稱數量可變的的串聯重復序列，常用于DNA指紋技術（DNA finger-printing）作個體鑒定； 微衛星DNA（microsatellite DNA）重復單位序列最短，具高度多態性，在遺傳上高度保守，為重要的遺傳標志。 （二）DNA二級結構具有多形性 B-DNA、Z-DNA、A-DNA。 2.1.2Histone真核生物染色體的基本結構蛋白，帶正電荷(?)，富含Arg，Lys，屬堿性蛋白，共5種，分為： 核心組蛋白（core histone）：H2A、H2B、H3、H4； 連接組蛋白（linker histone）：H1。 結構： 核心組蛋白高度保守，沒有種屬及組織特異性，尤其是H4。 H1是多樣性，具有一定的屬(genus)和組織特異性。 2.1.3Nonhistone非組蛋白具多樣性和異質性； 對DNA具有識別特異性，又稱序列特異性DNA結合蛋白 (sequence specific DNA binding proteins)； 功能：幫助DNA折疊；協助DNA復制；調節基因表達。 多以-helix和DNA大溝識別并結合，進而影響復制和轉錄。 非組蛋白和DNA不同的結合模式： 1.螺旋-轉角-螺旋模式(helix-turn-helix motif) 2.鋅指模式(Zinc finger motif) 3.亮氨酸拉鏈模式(Leucine zipper motif，ZIP) 4.螺旋-環-螺旋結構模式(helix-loop-helix motif，HLH) 5.HMG-盒結構模式（HMG-box motif）。 2.2Nuleosome染色質的基本結構單位核小體(nucleosome)。 2.2.1Main experimental proof1.鋪展染色質的電鏡觀察 2.用非特異性微球菌核酸酶消化染色質，部分酶解片段分析結果. 3.應用X射線衍射、中子散射和電鏡三維重建技術研究. 核小體顆粒是直徑為11nm、高6.0nm的扁園柱體，具有二分對稱性。核心組蛋白的構成是先形成(H3)2.(H4)2四聚體，然后再與兩個H2AH2B異二聚體結合形成八聚體。 4. SV40微小染色體（minichromosome）分析與電鏡觀察。 SV40DNA為環形，約5.0Kb,若200bpDNA包裝成一個核小體，則可形成25個核小體。 2.2.2核小體結構要點1.每個核小體單位包括200bp左右的DNA超螺旋和一個組蛋白八聚體核心(Core)及一個分子H1； 2.由H2A、H2B、H3、H4各兩分子形成八聚體，構成核心顆粒； 3.146bp的DNA分子超螺旋盤繞組蛋白八聚體1.75圈, 組蛋白H1在核心顆粒外結合額外20bp DNA，鎖住核小體DNA的進出端，起穩定核小體的作用； 4.兩個相鄰核小體之間以連接DNA 相連，典型長度60bp，不同物種變化值為080bp； 5.組蛋白與DNA之間的相互作用主要是結構性的，基本不依賴于核苷酸的特異序列； 6.核小體沿DNA的定位受不同因素的影響，進而通過核小體相位改變影響基因表達。 2.3The Packing Model of Chromatin人體的一個細胞核中有23對染色體，每條染色體的DNA雙螺旋若伸展開，平均長為5cm，核內全部DNA連結起來約1.72.0m。 2.3.1多級螺旋模型multiple coiling model一級結構：核小體Nucleosome 二級結構：螺線管(solenoid) 電鏡下觀察用溫和方法分離的染色質是直徑30nm的纖維，這種纖維的由核小體螺旋化形成，每6個核小體繞一圈，長度壓縮6倍。 三級結構：超螺線管(supersolenoid) 四級結構：染色單體（chromatid） DNA 壓縮7倍 核小體 壓縮6倍 螺線管 壓縮40倍 超螺線管 壓縮5倍 染色單體 2.3.2 骨架-放射環結構模型scaffold radial loop structure model認為30nm的纖維折疊為一系列的環（loop），沿染色體縱軸結合在染色體骨架chromsomal scaffold。 由螺線管形成DNA復制環,每18個復制環呈放射狀平面排列, 結合在核基質上形成微帶(miniband)。 染色體包裝的不同組織水平：染色體包裝的實際形式可能是多種機制（模型）的融合。 2.4Euchromatin & Heterochromatin間期核中染色質可分為常染色質(enchromatin）和異染色質（heterochromatin）。 2.4.1 Enchromatin概念：指間期核內染色質纖維折疊壓縮程度低, 處于伸展狀態, 用堿性染料染色時著色淺的那些染色質。 DNA包裝比約為1 0002 000分之一；主要由單一序列 DNA 和中度重復序列DNA構成。 并非所有基因都具有轉錄活性,常染色質狀態只是基因轉錄的必要條件而非充分條件 2.4.2Heterochromatin概念：指間期核內染色質纖維折疊壓縮程度高, 處于聚縮狀態, 用堿性染料染色時著色深的那些染色質。 類型： 結構異染色質(組成型異染色質)constitutive heterochromatin ； 概念：存在于各種細胞中，除復制期以外在整個細胞周期均處于聚縮狀態，DNA包裝比在整個細胞周期沒有較大變化的異染色質。 特點：在中期染色體上多定位于著絲粒區、端粒、次縊痕及染色體臂的某些節段； 由相對簡單、高度重復的DNA序列構成, 如衛星DNA； 具有顯著的遺傳惰性, 不轉錄也不編碼蛋白質； 在復制行為上與常染色質相比表現為晚復制早聚縮； 在功能上參與染色質高級結構的形成，導致染色質區間性；作為核DNA的轉座元件，引起遺傳變異。 兼性異染色質facultative heterochromatin 。 概念：在某些細胞類型或一定的發育階段, 原來的常染色質聚縮, 并喪失基因轉錄活性, 而形成的異染色質。 異染色質化可能是關閉基因活性的一種途徑。 如：巴爾氏小體(Barr body):雌性哺乳動物類細胞核內，兩條X染色體之一在發育早期隨機發生異染色質化而失活，在上皮細胞核內，這個異固縮的X染色體稱為巴爾氏小體。 雌性哺乳類動物的X染色體就是一類特殊的兼性異染色質。在哺乳動物細胞內如有兩個X染色體（通常為雌性），則其中的一個染色體常表現為異染色質，稱巴氏小體（barr body）。人的胚胎發育到16天以后，一條X染色體轉變為巴氏小體，呈塊狀緊靠核膜，染色反應表現為深染。因此通過檢查羊水中胚胎細胞的巴氏小體可預測胎兒的性別。 3Chromosome3.1Metaphase chromosome有絲分裂中期染色體具有最高的壓縮比，形態結構典型。 兩條染色單體以著絲粒相連，互稱Sister chromatid。 3.1.1中期染色體的類型根據著絲粒在染色體上的位置，將中期染色體分為四類： 中著絲粒染色體(metacentric chromosome) 亞中著絲粒染色體(submetacentric chromosome) 亞端著絲粒染色體(subtelocentric chromosome) 端著絲粒染色體(telocentric chromosome)。 劃分的標準有： 著絲粒比r（長臂長/短臂長） 著絲粒指數i(短臂長/染色體長)100%， 短臂長臂比 3.1.2中期染色體的結構(1)著絲粒(centromere)與著絲點(動粒，kinetochore) 著絲粒Centromere，主縊痕 primary constriction:中期染色體上一個染色較淺而縊縮的部位，連接兩個染色單體。 Kinetochore,著絲點、動粒：主縊痕處兩個染色單體外側與紡錘體微管連接的蛋白質復合結構。 著絲粒的結構 1、動粒結構域（kinetochore domain）： 位于著絲粒的表面，包括三層板狀結構和圍繞外層的纖維冠(fibrous corona)。 2、中央結構域(central domain)：位于著絲粒結構域的下方。其中含有高度重復的衛星DNA，CENP-B框與動粒蛋白作用。 3、配對結構域(pairing domain)： 內部著絲粒蛋白INCENP(inner centromere protein)； 染色單體連接蛋白clips(chromatid linking proteins)。 (2)次縊痕(secondary constriction)：除主縊痕外，染色體上其它呈淺縊縮的部分稱次縊痕，次縊痕的位置相對穩定，是鑒定染色體個別性的一個顯著特征。 (3)隨體（satellite）：指位于染色體末端的球形染色體節段，通過次縊痕區與染色體主體部分相連。 (4)核仁組織區(nucleolar organizing region,NOR):是rDNA (rRNA基因)所在的區域。能夠合成核糖體的28S、18S和5.8S rRNA(5SrRNA基因除外)。核仁組織區位于染色體的次縊痕區，但并非所有的次縊痕都是NORs. (5)端粒(telomere) ：是染色體端部的特化部分。 端粒由高度重復的短序列串聯而成，在進化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相似，人的序列為TTAGGG。 端粒生物學作用之一在于維持染色體的獨立性和完整性。 作用之二是起“細胞分裂計數器”的作用。 3.2染色體DNA的三種功能元件在細胞世代中確保染色體的復制和穩定遺傳，染色體至少應具備三種基本功能元件functional elements，對應的DNA序列稱為“染色體DNA的功能元件”。 1.DNA復制起點自主復制DNA序列autonomously replicating DNA sequenceARS：DNA復制的起點。 2.著絲粒著絲粒DNA序列centromere DNA sequence,CEN：參與形成著絲粒，使細胞分裂中染色體能夠準確地分離 3.端粒端粒DNA序列(telomere DNA sequence,TEL) ：保持染色體的獨立性和完整性。 一般情況下，每個真核細胞染色體具多個ARS(如酵母中含200400個)，一個CEN，兩個TEL。 Leu-型酵母細胞的轉染實驗證明三種功能元件的必要性。 三種功能元件的結構特點： 1.ARS:大多數具有一個11bp富含AT的一致序列（ARS consensus sequence, ACS），及其上下游各200bp左右的區域是維持ARS功能所必需的。 2.CEN:由大量串聯的重復序列組成，如衛星DNA;兩個相鄰的核心區：80-90bp的AT區；11bp的保守區。 3.TEL:由高度重復的端粒序列構成，人的序列為TTAGGG是由端粒酶Telomerase合成后添加上的。 The Telomerase & “The End-replication Problem” Telomerase:一種核糖核蛋白復合物，具有逆轉錄酶活性，以物種專一的內在RNA作為模板，把合成的端粒重復序列添加到染色體DNA的3末端。 端粒和細胞衰老 在動物細胞中，只有生殖系細胞和部分干細胞中存在Telomerase活性，因此端粒起到細胞分裂計數器的作用：隨細胞分裂，端粒逐漸縮短。 端粒和細胞衰老關系密切。如：Dolly的端粒和正常羊相比短20，同時Dolly和正常羊相比表現為早衰、早亡。 腫瘤細胞具有表達端粒酶活性的能力，故能無限增殖。 人造微小染色體artificial minichromosome 1983年，A. W. Murray等人首次成功構建了包括ARS、CEN、TEL和外源DNA，總長度為55kb的酵母人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC)。 YAC可用于轉基因和構建基因文庫，容納插入片段的能力遠高于質粒。 3.3核型和染色體顯帶核型（karyotype）是細胞分裂中期染色體特征的總和，包括染色體的數目、大小和形態特征等方面。如果將成對的染色體按形狀、大小依順序排列起來叫核型圖(karyogram)，而染色體組型idiogram通常指核型的模式圖，代表一個物種的模式特征。 染色體分帶技術是經物理、化學因素處理后，再用染料對染色體進行分化染色，使其呈現特定的深淺不同帶紋（band）的方法。分帶技術可分為兩大類，一類是產生的染色帶分布在整過染色體的長度上如：G、Q和R帶，另一類是局部性的顯帶，它只能使少數特定的區域顯帶，如C、Cd、T和N帶。 染色體顯帶：經物理、化學因素處理后，再用染料對染色體進行分化染色，使其呈現特定的深淺不同帶紋（band）的方法。 分帶技術可分為兩類： 一類是產生的染色帶分布在整過染色體的長度上如：Q、G和R帶， 另一類是局部性的顯帶，如C、Cd、T和N帶。 Q帶是最早出現的染色體顯帶技術，富含GC區為暗帶。 G帶所顯帶紋與Q帶相符。 C帶顯示的是著絲粒異染色質。相應地，T帶顯示端粒；N帶顯示NORs。 3.4Giant chromosomesGiant chromosomes：在某些細胞中存在的體積巨大的染色體。包括：多線染色體（polytene chromosome）；燈刷染色體（lampbrush chromosome）。 3.4.1Polytene chromosome存在于雙翅目昆蟲的幼蟲組織細胞、某些植物細胞。 特點： 體積巨大，是由于核內有絲分裂(Endomitosis)的結果； 多線性； 體細胞聯會(同源染色體配對)； 具有帶和間帶。 具有脹泡puff和巴氏環（Balbiani ring）。 帶區Band和間帶Interband的染色質相比有更高的包裝程度;帶和間帶都含有基因，可能管家基因(housekeeping gene) 位于間帶, 奢侈基因(luxury gene) 位于帶上。 脹泡Puff，是線染色體中一些疏松膨大的帶區。被認為是基因活躍轉錄的形態學標志 。 3.4.2Lampbrush chromosomelampbrush chromosome，普遍存在于動物界的卵母細胞，兩棲類卵母細胞的燈刷染色體最典型。由于染色體主軸兩側有側環，狀如燈刷，故名燈刷染色體。 燈刷染色體的來源：卵母細胞進行減數第一次分裂時停留在雙線期的染色體。 側環是RNA活躍轉錄的區域。 4Nucleonus核仁是真核細胞間期核中最顯著的細胞器，在活細胞用普通光學顯微鏡便可看到，這是由于核仁的折光性強，與細胞其他結構可顯出明顯的界限。在細胞核內呈濃密的球狀小體。據報道，這個細胞器最早是有Fontana于1881年首次發現。 核仁（nucleolus）見于間期的細胞核內，呈圓球形，一般12個，有時多達35個。主要功能是轉錄rRNA和組裝核糖體單位。 一般蛋白質合成旺盛和分裂增殖較快的細胞有較大和數目較多的核仁，反之核仁很小或缺如。 核仁在分裂前期消失，分裂末期又重新出現。 4.1Ultrastructure of Nucleolus1.纖維中心(fibrillar centers，FC)：是被致密纖維包圍的一個或幾個低電子密度的圓形結構，主要成分為RNA聚合酶和rDNA，這些rDNA是裸露的分子(沒有組蛋白核心) 。 2.致密纖維組分(dense fibrillar component，DFC)：呈環形或半月形包圍FC，由致密的纖維構成，是新合成的RNP，轉錄主要發生在FC與DFC的交界處。 3.顆粒組分(granular component，GC)：由直徑15-20 nm的顆粒構成，是不同加工階段的RNP。 除上述三種基本組分外，還包括： 核仁基質（(nucleolar matrix)； 核仁相隨染色質(nucleolar associated chromatin)：又分為，核仁內染色質Nucleolar chromatin和核仁周邊染色質Perinucleolar chromatin。 4.2Functions of Nucleolus其主要功能是核糖體的生物發生(ribosome biogenesis)，是 一個向量過程(vetorical process)：從核仁纖維組分開始, 再向顆粒組分延續。 這一過程包括rRNA的合成、加工和核糖 體亞單位的裝配。 核仁的另一個功能涉及mRNA的輸出與降解。 4.2.1Transcription of rRNA組織特征: 位于NORs的rDNA是rRNA的信息來源。 rRNA基因是重復的多拷貝