1、化學物相互作用 兩種或以上化學物同時或先后作用于生物體，并相互影響其毒性作用，稱相互作用。 相互作用大致分為聯合作用和其它作用： I 聯合作用 (a) 簡單加和作用 (additivity) 化學結構/性質近似的化合物或作用于同一器官系統或作用機理相似的化合物)； (b) 協同作用 (synergism) 毒性增加/增強； (c) 增強作用 (potentiation) 本身無毒性，與其它化學物同時給予則導致毒性增強；,(d) 獨立作用 (independent joint，沒有相互作用)； (e) 拮抗作用 (antagonism，致使毒性效應降低)。 拮抗作用進一步劃分為： (a) 功能拮

2、抗 (functional antagonism) 作用于同一生理機能，但作用相反，結果使生理功能仍能維持)； (b) 化學拮抗 (chemical antagonism) 化學物反應導致毒性下降； (c) 轉運/配置拮抗 (dispositional antagonism) 干擾或改變另一化學物的吸收、代謝、分布和排泄，是靶標濃度降低或排泄增加使得毒性降低； (d) 受體拮抗 (receptor antagonism) 與同一受體結合，毒性低于各自結合的毒性。,II 其它作用 (a) 競爭效應 (competitive) 導致污染進入數量和幾率降低或競爭結合點位； (b) 保護效應 (pro

3、tective) 掩蓋/掩蔽作用，改變毒性和生態系統組分接觸行為； (c) 抑制效應 (inhibitory) 作用導致生物活性下降，難以進入系統產生危害。 毒能 (potency) 外源物誘發機體強烈生物效應的能力，即產生毒性效應的劑量范圍。,毒效 (efficacy) 外源物在理想條件下可以達到的對生物體的最大影響，即：劑量響應曲線中生物體“響應”的上限。毒能與毒效主要用于比較化學物對生物體影響的能力和特點。 最大可接受毒性濃度 (maximum acceptable toxic concentration, MATC) 指無觀察效應濃度與最低觀察效應濃度的幾何平均值。是對低于致死劑量(慢

4、性)生物法的一種度量。 無觀察效應濃度 (no observed effect concentration/level, NOEC/NOEL) 指響應與對照控制組沒有顯著差別所對應的化學品最高濃度。,基本概念,注意：因檢測結果的變異性較大，因此NOEC不宜用作無效應濃度(NEC)的估值；而EC50和其它點估計值則相對NOEC更加一致，更為可靠，可用以比較不同檢測的結果。 最低觀察效應濃度 (lowest observed effect concentration or level, LOEC or LOEL) 指響應與對照控制組有明顯差別所對應的化學品最低濃度。 百分抑制濃度 (percent

5、age inhibition concentration, ICp) 表述分級的低于致死劑量的結果。例如：造成孵化率或生長率30%抑制作用，可表述為IC30。 急慢性比率 (acutechronic ratio, ACR) 代表一種在缺少更多合適數據條件下估算慢性毒性的粗略方法：ACR = 急性LC50/MATC,基本概念,急性毒性 指機體一次或在24小時內多次接觸外來化合物之后引發的中毒效應，表現在不同水平上的損害甚至死亡。 基于急性毒性設計的試驗方法稱為急性毒性試驗，是毒性試驗的第一步。 目的主要有： 確定對實驗動物的LD50或LC50有效劑量，以及某種效應的急性閾劑量； 闡明急性毒性的劑

6、量響應關系和特征； 機體內生物轉運和生物轉化的動力學變化； 為進一步的亞急性、慢性和特殊毒性試驗提供依據。,化學物急性作用帶(acute effect zone, Zac) 常用的以補充LD50不足的參數。一般指毒性上限與下限的比值，即死亡劑量與最低毒作用劑量之間的劑量范圍。 其大小反映急性閾劑量(Limac)距離LD50的寬窄，愈大表明引起急性死亡的危險性愈小。 Zac = LD50/Limac 目前有人主張使用： Zac = LD84/LD16 因兩者之間正好是致死劑量響應曲線的直線部分，也是LD5016數值，或者用劑量死亡曲線的概率單位的斜率表示。,亞急性毒性作用 實驗動物連續多日接觸較

7、大劑量的外來化合物所出現的中毒效應。較大劑量指小于急性LD50的劑量。 主要用于探討亞急性毒性的閾劑量和亞急性未觀察到毒效應的劑量水平(NOEL)，為慢性試驗提供接觸劑量和觀察指標。 亞急性效應評價取決于兩個重要因素： 生理和行為參數的選擇，用于預測生態顯著性響應； 亞致死響應的實驗測定。 亞致死效應 指因攝食干擾、非正常生長或行為、更大的易被捕食性、更低的拓殖能力、或其它間接原因而被破壞的生理或行為活動，但尚未造成即時的死亡，盡管死亡可能會在以后發生。,亞致死效應不僅會導致各自物種種群的改變，而且會導致物種組成和多樣性的變化。 亞致死效應特點： (1) 通過在某一組織或發育水平上施加污染物壓

8、迫而引發； (2) 通過在發育的后期階段結構或功能發生改變而加以辨識； (3) 在發育的深入階段較低的存活潛力充分表明其顯著性。,亞急性毒性研究中的參數,亞致死響應根據對有機體的效應可劃分為不同類型 (1) 生理的； (2) 生化/細胞結構； (3) 行為； (4) 生殖。 毒性檢測方法 (1) 可以利用現場/野外實驗和調查； (2) 也可以利用模型生態系統測試或實驗室生物方法進行。 實驗室中的實驗條件可以控制，受試物種的響應在很大程度上可以觀察或監測。,受試物種的響應可大致分為： (1) 急性效應(acute effect) 有機體響應嚴重，足以造成通常在96小時以內的快速響應，通常用96h

9、 LC50； (2) 亞急性效應(sub-acute effect) 有機體響應嚴重程度低于類型(1)，而且時間相對較長； (3) 慢性效應(chronic effect) 對某一連續條件，有機體響應至少保持其生命周期的10%。,基本概念,慢性毒性 (chronic toxicity) 指以低劑量外來化合物長期暴露，觀察其對實驗動物產生的毒性效應。用以確定外來化合物的毒性下限，即長期接觸引起機體危害的閾劑量和無作用劑量，為危險性評價和制定接觸的安全限量標準提供毒理學依據。 慢性毒性作用帶(chronic toxicity zone, Zch) 指急性毒性閾濃度(劑量)與慢性毒性閾濃度(劑量)的

10、比值，是評價慢性中毒危險性的指標。 Zch = Limac/Limch 慢性毒作用帶愈寬，表明該物質引起慢性中毒的潛在危險性愈大。,特殊毒性試驗如聯合毒性測量，常包括： (1) 獨立作用(independent) 相互不干擾； (2) 相加作用(additive) 毒效應強度表現為簡單加和關系； (3) 協同作用(synergistic)或增強作用(potentiation) 毒效應大于各自毒效應之和； (4) 拮抗作用(antagonistic) 干擾、削弱毒效應，低于各自單獨作用時的毒效應。 行為生態毒理(behavioral ecotoxicology) 機體接觸外來化合物后，形成內源性

11、刺激或損傷所引起的機體各系統、尤其是神經系統，反應總和的最終表達。主要采用神經生理學和心理學調查方法，以及神經生物化學方法。,行為有毒物的分類方案,行為效應的相對風險水平： 最小， 低， 中， 高,累計百分死亡率(mortality)，百分死亡頻率(frequency)及劑量關系,毒性調查基礎是化學品暴露/接觸與毒性關系,高斯曲線(鐘形)反映正態分布的種群響應。 體現更敏感個體的早期死亡和最耐受有機體的存活延長,LC50 代表種群的平均響應,10,累計百分死亡率(粗實線),50,百分死亡頻率(粗虛線),10,劑量 (化學濃度對數比例),正態分布,均值標準偏差,種群包含比例%,均值1x標準偏差,

12、68.3,均值2x標準偏差,95.5,均值3x標準偏差,99.7,劑量反應曲線關系,無論劑量反應曲線的類型如何，總體趨勢通常表現為劑量增加，反應率越高，呈現漸升曲線。只有當毒性作用表現為抑制性的量反應時，劑量增加，觀察值降低，呈現漸降曲線。當試驗結果表現為上述情形時，稱為存在劑量反應關系。確定關系的可靠方法之一是進行趨勢分析。,正規/正態等價偏差 NED,正規偏差值/概率單位PROBIT,劑量 (對數比例),0,1,2,1,2,3,4,5,6,7,10,2.3,15.9,50.0,84.3,97.8,百分響應(概率比例) Probability,附注：NED指Normal Equivalent

13、 Deviation (數值上等價于標準偏差),對數劑量概率響應關系建立正規偏差值,劑量概念： 有時指暴露媒介中對化學物濃度和總暴露時間的確定。實際上，這兩個參數提供對暴露/接觸(exposure，與現場情況具有很大相關性)的一種量度，而非劑量。 劑量響應/反應關系 基于室內實驗的生物描述方法，實際上，經常測定的是暴露響應/反應關系。,NED單位加5以避免負值,局量子(quantal)的劑量響應現象通常是正態分布 百分比響應可轉化為均值偏差單位或正規/正態等價偏差(NED),毒性百分率與概率單位換算表,具有相同LC50不同斜率函數的化合物A和B的劑量響應,死亡率 %,50,暴露濃度 (ug/L

14、),A,B,10,正規偏差值/概率單位,經正規偏差值/概率單位變換的響應曲線 計算斜率可提供有關毒性行為的附加信息,較陡的斜率意味著化學物A較高的吸收速率，以及在相對較窄的濃度范圍內響應快速增加,平緩的斜率意味著化學物B較慢的吸收速率，或可能是較高的排泄或去毒作用,5,毒性響應曲線,死亡,不可逆傷害,可逆傷害,自穩狀態,(a),(b),C1,C2,C3,C4,安全臨界值,常態,傷害增強,毒性響應,恒定暴露時間內的毒物濃度,曲線(a)： 低濃度下表現為生命必需物質效應。,曲線(b)： 表現為生命非必需物質的效應。,基本和非基本元素濃度與性能(生長,繁殖,存活)關系,缺乏,適宜,毒害,濃度Ce,性

15、能,基本需要窗口,基本元素,無效應,毒害,濃度Cne,性能,基本需要窗口,非基本元素,d,d：當分析技術靈敏度提高時，也許會觀察到 非基本元素在超痕量水平上可能出現的缺乏 效應。,假設的劑量響應關系曲線,劑量,響應,a,b,c,臨界型,準臨界型,累積型,線性,飽和,臨界型和準臨界型曲線來源于 一個逐漸飽和的解毒作用體系； 或者一種誘導的活化途徑； 或者不同的修復過程。 當曲線呈現外凸形狀時 觀察到的劑量效應關系如果向下(低劑量)外推，常為線性，但這可能是錯誤的結果； 而反向倒推則可能在高劑量水平時從劑量效應曲線獲得飽和效應； 在這種情形下，低劑量階段曲線具有較陡的斜率，高劑量水平時則趨于平緩。

16、 飽和曲線可能反映幾種機理 一種誘導解毒作用途徑； 一種逐漸飽和的活化途徑； 不同的修復過程。,污染物濃度與機體響應的假定關系,線性響應,非線性響應,響應,刺激(劑量),非檢測響應 (不確定區域),測定亞致死響應,致死,測定亞致死響應臨界值,初始致死臨界值,50%測試機體致死濃度或劑量,0.0010.1 LC50/LD50,(LC50/LD50),暴露時間(小時),同一劑量(急性)響應數據的不同表達方式,指示LC50如何在較長的暴露時間條件下逐漸變得較低，不過隨著測試時間的延長，LC50降低強化的趨勢被削弱。,有毒物濃度增加,50,死亡率%,5 ug/L,10 ug/L,20 ug/L,50

17、ug/L,100 ug/L,死亡率%,暴露濃度(ug/L),50,暴露時間增加,8h,24h,48h,96h,120h,數據變換方法： (i) 正規偏差(Probit)/概率單位變換； (ii) Logistic函數(角弧度反正弦變換 結合滑動平均內插)； (iii) 改進的非參數SpearmanKarber方法。,暴露時間與半致死濃度毒性曲線,暴露時間 (分鐘),導致50%水生生物死亡率濃度 (mg/L),臨界/初始LC50 (低于此濃度則短期內無致死性),24h LC50,趨向于時間坐標的漸近線,臨界/初始LC50經常用于建立暴露在有毒物 慢性毒性水平下，自然生物種群的風險基準,有毒化學物

18、濃度與暴露時間的關系,50,20,100,10,1,2,5,10,濃度 (mg/L, ppm),時間 (小時),毒性劑量由暴露時間和濃度乘積(矩形面積)近似表示； 具有不同邊界的矩形假定具有相同的毒性程度。,中位致死時間與劑量關系：初始LC50出處,初始的LC50,有毒物濃度,中位致死時間 (LT50),存在某一點致使更長暴露時間 不會進一步造成LC50任何改變,漸近線,繪制方法過程： 在一固定的暴露濃度，繪制一系列經選定的生存時間與相應的存活百分數關系圖； 然后對其它暴露濃度繪制類似關系圖，以獲得中位存活時段 (中位響應時段LT50，LT50可用于指示急性毒性作用時間過程，但不能用于比較急性

19、毒性高低)； 進一步繪制中位暴露時間與化學物濃度關系圖。,LC50/LD50的確定,X時段后的死亡率,化學物濃度,X時段的LC50,Y時段后的死亡率,化學物濃度,Y時段的LC50,X,Y,暴露時段,中位致死濃度 (LC50),確定步驟： (a) 在固定的暴露時段，繪制暴露濃度與致死百分數的關系圖； (b) 依此類推，可獲得每一暴露時段的中位致死濃度； (c) 進一步繪制中位致死濃度與暴露時段的關系； (d) 最后，可推斷特定時段的LC50值。,LC50/LD50的確定,LD50(LC50) 是一個統計量。受多種因素影響，如物種、品系、性別、年齡、濃度及稀釋溶液性質等，因此，必需注意條件的同一性

20、。 根據死亡率劑量響應數據分布的要求， (a) 要求數據正態分布 (b) 不要求數據正態分布 其計算方法大體分為兩類：,(I) 正態分布法 方法基于當劑量以對數表示、響應以頻率表示時，相應地，對數劑量響應頻率呈正態分布； 當頻率轉化為累積頻率時，則響應呈“S”型曲線； 響應頻率達50%時，概率單位為5。 1. 回歸法 較為準確，不要求每個劑量組的物種數相等。 包括簡單回歸和加權回歸； 2. 改進的寇氏法 要求最小劑量反應率小于0.2，而最大劑量反應率大于0.8； 要求每個劑量組的組間距呈等比或劑量對數呈等差關系，各劑量組物種數相同，中間劑量接近LD50。,3. 概率單位法(probit met

21、hod) 轉換步驟包括：濃度對數化、概率單位換算、回歸直線方程、縱軸概率單位為5作平行線向對數濃度橫軸投影求值、卡方檢驗、計算標準誤差和置信度。 4. 圖解法 原理同概率單位法，用圖解方法代替計算。 (II) 非正態分布法 1. Horn法 也稱平均移動內插法(interpolation)或者劑量遞增法。 推薦使用四個劑量組，每組動物數目相等； 或提出兩種劑量系列，組距不同。 其它相似的方法如：直線(straight line)內插法,2. 平均數法 又稱階梯法或稱“上下”法。按序貫設計，不預先將試驗物種分組，而是先以某一劑量試驗： 若死亡，則用一較少劑量試驗，若仍死亡，繼續減量試驗； 若出現

22、存活，則再以較大的一個劑量試驗，逐步試驗進行逼進。 平均數方法只適用于快速發生中毒反應及死亡的化學物，凡遲發性死亡的化學物均不適用。 3. Weils表移動法 基于遞增劑量法計算，查Weils表找出有關參數。,計算LD50的兩類常用方法,此外，能夠計算LDp的曲線擬合方法包括：極大似然法、加權最小二乘法、計算器擬合法、加權近似法、簡化概率法，后兩種方法僅適用于概率單位變換。,LC50(EC50)的優點及缺陷,由于不同試驗物種品系、外源化合物、機體接觸方式和途徑等均可影響外源化合物的LC50，因此，必需注明試驗的物種種類和接觸途徑及性別等。 優點 在常用的毒性參數中，以LC50最為敏感和穩定，是

23、毒性測試中最廣泛采用的指標； 數值愈大毒性愈小，反之則愈大； 與其它常用的毒性參數相比，LC50是根據試驗數據，經數理統計獲得，具有較高的精確性和較小的抽樣誤差，并可計算出一定概率的置信區間。 主要缺陷 在于僅關注曲線上統計結果更加穩健的中部，置信區間對比平均值相對較窄；,曲線兩端潛在的有用信息易丟失，尤其是在低值一端，因為令人感興趣的是化學物引發毒性的最低濃度，即所謂門限/閾值濃度(threshold)； LC50可用于比較毒物之間的毒性大小，但不能直接指示安全劑量。,正規偏差值 Probit,濃度,5,外推的LC0,96 h,72 h,48 h,24 h,0,A,1/T,利用不同時間上劑量

24、響應數據得到的回歸方程來確定LC0 ( LC0.01),USEPA利用三維方法(劑量響應時間)推導無效應濃度(NEC) NEC的操作定義為：從正規/正態偏差曲線上t 處的LC0.01。 包括兩步分離的回歸過程： (1) 首先確定各時間間隔的LC0(圖A)； (2) 然后繪制LC0數據與時間倒數的關系，并外推至假設的極限暴露時間(圖B)。,繪制LC0 對1/T圖形，以確定LC0 在t 處,B,截距 (a) LC0,LC0 濃度,0.01,0.02,0.03,利用回歸技術由急性毒性生物法外推時間、濃度、死亡率以估計長期效應,低劑量外推模式示意圖,0,可觀察范圍,外推劑量范圍,劑量,反應,出現多種可

25、能情況，存在不確定性,注意點： 不同的外推模式也許能很好地適于所觀察到的資料，但在低劑量時，可能導致風險，結果會存在很大差異。 在缺少充分資料進行對比時，推薦使用線性多階段模式(LMS)，一般認為此模式得出的風險的合理上限與一些癌癥形成機理一致。,用于外推低劑量的數學模型,外推低劑量的數學模型,威布爾模型 假設效應發生的點概率是劑量對數的函數并呈威布爾分布。 其中，P(d)為某暴露劑量(d)下，預期效應的發生概率；d為暴露劑量；和m為曲線擬合參數，均大于0。 分別為1，1和1時，低劑量下的劑量響應關系曲線分別為線形，次線形和超線形。 適用于在實驗劑量范圍內的劑量反應關系，曲線特征為低、中劑量階

26、段為線形，高劑量階段為向下彎曲形。,一次打擊模型 假定靶細胞在一定時間內受到一次生物學有效劑量單位打擊后，即可引發腫瘤，而腫瘤發生數目與總劑量有關而與暴露類型無關。 低劑量下劑量響應關系曲線呈線形，該模型估計的危險度最高，即最為保守。 多次打擊模型 是一次打擊模型的擴展。假設靶細胞須經至少k 1次打擊后才可誘發一次反應。 u為預測的打擊次數。k = 1，1，1時分別為線形，超線形和次線形。 其適用的實驗劑量范圍內的劑量響應關系曲線特征同威布爾模型。,與多階段模型相比，應用關系曲線上低劑量階段呈線形、高劑量階段呈向上彎曲形的數據時有局限性。 多階段模型 假設癌癥發生是多個不同隨機過程發生的生物學

27、過程的結果。 當i 0，= 0時，關系曲線分別為線形和亞線形(高劑量段為向上彎曲)。 腫瘤出現時間模型 劑量所導致的某種遲發效應的點頻率，作為出現效應所需時間的對數函數，其分布成正態分布。 若發生細胞轉化的時間遵從ArmitageDoll多階段模型，則腫瘤出現的時間概率如公式所示。 w表示腫瘤形成潛伏期。適用于估計如暴露只占生命周期一段時間等情況下的致癌危險度。,生理藥代謝動力學模型 屬于機理性模型。通過綜合分析影響化學物在體內轉運和轉化的因素，預測化學物在靶組織或器官的生物有效劑量。 包括分配系數、生理常數和生化常數三類參數。,劑量響應的數學模型,統計考慮,統計的作用 假設檢驗過程 確定兩個

28、帶有某些預制置信水平的種群的差異； 自然界中的預測作用 一個或多個自變量對一個或多個因變量的影響。 調整百分響應 調整百分響應 (檢測組百分響應控制組百分響應)/(100控制組百分響應)x100 數據分布檢驗和分析方法 (1) 通常，低于致死劑量(慢性毒性)的數據是： 非正態分布：可由協方差或SharpiroWilks檢驗確定； 或非均質的：可由Bartlett檢驗。,在這種條件下，需要用非參數(non-parametric approach)過程，如： Steel多重秩比較檢驗：適于相等大小的重復情形； 或Wilcoxon秩和檢驗：適于不等大小重復情形。 (2) 正態分布的數據 可以用Dun

29、nett檢驗進行分析。 某些情況下，非正態分布的數據可以用具有減少數據點差異作用的數學方法變換為正態分布，如反正弦變換。 (3) 常用的數理統計軟件：SAS(Statistical analysis software)，SPSS(Statistical program for social sciences)，Statistica等。,(A) 時間響應(死亡時間)模型(Time-Response, TimetoDeath Models) 當前，逐漸興起的替代劑量響應方法的是時間響應或死亡時間模型。 死亡率測試遵循一個時段，典型地，它延伸超出急性生物法的持續時間，有些類似于前述的圖示方法，不同的

30、是其時間尺度囊括生物體絕大部分或全部的生命周期。 另外，有關數據可構成種群結構的人口統計學模型(Demographic Model)、生存分析(Survival Analysis)和失敗/故障分析(Failure Analysis)的基礎。,時間響應(死亡時間)模型,反應時間毒性資料的劑量響應模型,累積死亡分布函數F(t)， 在t = 0處，F(t) = 0； 在100死亡率處，F(t) = 1。 反之，生存函數S(t)：S(t) 1 F(t)； 危害函數h(t)： 描述在時間t百分比生存概率，數學上與生存函數相關： h(t) = dlogS(t)/dt = 1/S(t) dS(t)/dt 危害函數用于： 確定毒性是否隨時間穩定， 或是否隨暴露繼續而加速或減速。,(B) 通用線性模型(General Linear Models, GLM) 由于“S”形耐受分布曲線(累計百分死亡率)對于某些生物，尤其是微生物毒性檢測不適用，因其響應典型地表現為一連續變量，因而更適合使用GL