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文檔簡介

1、酶促反應動力學研究方法介紹,堿性磷酸酶km值測定,實驗目的 學習環境因素對酶促反應速度的影響； 學習米氏方程及Km值得測定； 測量堿性磷酸酶km值； 實驗原理 E的反應速度受到環境因素的影響，這些因素包 括底物濃度、E濃度、PH、溫度、激活劑、抑止劑等,（一）米曼氏方程式,中間產物,酶促反應模式中間產物學說,相關E學原理,1913年Michaelis和Menten提出反應速度與底物濃度關系的數學方程式，即米曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物濃度 V：不同S時的反應速度 Vmax：最大反應速度(maximum velocity) m：米氏常數(Mich

2、aelis constant),當反應速度為最大反應速度一半時,Km值的推導,KmS,Km值等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。,（二）Km與Vmax的意義,Km值 Km等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度。 意義： a) Km是酶的特征性常數之一； b) Km可近似表示酶對底物的親和力； c) 同一酶對于不同底物有不同的Km值。,Vmax 定義：Vm是酶完全被底物飽和時的反應速度，與酶濃度成正比。,（三）m值與max值的測定,1. 雙倒數作圖法(double reciprocal plot)，又稱為 林-貝氏(Lineweaver- Burk)作圖法,

3、2. Hanes作圖法,在林貝氏方程基礎上，兩邊同乘S,S/V=Km/Vmax + S/Vmax,酶濃度對反應速度的影響,當SE，酶可被底物飽和的情況下，反應速度與酶濃度成正比。 關系式為：V = K3 E,雙重影響 溫度升高，酶促反應速度升高；由于酶的本質是蛋白質，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應速度降低 。,溫度對反應速度的影響,最適溫度 (optimum temperature)： 酶促反應速度最快時的環境溫度。,* 低溫的應用,pH對反應速度的影響,最適pH (optimum pH)： 酶催化活性最大時的環境pH。,堿性磷酸酶km值的測定,操作,混勻后，37水浴15min,以第6管調0與650nm比色，讀取各管A值。,實驗數據及結果,以上述數據雙倒數作圖，求出堿性磷酸酶的Km值。,實驗討論,Km值的定義和意義是什么？ 米氏方程度表達式是什么，如何求出Vmax和Km？,現有某待測樣品液5ml，將其稀釋到100ml，取其稀釋液1ml加入測定管按酚試劑法測其蛋白質含量，另取已知濃度的牛血清白蛋白溶液（250微克/ml）1ml加入標準管，其余操作同測定

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