文獻(xiàn)翻譯塊狀非晶態(tài)Mg-Zn-Ca合金在細(xì)胞的反應(yīng)與腐蝕摘要：通過塊狀非晶態(tài)Mg-Zn-Ca合金（主要有Mg66Zn30Ca4與Mg70Zn25Ca5）的微觀組織結(jié)構(gòu)觀察、表面性能測(cè)試、機(jī)械性能檢測(cè)、腐蝕與生物毒性的測(cè)試，研究驗(yàn)證其作為生物植入材料的可行性。研究發(fā)現(xiàn)，通過觀察微觀尺度下均勻分布的蝕孔中的腐蝕產(chǎn)物，Mg66Zn30Ca4合金具有與冷軋純鎂和Mg70Zn25Ca5合金相同的腐蝕形態(tài)。其腐蝕產(chǎn)物主要都是與Mg（OH）2和Zn（OH）2，并且腐蝕機(jī)理都是一致的。利用L929和MG63細(xì)胞株系在合金上進(jìn)行間接的細(xì)胞毒性測(cè)試和直接的細(xì)胞培植試驗(yàn)，結(jié)果顯示，Mg-Zn-Ca合金上的細(xì)胞存活率較冷軋純鎂上的高，并且發(fā)現(xiàn)L929和MG63細(xì)胞在Mg66Zn30Ca4表面上有明顯的黏附和增生。關(guān)鍵詞：鎂合金非晶態(tài)合金機(jī)械性能腐蝕細(xì)胞毒性1、引言近年，鎂合金作為生物植入材料廣受關(guān)注1-5。引起眾多興趣的原因在于鎂合金具有良好的機(jī)械力學(xué)性能、生物相容性和可降解性6。有些研究者將人體必需的元素Zn和Ca加入鎂中形成的鎂合金應(yīng)用于鎂合金的生物安全性和生物相容性的研究3-5,7。例如，張等，研究報(bào)道過Mg-Zn合金具有很高的抗拉強(qiáng)度（278.5MPa），并且鋅離子的釋放不會(huì)對(duì)人體造成傷害。我們的研究表明Mg-1Ca合金在骨骼的植入部位的腐蝕降解速率為2.28mg/mm2/yr。并且在鎂合金還會(huì)促進(jìn)植入部位周圍的骨骼組織的生長(zhǎng)5。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，鎂合金的腐蝕降解仍面臨更多的挑戰(zhàn)。第一，原本必需的鎂合金固有的機(jī)械強(qiáng)度會(huì)隨著腐蝕降解的進(jìn)行會(huì)降低7。張等，曾發(fā)表Mg-Zn合金的機(jī)械強(qiáng)度在腐蝕的最初階段下降的速度很快（當(dāng)合金失重6%時(shí)，強(qiáng)度有625MPa降至390MPa）。第二，鎂合金經(jīng)常遭受不同類型的腐蝕。點(diǎn)蝕是鎂合金在中性或堿性溶液中腐蝕的典型模式8，并且腐蝕沿著蝕坑的方向向周圍擴(kuò)展造成鎂合金在一定的腐蝕時(shí)間過后失效5,9。Witte等2，研究表明LAE442和AZ91D合金植入豬腿骨18周后，其表面會(huì)呈現(xiàn)不規(guī)則的粗糙表面。我們以前的研究也發(fā)現(xiàn)Mg-1Ca合金在骨骼中的腐蝕出現(xiàn)不同的腐蝕產(chǎn)物5，并且由于點(diǎn)蝕造成的合金表面缺陷也會(huì)加快鎂合金機(jī)械強(qiáng)度的下降。第三，現(xiàn)在常用的鎂合金在生物體液環(huán)境中的腐蝕降解速度大于骨骼組織的自我恢復(fù)速度5,6,10，并且腐蝕過程會(huì)釋放氫氣并使腐蝕環(huán)境的堿化1,11對(duì)周圍的生物組織造成危害。因而，研究一種新的鎂基生物材料，使它具有良好的機(jī)械性能，較低的腐蝕速度的同時(shí)產(chǎn)生同樣的腐蝕產(chǎn)物，應(yīng)用于臨床應(yīng)用是非常必要的。由于鎂基非晶態(tài)合金只具有一種相態(tài)而廣受關(guān)注，其具有與普通鎂合金相同的化學(xué)性質(zhì)并且沒有第二相12-14，這些性質(zhì)會(huì)使合金的機(jī)械性能和腐蝕阻抗增加，并且其腐蝕產(chǎn)物是相同的。鎂基非晶態(tài)合金有著長(zhǎng)足的發(fā)展研究，產(chǎn)生包括Mg-Cu-Y、Mg-Ni-Y、Mg-Cu-Gd和Mg-Zn-Ca在內(nèi)的各種合金12。其中，Mg-Zn-Ca展現(xiàn)了非常合適的機(jī)械強(qiáng)度，其單位體積質(zhì)量強(qiáng)度（）在250-300MPa.cm3/g范圍內(nèi)15，其比常規(guī)晶態(tài)鎂合金高出40%（鑄造AZ91D和WE43的強(qiáng)度分別為220MPa.cm3/g、176MPa.cm3/g16）。通過增加人體必需的Zn和Ca17,18元素增加合金的生物相容性，使得Mg-Zn-Ca非晶態(tài)合金稱為最合適的生物植入鎂合金。在本次的研究中，著重研究鎂基非晶態(tài)合金具有良好的非晶態(tài)形成能力（GFA），和Mg66Zn30Ca4與Mg70Zn25Ca5的腐蝕產(chǎn)物與細(xì)胞相容性。2、試驗(yàn)2.1.合金制備以純度大于99.9%的Mg、Ca和Zn粒，在氬氣的氣氛的熔爐中進(jìn)行熔煉，形成均勻的混合（按原子比例混合）的合金。將熔化的合金通過石英管注入直徑為2mm的銅模具中。利用X衍射儀鑒定鑄造Mg-Zn-Ca合金的非晶態(tài)性，通過Rigaku的DMAX2400衍射儀，射線源為CuK靶進(jìn)行樣品組織分析，并且利用差示掃描量熱法（DSC）（Perkin-Elmer公司，Diamond-DSC測(cè)量?jī)x）控制溫差為40K/min的熱傳導(dǎo)進(jìn)行樣品與參比物的功率差和溫度的關(guān)系。將鑄造Mg66Zn30Ca4和Mg70Zn25Ca5合金樣品切割為2mm厚度的圓盤并用2000號(hào)砂紙將其表面打磨光滑，然后進(jìn)行電化學(xué)試驗(yàn)。所有的樣品必須經(jīng)過丙酮、無水乙醇和蒸餾水的超聲波清洗。對(duì)于要進(jìn)行細(xì)胞培植試驗(yàn)的磁盤狀樣品，必須在紫外線輻射下照射至少2h進(jìn)行滅菌處理。2.2.機(jī)械性能測(cè)試?yán)煨阅軠y(cè)試試驗(yàn)是按照ASTM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，試樣為2mm長(zhǎng)為4mm的圓柱。在室溫中，利用8562拉伸輕度試驗(yàn)儀在210-4s-1的應(yīng)變率的速度下進(jìn)行單向靜壓縮試驗(yàn)。2.3.電化學(xué)測(cè)試電化學(xué)特征常用三電極電池裝置測(cè)量，試驗(yàn)用鉑作輔助電極，飽和甘汞電極（SCE）作為參比電極。在試樣上連接導(dǎo)線，除試樣末端的表面（裸露部分表面積為3.14mm2）暴露在溶液中，其他部位用環(huán)氧樹脂嚴(yán)格密封。電化學(xué)試驗(yàn)都是在CHI600C電化學(xué)工作站，在溫度為37的模擬體液（SBF，NaCl8.035g,NaHCO30.355g,KCl0.225g,K2HPO4.3H2O0.231g,MgCl2.6H2O0.311g,CaCl20.292g,Na2SO40.072g,(HOCH2)3CNH26.118g）中進(jìn)行。測(cè)量開路電位（OCP）4000s。鎂合金的動(dòng)電位極化曲線測(cè)試時(shí)電位掃描速度為1mv/s,并且在4000s的開路電位測(cè)量之后用小于腐蝕電位（Ecorr）的300mv初始電壓開始測(cè)量。極化曲線測(cè)量完成后樣品經(jīng)丙酮、蒸餾水清洗干凈后風(fēng)干。用掃描電子顯微鏡（ESEM，Quanta200FEG）進(jìn)行樣品表面腐蝕形貌的觀察。之后，將試樣浸入含三價(jià)鉻的溶液（180g/lCrO3）中5-10分鐘，用來清洗表面的腐蝕產(chǎn)物。將清洗風(fēng)干后的試樣再次放在掃描電子顯微鏡（ESEM）下觀察并記錄腐蝕形貌。采用Kratos的AXIS-Ultra標(biāo)準(zhǔn)分析有X射線光電子能譜采集的數(shù)據(jù)，X射線光電子能譜儀的射線源為單色AlK(225W,15mA,15kV),同時(shí)采用低能量的電子流進(jìn)行電荷補(bǔ)償。為了消除表面荷電效應(yīng)的影響，利用C1s譜峰值為284.80eV的標(biāo)準(zhǔn)烴進(jìn)行校準(zhǔn)。最后將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為VAMAS格式輸入CasaXPS軟件進(jìn)行曲線擬合與數(shù)據(jù)分析。2.4.生物毒性測(cè)試小鼠的成纖維細(xì)胞（L929）與人體骨肉瘤細(xì)胞（MG63）常用于體外細(xì)胞培植試驗(yàn)。它們?cè)贒ulbecco-Eagle培養(yǎng)液（DMEM）中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液包括10%的胎牛血清（FBS）、100U.ml-1青霉素、100ug.ml-1鏈霉素，在37，含5%CO2的加濕氣氛中試驗(yàn)。常用體外培養(yǎng)液為無血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行，其表面積與浸提介質(zhì)比值為1cm2/ml，在37、含5%CO2的加濕氣氛中進(jìn)行72h的細(xì)胞培植，并且經(jīng)過離心機(jī)分離，將上層的清液去除，然后在4溫度下保存。利用DMEM培養(yǎng)液與含10%DMSO的DMEM培養(yǎng)液作為對(duì)比試驗(yàn)的陰性對(duì)照液和陽(yáng)性對(duì)照液進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)于96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔附著的細(xì)胞與培養(yǎng)液數(shù)量比為5103個(gè)細(xì)胞/100ul，培養(yǎng)24h。去除培養(yǎng)液，每孔加入100ul的提取液，在37，含5%CO2的加濕氣氛中培養(yǎng)的第1、3、5天，用光學(xué)顯微鏡觀察96孔培養(yǎng)板各孔的情況，隨后在每孔中添加10ulMTT溶液。試樣在MTT溶液中繼續(xù)在37，5%CO2中培養(yǎng)4h,然后在每孔中添加甲臜溶解液（含每毫升10%SDS的HCl）。通過酶標(biāo)儀（Bio-RAD680）測(cè)定吸光度，采用雙波長(zhǎng)測(cè)定利用波長(zhǎng)為570nm和630nm進(jìn)行測(cè)定。并且在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行PH值測(cè)定和提取Mg、Zn、Ca離子進(jìn)行測(cè)定。2.5.細(xì)胞黏附測(cè)試將200ul細(xì)胞懸浮液接種到Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和冷軋純鎂試樣（對(duì)照）的表面，細(xì)胞密度為1105個(gè)細(xì)胞/ml（L929），5104個(gè)細(xì)胞（MG63）。分別在37，5%CO2中的96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)1,3和5天后，在室溫下的2.5%戊二醛溶液中浸泡2h，之后用磷酸鹽緩沖液（PBS，PH=7.4）沖洗3次。隨后在不同梯度的乙醇/蒸餾水（50%，60%，70%，80%，90%，100%）中進(jìn)行脫水，接著在六甲基二硅胺烷試劑（HMDS）中干燥。對(duì)細(xì)胞黏附的樣品表面用掃描電子顯微鏡觀察并記錄形貌特征。并增加不同PH值下的鎂合金的對(duì)照試驗(yàn)。3、試驗(yàn)結(jié)果3.1.微觀組織和機(jī)械性能圖1所示為Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的XRD譜，由圖可以發(fā)現(xiàn)兩種Mg-Zn-Ca合金具有典型的非晶態(tài)花樣，其XRD譜沒有晶粒體的衍射峰，反而在38和66方向出現(xiàn)明顯的散射信號(hào)。相對(duì)于Mg66Zn30Ca4試樣，Mg70Zn25Ca5在低角度出現(xiàn)更寬闊的散射峰，其原因可能在于其鎂的含量高的緣故，我們都知道鎂的原子半徑大于鋅原子15。圖1.Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的XRD譜圖2所示為Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的曲線DSC（差示掃描量熱法）曲線。Mg66Zn30Ca4的玻璃花溫度（Tg）和第一個(gè)結(jié)晶化溫度（Tx1）都高于Mg70Zn25Ca5。趙等19，也發(fā)現(xiàn)在Mg-Zn-Ca合金中隨著鎂的增加，合金的Tg與Tx1都會(huì)下降。圖2.Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的DSC曲線圖3所示為Mg66Zn30Ca4與Mg70Zn25Ca5在壓縮試驗(yàn)中的典型應(yīng)力應(yīng)變曲線。Mg66Zn30Ca4與Mg70Zn25Ca5的斷裂強(qiáng)度分別為（565.823.2）MPa和（531.222.8）MPa，二者都高于鑄態(tài)純鎂的（198.14.5）MPa20。圖3.Mg66Zn30Ca4和Mg70Zn25Ca5的壓縮時(shí)應(yīng)力應(yīng)變圖3.2.電化學(xué)行為測(cè)量結(jié)果圖4所示為Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂在模擬體液中的OCP（開路電位）圖。兩種Mg-Zn-Ca合金的OCP在開始的1000s時(shí)快速增加，而且很明顯發(fā)現(xiàn)二者都高于鑄態(tài)純鎂。Mg66Zn30Ca4試樣呈現(xiàn)比Mg70Zn25Ca5更高的開路電位，其原因可能在于合金中Zn含量不同，由于Zn的電極電位（-1.02VSCE）高于Mg的電極電位（-1.65VSCE）9。另外，Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的開路電位有明顯的波動(dòng)，而Mg66Zn30Ca4得開路電位要穩(wěn)定的多。如圖4（b）所示，兩種Mg-Zn-Ca合金的陰陽(yáng)極反應(yīng)的動(dòng)態(tài)極化電位高于鑄態(tài)純鎂。隨著合金中的Zn的含量增加，會(huì)使合金的穩(wěn)定性增加并降低Mg的析氫反應(yīng)21,22。Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的腐蝕電流密度Icorr分別是3.53uA/cm2，11.2uA/cm2和36.8uA/cm2。通過試驗(yàn)結(jié)果可以推斷兩種Mg-Zn-Ca合金的腐蝕阻抗比鑄態(tài)純鎂高，并且Mg66Zn30Ca4的阻抗高于Mg70Zn25Ca5。圖5所示為浸泡10min前后試樣的SEM圖，Mg66Zn30Ca4浸泡前后的腐蝕形貌比較類似，而且裂紋很少，然而Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂可以發(fā)現(xiàn)很明顯很深的裂紋。在去除腐蝕產(chǎn)物后，在Mg66Zn30Ca4的表面發(fā)現(xiàn)很多微觀孔洞（2-10um），而鑄態(tài)純鎂會(huì)出現(xiàn)更大的不對(duì)稱分布的孔洞（10-60um）。而XPS試驗(yàn)結(jié)果顯示Mg-Zn-Ca合金的腐蝕產(chǎn)物由Mg、Zn、Ca和O組成，并且在Mg66Zn30Ca4的表面發(fā)現(xiàn)的ZnO和O2-含量高于Mg70Zn25Ca5。3.3.浸泡測(cè)試圖6所示為鑄態(tài)純鎂和Mg-Zn-Ca合金在模擬體液中腐蝕時(shí)對(duì)溶液PH值的改變。結(jié)果顯示Mg66Zn30Ca4對(duì)PH值的改變速度慢于鑄態(tài)純鎂和圖4.（a）開路電位圖（b）Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂的動(dòng)態(tài)電位極化曲線Mg70Zn25Ca5。并且，鑄態(tài)純鎂和Mg66Zn30Ca4在部分區(qū)域出現(xiàn)穩(wěn)定的上升速度。圖7所示為Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和鑄態(tài)純鎂在模擬體液中不同時(shí)間的表面腐蝕形貌圖。Mg66Zn30Ca4試樣在37的模擬體液中浸泡3天后其表面較為平坦，表面腐蝕產(chǎn)物包含C、O、Mg、P、Ca、Zn元素，并且Zn的含量比Mg還高。在Mg70Zn25Ca5的表面可以觀察到可見的微觀孔洞，并且其EDS（能量色散譜）結(jié)果顯示Zn的含量高于Mg，圖5.(a)Mg6