1、基因組的精密工程TALE核酸酶介導的基因組編輯技術TALENs的研究進展及應用,生物工程 匯報人：張瑤,TALENs中文名是轉錄激活因子樣效應物核酸酶，TALENs是一種可靶向特異DNA序列的酶，它借助于TAL效應子一種由植物細菌分泌的天然蛋白來識別特異性DNA堿基對。TAL效應子可被設計識別和結合所有的目的DNA序列。對TAL效應子附加一個核酸酶就生成了TALENs。TAL效應核酸酶可與DNA結合并在特異位點對DNA鏈進行切割，從而導入新的遺傳物質。,簡介,原理,TALENs充分利用植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白-即激活因子樣效應物(TAL effectors,

2、TALEs)-的功能：該蛋白能夠識別特異性DNA堿基對。人們可以設計一串合適的TALEs來識別和結合到任何特定序列，如果再附加一個在特定位點切斷DNA雙鏈的核酸酶，就可以構建出TALEN，利用這種TALEN就可以在細胞基因組中引入新的遺傳物質。相對鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能夠靶向更長的基因序列，而且也更容易構建。,TALENs技術路線圖,TALEs 結構與TALENs,TALEs 具有特殊的結構特征，包括N 端分泌信號、中央的DNA 結合域、1 個核定位信號和C 端的激活域( Fig 1A) 通過對目前發現的所有TALEs蛋白分析發現，T

3、ALEs 蛋白中DNA 結合域有1 個共同的特點，不同的TALEs 蛋白的DNA 結合域是由數目不同的( 12 30 ) 、高度保守的重復單元組成，每個重復單元含有33 35 個氨基酸 這些重復單元的氨基酸組成相當保守，除了第12 和13 位氨基酸可變外，其它氨基酸都是相同的，這兩個可變氨基酸被稱為重復序列可變的雙氨基酸殘基( repeatvariable di-residues，RVD) ( Fig 1B ) TALEs 識別DNA 的機制在于每個重復序列的2 個RVD 可以特異識別DNA 的4 個堿基中的1 個，目前發現的RVD 共有5 種 統計分析發現，HD( 氨基酸名稱) 特異識別C

4、堿基，NI ( 氨基酸名稱) 識別A 堿基，NN( 氨基酸名稱) 識別G 或A 堿基，NG( 氨基酸名稱)識別T 堿基，NS( 氨基酸名稱) 可以識別A、T、G、C中的任一種( Fig 1C) 通過對天然TALE 的研究發現，TALEs 蛋白框架固定識別1 個T 堿基，所以靶序列總是以T 堿基開始。 自然界中，不同TALEs 的DNA 結合域的氨基酸重復序列數目不同，因此，其結合靶DNA 的堿基數目也不同 TALEs 蛋白的這一特點可以用來設計基因組修飾的操作工具，理論上可以根據實驗目的對DNA 結合域的重復序列進行設計，得到特異識別任意序列靶位點的TALEs，因而通過對TALEs 重復序列進

5、行人工設計并將其與一些功能域融合產生的dTALEs ( designer TALE-type transcription factors) 和TALENs( TALE nucleases ) 引起了人們極大的興趣5，6 這些功能域包括激活子、抑制子、核酸酶、甲基化酶和整合酶等7-9 TALEs 的DNA 結合域與FokI 核酸內切酶的切割域融合，就產生了能夠在特定位點產生雙鏈斷裂( double strand break，DSB) 的嵌合酶TALENs,Fig 1 Structure and base sequence recognition of TALEN,注: NLS 為核定位信號; A

6、D 為轉錄激活結構域; VD 為重復可變雙殘基 圖1 將轉錄激活樣效應因子蛋白構建成轉錄激活樣效應因子蛋白核酸酶示意圖,TALENs 基因敲除原理,TALENs 的DNA 結合域與靶序列結合后，FokI形成二聚體特異性切割DNA 序列，導致細胞中發生的DNA 雙鏈斷裂。NHEJ 途徑和同源重組( homologous recombination，H) 途徑在理論上都可以用于對感興趣的目的基因進行遺傳改造。NHEJ是一種較為簡單的修復方式，但是保真度不高，很容易造成DNA 斷裂處的序列發生改變，產生DNA的小片段插入和/或缺失( indel) ，進而造成基因突變。在存在同源序列的情況下，細胞還可

7、以通過H 的方式進行修復，不過效率相對較低( 見圖2) 。,注: TALENs 為轉錄激活因子樣效應物核酸酶; Left TALENs 為識別突變位點3上游DNA 序列TALENs 質粒;Right TALENs 為識別突變位點5 下游DNA 序列TALENs 質粒;NHEJ為非同源末端連接; HR為同源重組 圖2 細胞通過同源重組的方式修復示意圖,TALENs 的構建方法研究,設計和構建TALENs 的最大挑戰是如何把這些能夠結合靶DNA 的重復序列( RVD) 組裝起來 目前，基于Golden gate 方法發展了幾種組裝不同重復個數TALENs 的方法3，16，17 Golden gat

8、e 方法的核心是應用IIs 型DNA 內切酶在識別位點以外對DNA 進行切割，從而達到將多個DNA 片段連接起來的目的( Fig 3),Fig 3 DNA shuffling strategy by using type IIs restriction enzymes Bsa,Two DNA ends terminated by the same 4 nucleotides ( sequence f，composed of nucleotides 1234) flanked by a Bsa recognition sequence，B，form two complementary DNA o

9、verhangs after digestion with Bsa 18,我們實驗室經過反復嘗試，并結合已經報道的方法，總結了一套可以特異結合靶位點、實現基因組定點修飾、比較簡單實用的TALENs 的構建方案( Fig 4),Fig 4 Construction of designed TALENs,The main steps to construct a designed TALEN were present The steps surrounded by broken lines are Golden gate cloning strategy,基因組編輯技術在模式動物中的應用,基因組編

10、輯技術作為靶向修飾方式已經成功應用到生物學研究的模式動物中，包括斑馬魚，大鼠，小鼠，果蠅，秀麗線蟲和多種其他物種，包括蝴蝶，青蛙和牛。TALSNs 也已被應用于研究比較相關物種的基因功能。這一應用為研究較近物種的相似性和不同點，以及可能的同源性基因對的分析提供了巨大便利 研究者通過微注射TALENs mNA 和單鏈DNA寡鏈核苷酸或帶有延長( 800 bp) 同源臂的供體質粒至單細胞胚胎39-40，最終實現斑馬魚中loxP 染色體整合，為此模式動物的傳統基因激活提供了可能性。除了有價值的動物模型，TALENs 已經應用于改造植物表型，包括擬南芥和若干種類玉米，最終將像耐病和耐旱特性整合入植物4

11、1-43。這些基因組編輯技術修飾的生物將毫無疑問的生長，進一步擴大基礎研究和基因組生物學的內容,江蘇省醫藥動物實驗基地轉基因中心基于TALENS和鋅酯酶ZNF技術建立了快速體細胞基因重組和小鼠敲除技術，可在3個月內獲得基因敲出小鼠或是體細胞重組克隆,基因組編輯技術轉染至細胞的方法,雖然基因組編輯技術可以實現靶位點的基因突變，但是這項技術仍然受到將這些酶有效轉染進入相關細胞的限制。例如，核酸酶編碼基因可通過質粒DNA，病毒載體或體外轉錄的mNA 形式進入相關細胞。這些轉染方法可以根據細胞類型或應用性進行修改。但是，病毒和非病毒基因的基因轉染系統限制基因組編輯技術的可能應用。尤其是，質粒DNA 或

12、mNA 的電轉染或脂質體轉染對于某些細胞是有毒性且限制性。病毒載體也具有一定的限制性，因為它們是復雜的，產量低，潛在的免疫原性和調節阻礙。盡管有以上缺點，基于腺病毒介導ZFNs基因轉染至T 細胞的臨床實驗正在開展，但是未來,科研工作者將努力改善轉染方法。 整合酶缺陷慢病毒是一種將鋅指核酶轉染至難轉染細胞類型的有效替代方式。但是，這一方法似乎不適用于高度重復性TALENs 序列44。盡管與ZFNs 相比，TALENs 的合成較簡單，但是其較難轉染至細胞。腺病毒載體的轉染是ZFNs 的有效轉染方式，并可以增加ZFNs 介導HD 效率和增強體內ZFNs 介導的基因校正45-47。腺相關病毒有效包裝只

13、適用于長度小于4 2 kb 的片段。雖然這只適用于ZFNs 單體和編輯供體結構，但是單一帶有小啟動子的TALENs 單體可以插入這一載體。,中科院，港中大PNAS基因編輯研究新成果一種快速組裝基因編輯分子TALEN的方法校轉基因中心對外提供鋅酯酶和TALENS基因敲除服務,基因組編輯技術的進步,為了使核酸酶可以應用到基因分析和臨床應用方面，科研工作者需要證明此核酸酶可以嚴格結合至DNA 靶位點。但是，因為復雜的基因組往往含有與靶位點相似或高度同源序列，從而導致脫靶活性和細胞毒性。為解決這一問題，基于結構和選擇的方法被用來改善TALENs 異二聚體結合，同時具有良好的剪切特異性和較小毒性48-5

14、1。目前，人們已經成功改進了FokI 切割結構域即Sharkey，與以往的ZFNs 比較，切割活性高15 倍。,其他基因組編輯技術-轉座酶、重組酶和轉錄因子,近年來，人們對基因組編輯技術認識不斷加深，應用日漸擴展，已經應用于細胞和生物體的基因修飾。但是，靶向核酸酶的若干限制性( 如，基因組編輯技術的脫靶效應對于細胞的毒性的預測和檢測的復雜) 正在促進基因組編輯技術的程序酶的替代研究發展。此外，因為靶向核酸酶依賴NHEJ 和HD誘導基因突變，在特殊的細胞類型中可能限制了DNA 修復機制的實現。為解決這一問題，鋅指蛋白和TALEs 與酶切結構域結合，其中包括位點特異性重組酶，轉座酶,從而催化DNA

15、 整合、缺失和插入。因為這些酶自動實現DNA 切割和再連接，所以潛在的有毒性DNA 的雙鏈斷裂不會在基因組中聚集。此外，在應用方面，人們往往希望可以靶向插入基因，重組酶和轉座酶活性是以供體DNA 插入至基因組為標志，因此脫靶效應可以直接檢測。再者，轉座酶和重組酶的機制不依賴細胞DNA 修復途徑。因此，這些方法幾乎適用于所有細胞和細胞生長階段。這些過程的有效性也可以直接進化改善，但是，重組酶和轉座酶若要具有基因組編輯技術的功能，它們需要改善其靈活性和效率，尤其，在重組酶催化結構域保持其識別序列特異性，從而保證與靶位點特異結合，減少細胞毒性方面; 同樣，雖然轉座酶融合證明在其靶位點具有高活性，這些

16、合成蛋白也有顯著的脫靶危險。,基因組編輯技術的臨床應用,基因組編輯技術在疾病治療中的應用代表基因治療的巨大進步。與傳統治療不同，ZFNs 和TALENs可以通過精確的基因修飾，徹底治愈疾病的病因。目前，ZFN-誘導的同源定向修復已應用于X 連鎖嚴重聯合免疫缺陷癥，B 型血友病，鐮刀細胞病和1-抗胰蛋白酶缺乏的基因缺陷校正。在體外實驗中，ZFNs可以糾正帕金森病患者iPS 細胞SNCA 基因突變。經ZFN-誘導NHEJ 介導修復是攻克HIV/AIDs 的重要策略。ZNFs 可通過破壞原代T 細胞和造血干細胞/祖細胞的CC5 基因實現HIV-1 的抗性HIV 并已經進入臨床實驗階段( NCT012

17、52641，NCT00842634 和NCT01044654) 。基因組編輯技術可以安全地插入治療性轉基因至人類基因組的特異性安全位點。雖然基因組編輯技術的應用限制在體細胞，但是在包括誘導多能干細胞( inducible pluripotent stem cells，iPSCs) 的干細胞研究中也取得了一定進展。這終將為包括自體干細胞移植的基因治療奠定重要基礎.,TALENs是近年來發展迅速的編輯基因,TALENs作為一種全新的基因組編輯工具，近年來引起了人們的極大興趣。與ZFN相比，它更便宜，更高效，脫靶率低。利用這種技術，研究人員已經開發出多種疾病的動物模型，有助于疾病的分子機制研究。 在

18、研發TALENs技術過程中，科研人員發現來自植物病原菌Xanthomonas中的TAL蛋白核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有較恒定的對應關系。利用此恒定對應關系，構建與核酸內切酶的融合蛋白，在特異位點打斷目標基因組DNA序列，從而可在該位點進行DNA編輯修飾操作，比如knock-out、knock-in、堿基替換、點突變或者基因修飾等。該技術能識別任意目標基因序列，不受上下游序列影響等問題，因此使得基因操作更加簡單方便。,科學家首次用TALENs技術編輯線粒體基因,邁阿密大學米勒醫學院的研究人員利用TAlENs技術首次清除線粒體內的突變DNA，以使得突變的線粒體DNA下降了，這項研究

19、有望用于治療母系遺傳的線粒體病。研究成果發表在Nature Medicine上 線粒體病通常是由突變的線粒體DNA（mtDNA）引起的，在大部分情況下它與野生型mtDNA共同存在，導致mtDNA異質性。常見的線粒體病包括線粒體肌病、線粒體腦病和線粒體腦肌病，如Leber遺傳性視神經病（LHON）。這種疾病的主要癥狀為視神經退行性病變，在男性中較多見。,TALENs清除突變的線粒體基因,在這項研究中，邁阿密大學米勒醫學院的研究人員探索了轉錄激活因子樣（TAL）效應物，同時在尋找修復線粒體基因缺陷的新策略。他們嘗試了TAL效應物核酸酶（TALENs）這種基因編輯的新方法。 研究人員在實驗室中使用細

20、胞來設計線粒體靶向的TALENs（mitoTALENs），來結合并切割線粒體DNA，正是這段基因中的一個突變引起了LHON。他們隨后檢測了mitoTALENs是否清除了mtDNA。分析結果表明，細胞中總的mtDNA暫時下降，這是由于突變mtDNA的下降。 文章的通訊作者，神經和細胞生物學教授Carlos T. Moraes博士表示：“一旦mitoTALENs與特定靶點的DNA結合并切割，突變的mtDNA就被降解。總的mtDNA的下降刺激細胞通過復制未受影響的分子來增加其mtDNA。兩周之后，mtDNA水平恢復正常。但由于突變的mtDNA被破壞，細胞中大部分為正常的mtDNA。” Moraes博

21、士提到，清除細胞中的大部分但并非全部突變mtDNA已足以治療多種線粒體病，因為只有當突變mtDNA占了80%以上時，它才會引起疾病的癥狀。研究人員計劃下一步在動物中檢驗這種方法。,2 0 12年，來自明尼蘇達州羅切斯特梅奧醫學中心的分子生物學家斯蒂芬艾克爾領導的研究人員，第一次利用T A L E N s 切割斑馬魚一段基因序列中的部分DNA，并用合成D N A 取代它們。斑馬魚是脊椎動物生物學和人類疾病研究的一個重要的參與者。其胚胎透明、體外受精、短繁殖周期和快速生長等特點，意味著可對活體動物開展緊密的胚胎發育研究，可作為研究基因行為和功能的一種有用模型。在遺傳組成上，斑馬魚與人類擁有幾乎90%的相同性，因此研究它們的發育能夠有助于認識人類疾病。在早期的胚胎發育階段，這尤其如此。這項研究發表在2012年9月23日出版的英國自然雜志上。,轉錄激活因子樣效應物核酸酶主要構建能特異性識別DNA序列的核酸內切酶。該酶由兩部分組成： DNA結合區域和核酸酶催化區域。激活因子樣效應物主要是識別靶基因的特定DNA序列，核酸